CN103275950B - 一种扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法，通过将发酵种子液接种于培养基（原料含有蛋白胨0.05-0.4wt.%、果糖0.25-2wt.%、K⁺0.005-0.04mol/L、V_C0.005-0.02wt.%、乳化橄榄油5wt.%，培养基初始pH值为7.6-8.2），250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量20%，于25℃，转速120r/min下培养。本发明的发酵方法发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于座壳孢菌发酵生产脂肪酶的培养基，具有脂肪酶产率高，脂肪酶活力高等优点。

Description

一种扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法

技术领域

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺，具体涉及一种扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的培养基及方法。 

背景技术

座壳孢隶属于子囊菌门、粪菌纲、肉座菌目、麦角菌科，其重要成员扁座壳孢菌(Aschersonia placenta)是重要的昆虫病原真菌之一。扁座壳孢菌能侵染粉虱及介壳虫类而控制害虫虫口数量，因此视为重要的生防因子。 

脂肪酶可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸脂肪酶是一类分解和合成脂肪的酶。脂肪酶不仅可以催化酯水解反应还可以催化酯合成反应和转酯反应。微生物脂肪酶在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景。但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、酶的来源不足、提纯困难和应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用较慢，因此研究座壳孢菌脂肪酶具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的培养基，具有脂肪酶产率高，脂肪酶活力高等优点。 

本发明的目的之二在于提供一种扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的方法，发酵周期短；条件温和，易于控制。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一种扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的培养基的原料含有蛋白胨0.05-0.4 wt.%、果糖0.25-2 wt.%、K⁺ 0.005-0.04 mol/L、V_C 0.005-0.02 wt.%、乳化橄榄油5 wt.%，培养基初始pH值为7.6-8.2。

一种扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的方法包括以下步骤： 

（a）将扁座壳孢菌（邱君志等，Optimization of the medium composition of a biphasic production system for mycelial growth and spore production of Aschersonia placenta using response surface methodology. Journal of Invertebrate Pathology, 2013, 112(2): 108-115）接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液接种于扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的培养基，250 mL的三角瓶装液量为50 mL，接种量20%，于25℃，转速120 r/min下培养。

所述的种子培养基的原料含有：200 g土豆熬汁，加20 g葡萄糖，稀释至1000 ml。 

采用本发明优化后的培养基，菌龄7 d，发酵周期4 d，扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶为37 U/mL左右。 

本发明的显著优点在于：本发明的发酵方法发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于座壳孢菌发酵生产脂肪酶的培养基，具有脂肪酶产率高，脂肪酶活力高等优点。 

附图说明

图1为对硝基苯酚标准曲线。 

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。 

实施例1 

单因素实验确定培养基最优成分

（1）种子培养基配制：去皮马铃薯200 g，熬汁过滤（八层纱布），加入葡萄糖20 g，再稀释至1000 ml，分装于250 mL的三角瓶中，每个三角瓶含100 mL。0.1 MPa，灭菌20 min。使用前可加入抗生素对培养基预处理。

（2）发酵种子的制作：将扁座壳孢菌接种于马铃薯琼脂培养基上，于25℃下培养5 d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，25℃，转速120 r/min下培养48 h，即为发酵液。 

（3）酶液的制备：取步骤（2）下的发酵液在4℃下，8000 r/min离心10 min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长410 nm处测定吸光值。换算成酶活单位U/mL。 

（4）脂肪酶酶活测定：在pH 8.0、50 ℃条件下，每1 min水解p-NPP释放1 μmol对硝基苯酚（p-nitrophenol）所需的酶量为1个脂肪酶活力单位（U）。 

方法：溶液A：150 mg p-NPP溶于50 mL异丙醇；溶液B：500 mL pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中加入2.22 g Triton X-100和0.56 g阿拉伯胶。取2个试管（分别是对照管和样品管），各加溶液B 2.85 mL和底物溶液A 0.1 mL（缓慢混合，该溶液至少可稳定2 h）。50 ℃水浴中预热5 min，然后在对照管中加入已灭活的酶液0.05 mL，样品管中加入酶液0.05 mL，立即混匀计时。在水浴中准确反应10 min时马上测定410 nm下酶水解产生的p-nitrophenol的吸光度值（OD₄₁₀值）。酶活力（U/g或U/mL）=A×K×V×n/(t×m)（A为样品的吸光度；K为吸光常数；V为反应试剂的总体积；n为酶液的稀释倍数；t为反应时间；m为酶液质量或体积，g或mL）。 

（5）标准曲线的制作：精确配制p-nitrophenol 2mmol/L标准溶液；首先在试管中加入等体积的底物缓冲液以及不同体积的异丙醇， 在50℃保温5 min，再在加入不同体积的p-nitrophenol标准液。反应10 min后立即在波长410 nm处测定吸光度。反应体系为2.5 mL（p-nitrophenol和异丙醇0.25 mL，底物缓冲液为2.25 mL）。每个浓度做3平行实验，为空白对照。在波长410 nm处测定吸光值，以OD₄₁₀值为横坐标，p-nitrophenol含量为纵坐标绘制标准曲线。，经统计处理得到的线性回归方程，y=45.592x，R²=0.9940，结果见图1。 

标准曲线制作表格如下： 

（6）不同碳源、氮源、金属离子、维生素对产脂肪酶的影响

（a）碳源对酶产量的影响，在含有乳化橄榄油50.0 g/L，K₂ HPO₄ 1.0 g/L，CaCl₂ 0.1 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.0 g/L，的培养基中分别添加10.0 g/L蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、L-阿拉伯糖、海藻糖、D-山梨醇、甘露醇、α-乳糖、甲壳素、糊精、木糖醇、D-半乳糖、橄榄油、可溶性淀粉，以不加任何碳源为对照。0.1 MPa灭菌20 min（下同），接入相同的座壳孢菌菌液，在25℃、120 r/min的摇床中培养72 h/96 h检测酶活性，结果见表1。

（b）氮源对酶产量的影响，在含有乳化橄榄油50.0 g/L，K₂ HPO₄ 1.0 g/L，CaCl₂ 0.1 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L，，葡萄糖10.0 g/L的培养基中分别添加1.0 g/L的酵母浸粉、蛋白胨、甘氨酸、(NH₄)₂HPO₄、(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃、KNO₃、NaNO₃、尿素、胰蛋白胨、酸水解酪蛋白、过硫酸铵，以不加任何氮源为对照。0.1MPa灭菌20min，接入相同的座壳孢菌菌液，在25℃、120 r/min的摇床中培养72 h/96 h检测酶活性，结果见表2。 

（c）金属离子对产酶的影响，在含有乳化橄榄油50.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L的培养基分别添加0.02496 mol/L（以6（a）中含有的金属离子按其浓度换算得来）NaCl、MgCl₂·6H₂O、CaCl₂、MnCl₂·4H₂O、KCl、BaCl₂·2H₂O、ZnCl₂、CuCl₂·2H₂O、FeCl₂·4H₂O、FeCl₃·6H₂O、(NH₄)₂SO₄，以不加任何金属离子为对照。0.1 MPa灭菌20 min，接入相同的座壳孢菌菌液，在25℃、120 r/min的摇床中培养72 h/96 h检测酶活性，结果见表3。 

（d）维生素对酶产量的影响，在含有乳化橄榄油50.0 g/L，K₂ HPO₄ 1.0 g/L，CaCl₂ 0.1 g/L，NaCl 0.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1 g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L的培养基中分别添加0.01%硫胺素VB₁、核黄素VB₂、吡哆醇类VB₆、烟酸、叶酸、抗坏血酸V_C、VB₄、生育酚VE，以不加任何维生素为对照。0.1 MPa灭菌20 min，接入相同的座壳孢菌菌液，在25℃、120 r/min的摇床中培养72 h/96 h检测酶活性，结果见表4。 

表1 不同碳源对酶产量的影响 

表2 不同氮源对酶产量的影响

表3 不同金属离子对酶产量的影响

表4 不同维生素对酶产量的影响

从表中可以得出最佳的培养基成分为果糖，蛋白胨，K⁺，V_C，接下来的正交实验将以此作为发酵培养基成分。

实施例2 

正交实验确定最优发酵条件

（1）正交实验确定最佳培养基

从单因素实验确定的培养基的基础上，改变各成分的溶度，和pH值，配置

不同的培养基，方法同实施例1中步骤（1）、（2）。见表5，将相同量的接种量（10%）菌种接种于100 mL，装有30 mL培养液，在25℃，转速120 r/min下培养培养72 h/96 h。然后按实施例1步骤（3）、（4）测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。

表5 扁座壳孢菌脂肪酶五因子四水平（4⁵）正交实验设计 

表6 扁座壳孢菌脂肪酶五因子四水平（4⁵）正交实验设计实验结果

注:Ⅰ1 为各因素水平1的所有酶活力之和，Ⅱ2 为各因素水平2的所有酶活力之和，Ⅲ3为各因素水平3的所有酶活力之和，Ⅳ4为各因素水平4的所有酶活力之和，R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。

表7 培养基优化验证试验 

正交结果分析表明：最佳因素组合是A₄B₃C₂D₂E₁，即果糖 2%，蛋白胨 0.2%，K⁺ 0.02 mol/L，V_C 0.01%，pH7.6，且结果与验证试验相符合。正交实验结果表明较好水平包括果糖 2%，蛋白胨 0.2%，K⁺ 0.02 mol/L，V_C 0.04%，pH7.6，即A₄B₃C₂D₄E₁。表6变化因子的极差值R分别为碳源(98.21)、氮源114.07)、金属离子(48.69)、维生素(54.71)和pH(28.72)，表明碳源、氮源、金属离子、维生素和pH的变化与扁座壳孢菌产脂肪酶培养基相关，尤其是氮源的变化对该菌产酶的影响更大。相对而言，pH的改变对产酶的影响较小。

(2)正交实验确定最优培养条件 

在从正交实验确定的最优培养基的基础上，通过设定不同接种量，装液量，菌龄，培养时间，在25℃，转速120 r/min下培养，各组号的培养时间以表9为准。然后按实施例1步骤（3）、（4）测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号，进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。

表8扁座壳孢菌脂肪酶四因子三水平（3⁴）正交实验 

表9扁座壳孢菌酯酶四因子三水平（3⁴）正交实验设计实验结果

注: K1 为各因素水平1的所有酶活力之和，K2 为各因素水平2的所有酶活力之和，K3为各因素水平3的所有酶活力之和， R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。

表10 培养条件优化验证试验 

（正交结果最好的组合与最佳分析组合恰好是一组）

总结了4个因子(接种量、装液量、菌龄和培养时间)对扁座壳孢菌产脂肪酶产生的影响。表9中的R值表明菌龄(63.74)是一个比其他培养条件更重要的因子，其次是装液量（54.98)和培养时间（54.71），对扁座壳孢菌产脂肪酶影响最小的因子是接种量(44.04)。最优相应的实验条件应为A₃B₁C₃D₂(接种量20%，装液量50 mL/250 mL，菌龄7 d，培养时间4 d）。在培养该菌产的时候，要注意各因素之间的影响作用，以提高产酶效率。

实施例3 

真菌产脂肪酶发酵方法

（1）发酵种子的制备

（A）菌种和培养基

菌种：扁座壳孢菌

斜面培养基：PDA培养基

液体种子培养基：PDB培养基。

（B）种子液制备 

将斜面上的纯种扁座壳孢菌转接到多个250 mL三角瓶中，其中装有100 mL培养基，然后在25℃(温度较发酵培养同样是为了抑制染菌)，在往复式震荡摇床转速120 r/min下培养培养2 d，带菌丝生长健壮，菌液呈粘稠状时，说明种子已经生长好了。

此外接种前可在种子液中加入抗生素，杀灭或者抑制杂菌的生长，从而获得不带杂菌的纯种菌种。 

（2）发酵培养 

发酵培养基：按照培养基优化正交实验，即果糖2%，蛋白胨0.2%，K⁺ 0.02 mol/L（0.15%），V_C 0.01%，pH7.6，乳化橄榄油5%(w/v），配制。

将上一步骤中制备的扁座壳孢菌发酵种子液，接种量20%接种于250 mL三角瓶中，瓶中装有50 mL发酵培养液。 

摇床温度：25℃±1℃， 

发酵周期：72 h/96 h，

发酵产生结果扁座壳孢菌产脂肪酶为37 U/mL以上，该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。 

Claims (4)

1.一种扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的培养基，其特征在于：所述培养基的原料含有蛋白胨0.05-0.4 wt.%、果糖0.25-2 wt.%、K⁺ 0.005-0.04 mol/L、V_C 0.005-0.02 wt.%、乳化橄榄油5 wt.%，培养基初始pH值为7.6-8.2。

2. 根据权利要求1所述的扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的培养基，其特征在于：所述培养基的原料按重量分数计，含有蛋白胨0.2 %，果糖2%，KCl 0.15%，V_C 0.01%，乳化橄榄油5%，培养基初始pH值为7.6。

3. 一种扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（a）将扁座壳孢菌接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液接种于权利要求1或2所述的扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的培养基，250 mL的三角瓶装液量为50 mL，接种量20%，于25℃，转速120 r/min下培养。

4. 根据权利要求3所述的扁座壳孢菌发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于：所述的种子培养基的原料含有：200 g土豆熬汁，加20 g葡萄糖，稀释至1000 ml。