CN106318926B - 一种桔青霉发酵产核酸酶p1的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵酶制剂领域，具体涉及一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法。包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子制备：按1～2.5％接种量接入种子摇瓶培养基培养；(3)种子罐培养：按0.1～0.5％接种量接入种子罐培养24～28小时，转速50～150rpm，通风比1:0.5～1:1；(4)发酵罐生产：按3～8％接种量接入发酵罐培养100～200小时，转速100～200rpm，通风比1:0.5～1:1.2，其中发酵45～48小时后流加包含氮源、微量元素和碳源的培养基。该法得到核酸酶的酶活水平达3000～4100u/ml，解决了目前核酸酶生产水平低，成本高的问题，具有大规模工业化的价值。

Description

一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵酶制剂技术领域，具体涉及一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法。
背景技术
核酸酶P1(Nuclease P1)，又名5'-磷酸二酯酶，其作用为水解核酸中的3',5'-磷酸二酯键得到四种5'-核苷酸。核苷酸是生物体内重要的低分子化合物，具有许多生理功能。目前，随着在婴幼儿奶粉及保健品领域的广泛应用，核苷酸市场变的越来越大。其中，核酸酶P1在核苷酸工业化生产中起着至关重要的作用。
目前国内研究报道中，核酸酶P1主要通过液体深层发酵得到粗酶液，再由下游处理精制得到成品。液体深层发酵技术已经发展成为一种主流的生产方式，通常采用批次发酵和流加发酵工艺。
液体深层发酵技术的关键点在于培养基的优化与工艺控制优化。现有的大量文献报道了核酸酶P1发酵培养基的优化，其中梁新乐等人采用响应面优化方法得到一种培养基，使核酸酶发酵酶活达到1672.6u/ml；李科德以ATCC14994为出发菌株，采用化学和物理诱变育种，获得1株核酸酶高产菌株，并通过单因子和正交试验对该菌株的产酶发酵条件进行了优化。在优化条件下，该菌种的产酶水平达到1329u/ml。李兆飞等通过氯化锂和离子注入等诱变方式筛选得到一株高产菌种，发酵酶活可以达到1166u/ml，以上文献报道的发酵水平为目前较高发酵水平。工艺控制优化方面，已有报道采用小型发酵罐进行小试实验，通过溶氧、pH、搅拌等参数控制，将摇瓶发酵水平放大，但此类文献多集中于发酵过程机理的研究，梁剑光等通过发酵罐控制使发酵酶活达到400u/ml。现有规模发酵水平最高达到1180u/ml。此外，已有相关专利报道采用基因工程菌毕赤酵母表达发酵制备核酸酶P1。
上述现有技术的引证文件分别为：
梁新乐，黄莹莹，张虹，等.响应面法优化桔青霉F-5-5核酸酶P1发酵培养基碳氮源[J].核农学报，2011,25(1):0057～0061.
李科德，韩木兰，柏建玲，等.5'-磷酸二酯酶高产菌株的选育和发酵培养条件的优化[J].微生物学杂志，2001,21(3):28～30.
李兆飞，姚鹃，余华顺，等.氯化锂-离子束复合诱变核酸酶P1高产菌株研究.[J].食品科技，2013,38(12):8.
发明内容
本发明解决的技术问题是现有的采用桔青霉发酵生产核酸酶P1的方法存在生产成本高、核酸酶P1的酶活力低，因而产量低的缺陷。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法。
具体来说，本发明是通过下述技术方案解决技术问题的：
本发明提供了一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将桔青霉孢子接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；
(2)种子制备：将孢子悬液按照1％～2.5％重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中，置于28～29℃培养20～22小时，得到种子菌液；
(3)种子罐培养：按照0.1％～0.5％重量比的接种量，将种子菌液接入装有种子培养基的种子罐中，培养温度29～30℃，转速50～150rpm，通风比1:0.5～1:1，培养周期为24～28小时，得到种子培养液；
以及
(4)发酵罐生产：按照3％～8％重量比的接种量，将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度29～30℃，转速100～200rpm，通风比1:0.5～1:1.2，发酵周期为100～200小时；其中期间，发酵45～48小时后开始流加包含氮源、微量元素和碳源的培养基，直至发酵结束。
优选的，步骤(1)中，桔青霉孢子接入PDA培养基，置于28～29℃环境中培养2～3天。
优选的，步骤(4)中，所述氮源包括蛋白胨，所述微量元素包括硫酸锌。
优选的，所述蛋白胨的浓度为10～30％(w/v)，所述硫酸锌的浓度为0.1～2％(w/v)。
优选的，所述蛋白胨的浓度为10～25％(w/v)，所述硫酸锌的浓度为0.4～1.4％(w/v)。
优选的，所述蛋白胨的浓度为20％(w/v)；所述硫酸锌的浓度为1.2％(w/v)。
优选的，步骤(4)中，包含所述氮源和微量元素的培养基的流加速率为0.01～0.04吨/小时。
优选的，所述碳源包括蔗糖或者葡萄糖。
优选的，所述蔗糖的浓度为10～50％(w/v)，所述葡萄糖的浓度为10～30％(w/v)。
优选的，所述蔗糖的浓度为20～40％(w/v)，所述葡萄糖的浓度为20～30％(w/v)。
优选的，所述蔗糖的浓度为35％(w/v)；所述葡萄糖的浓度为25％(w/v)。
优选的，包含所述碳源的培养基的流加速率为0.01～0.05吨/小时。
优选的，步骤(3)中，所述的种子培养基，以100mL水计，包括：葡萄糖1～6g，蛋白胨0.2～1g，磷酸二氢钾0.01～0.08g，磷酸氢二钾0.01～0.08g，氯化钙0.02～0.1g和硫酸镁0.02～0.1g。
优选的，步骤(4)中，所述的发酵培养基，以100mL水计，包括：蔗糖1～6g，蛋白胨0.2～1g，磷酸二氢钾0.05g，磷酸氢二钾0.01～0.08g，氯化钙0.08g，硫酸镁0.02～0.1g，硫酸锌0.01～0.08g，麸皮0.1～1g和玉米浆0.1～0.6g。
优选的，对步骤(4)得到的发酵后的菌液采用板框进行过滤，得到粗酶过滤液。
优选的，对所述的粗酶过滤液进行浓缩，浓缩倍数10～20倍，得到浓缩液。
优选的，对所述的浓缩液冻干或喷粉处理得到固体核酸酶。
其中，包含所述碳源的培养基指的是不含氮源和微量元素，仅以碳源作为主要成分的培养基。
其中，包含所述氮源和微量元素的培养基指的是不含碳源，仅以氮源和微量元素作为主要成分的培养基。
其中，步骤(1)中所述桔青霉菌株(Penicillium citrinum)，商购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号为CGMCC 3.3174，其保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
其中，通风比用每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示。(V/V.min)。
本发明的有益效果是：
本发明通过该生产方法，解决了目前核酸酶P1生产水平低，生产成本高的问题，从而提高了产量，实现了工业化生产。
核酸酶P1的主要应用为水解核糖核酸得到核苷酸，而由核苷酸作为食品、调味品、药品、营养品的需求越来越大，因此核酸酶P1作为重要的酶制剂对整个核苷酸工业起着重要的作用。目前国内规模化生产核酸酶的企业匮乏，现有的文献报道与专利技术也很少有工业化生产，市面上核酸酶商品较少。国外生产厂商为日本天野酶制剂，其生产的核酸酶在全球处于垄断地位。本发明通过对桔青霉发酵工艺的改进与优化，为核酸酶的工业化生产提供了条件，将有力的改变核酸酶的市场格局。
具体实施方式
本发明为了克服现有技术中采用桔青霉发酵法生产核酸酶P1的方法存在生产成本高、核酸酶P1的酶活力低，因而产量低的缺陷，通过改进桔青霉液态发酵方法制备得到核酸酶成品，可用于核糖核酸的水解。
具体地，在一种优选实施方式中，本发明通过如下步骤发酵制备核酸酶P1，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将桔青霉孢子接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；
(2)种子制备：将孢子悬液按照1％～2.5％重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中，置于28～29℃培养20～22小时，得到种子菌液；
(3)种子罐培养：按照0.1％～0.5％重量比的接种量，将种子菌液接入装有种子培养基的种子罐中，培养温度29～30℃，转速50～150rpm，通风比1:0.5～1:1，培养周期为24～28小时，得到种子培养液；
(4)发酵罐生产：按照3％～8％重量比的接种量，将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度29～30℃，转速100～200rpm，通风比1:0.5～1:1.2，发酵周期为100～200小时；其中期间，发酵45～48小时后开始流加包含氮源、微量元素和碳源的培养基，直至发酵结束。
下面通过具体实施例来阐述本发明的实施过程和技术效果，本领域技术人员应当理解的是，这不应被理解为对本发明权利要求范围的限制，同时需要注意的是，本发明中提到的接种量均为重量比。
实施例和对比例中所用的具体试剂和设备均是商购的。
本发明中所用的桔青霉菌株(Penicillium citrinum)商购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 3.3174。
其中，实施例和对比例中所用PDA培养基的配方为：每1000ml水中，含土豆(去皮)200g，葡萄糖20g和琼脂20g，pH自然。
其中，本发明所用到的各种培养基以及各种容器均经过高压蒸汽灭菌处理。
其中试剂的具体来源列于下面的表1中：
表1 实施例和对比例中用到的各试剂及厂商
试剂 纯度 生产厂商
葡萄糖 食品级 济南圣丰工贸有限公司
蛋白胨 工业级 衡水中裕胶业有限公司
磷酸二氢钾 工业级 吴江市南风精细化工有限公司
磷酸氢二钾 工业级 吴江市南风精细化工有限公司
氯化钙 工业级 吴江市南风精细化工有限公司
硫酸镁 工业级 邹平县润梓化工有限公司
蔗糖 食品级 北京康普汇维科技有限公司
硫酸锌 工业级 邹平县润梓化工有限公司
麸皮 食品级 蒙城县金冠面粉有限责任公司
玉米浆 工业级 元氏县泽润淀粉糖有限责任公司
其中，本发明所用到的设备型号及厂商如下：
冻干设备，上海东富龙科技股份有限公司；
喷粉设备，常州市益民干燥设备有限公司；
超滤浓缩设备，西安滨润环保科技有限公司。
其中，核酸酶P1酶活测定方法如下：
(1)在试管中加入1.9ml底物溶液(3％酵母核糖核酸，煮沸20min，调节pH到5.0，用pH为5.0醋酸-醋酸钠缓冲液定容)，置于68℃水浴保温10min后，加入酶液0.1ml，继续保温15min后，置冰水中冷却，迅速加入2.0ml核酸沉淀剂(0.25％钼酸铵-2.5％高氯酸)，继续冷却10min。于3500r/min离心15min，取0.2ml上清液加双蒸水稀释定容至50ml，在260nm处比色，吸光值读数记做A1。
(2)空白对照：1.9ml底物，在68℃保温25min，加入核酸沉淀剂2.0ml，再加酶液0.1ml。继续冷却10min，于3500r/min离心15min，取0.2ml上清液加双蒸水稀释定容至50ml。在260nm处比色，吸光值读数记做A2。
(3)A1与A2的差值记做A。
在上述条件下，每分钟生成的核苷酸量在260nm处的吸光值的差值为1.0时定义为1个酶活力单位，计算公式如下：
A—指在260nm处的吸光度差值；
4—指反应溶液总体积为4ml；
50—指定容于50ml容量瓶中；
0.1—指酶液体积为0.1ml；
0.2—指吸取0.2ml酶解液；
15—指反应总时间为15min。
实施例1
1.菌种活化：取桔青霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照1％重量比的接种量接种到含有450ml种子摇瓶培养基中，置于28℃温度下培养22小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.1％重量比的接种量，将种子菌液接入到装有450L种子培养基的种子罐(储存量为0.5吨)中，在30℃温度下通气搅拌培养24小时制备得到种子培养液，其中搅拌转速为50rpm，通风比为1：0.5，种子培养基按重量％计，其配方为：葡萄糖1％，蛋白胨0.2％，磷酸二氢钾0.01％，磷酸氢二钾0.01％，氯化钙0.02％，硫酸镁0.02％，其余组分为水。
4.发酵罐生产：按照3％重量比的接种量，将种子培养液接入到含有15000L发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中，在29℃温度下通气搅拌培养，搅拌转速为100rpm，通风比为1：0.5，发酵45小时后开始进行补料，从其中一个流加管线流加10％(w/v)的蔗糖水溶液，流加速率为0.05吨/小时，从另一个流加管线开始流加由30％(w/v)的蛋白胨和0.1(w/v)的硫酸锌组成的溶液，流加速率为0.04吨/小时，至发酵结束，放罐测定酶活水平，其中发酵培养基按重量％计，其配方为蔗糖1％，蛋白胨0.2％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.01％，氯化钙0.08％，硫酸镁0.02％，硫酸锌0.01％，麸皮0.1％，玉米浆0.1％，其余组分为水。发酵周期为160小时。
5.板框处理：采用板框过滤的方法进行固液分离，除去菌体，获得核酸酶P1粗酶液。
6.超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在10倍。
7.冻干处理：利用冻干设备进行冷冻干燥处理得到固体核酸酶。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为3592u/ml。
实施例2
1.菌种活化：取桔青霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于29℃环境中培养2天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2.5％重量比的接种量接种到含有6L种子摇瓶培养基中进行摇瓶培养，置于29℃温度下培养20小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.5％重量比的接种量，将种子菌液接入到装有1200L种子培养基的种子罐(储存量为2吨)中，在29℃温度下通气搅拌培养28小时得到种子培养液，其中搅拌转速为150rpm，通风比为1:1，种子培养基按重量％计，其配方为：葡萄糖6％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.08％，磷酸氢二钾0.08％，氯化钙0.1％，硫酸镁0.1％，其余组分为水。
4.发酵罐生产：按照8％的接种量，将种子培养液接入到装有15000L发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中，在30℃温度下通气搅拌培养，搅拌转速为200rpm，通风比为1:1.2，发酵48小时后从其中一个流加管线流加50％(w/v)的蔗糖水溶液，流加速率为0.01吨/小时，从另一个流加管线开始流加由10％(w/v)的蛋白胨和2％(w/v)的硫酸锌的溶液，流加速率为0.01吨/小时，至发酵结束，放罐测定酶活水平，其中发酵培养基按重量％计，其配方为蔗糖6％，蛋白胨1％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.08％，氯化钙0.08％，硫酸镁0.1％，硫酸锌0.08％，麸皮1％，玉米浆0.6％，其余组分为水。发酵周期为110小时。
5.板框处理：采用板框过滤的方法进行固液分离，除去菌体，获得核酸酶P1粗酶液。
6.超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在20倍。
7.冻干处理：利用冻干设备进行冷冻干燥处理得到固体核酸酶。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为3282u/ml。
实施例3
1.菌种活化：取桔青霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接到100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％的接种量接种到2L种子摇瓶培养基中进行摇瓶培养，置于29℃温度下培养20小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.25％的接种量，将种子菌液接入到装有750L种子培养基的种子罐(储存量为1吨)中，在29℃温度下通气搅拌培养24小时得到种子培养液，其中搅拌转速为100rpm，通风比为1:1；种子培养基按重量％计，其配方为葡萄糖5％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.04％，硫酸镁0.04％，其余组分为水。
4.发酵罐生产：按照5％的接种量，将种子培养液接入到装有15000L发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中，在30℃温度下通气搅拌培养，搅拌转速为150rpm，通风比为1:1，发酵46小时后从其中一个流加管线流加10％(w/v)的葡萄糖水溶液，流加速率为0.03吨/小时，从另一个流加管线开始流加由25％(w/v)的蛋白胨和0.4％(w/v)的硫酸锌组成的溶液，流加速率为0.02吨/小时，至发酵结束，放罐测定酶活水平，其中发酵培养基按重量％计，其配方为蔗糖5％，蛋白胨0.6％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.08％，硫酸镁0.04％，硫酸锌0.02％，麸皮0.375％，玉米浆0.3％，其余组分为水。发酵周期为120小时。
5.板框处理：采用板框过滤的方法进行固液分离，除去菌体，获得核酸酶P1粗酶液。
6.超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在15倍。
7.喷粉处理：进行喷粉处理得到固体核酸酶。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为3728u/ml。
实施例4
1.菌种活化：取桔青霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于29℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照1.5％的接种量接种到2L种子摇瓶培养基中进行摇瓶培养，置于28℃温度下培养21小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.3％的接种量，将种子菌液接入到装有750L种子培养基的种子罐(储存量为1吨)中，在29℃温度下通气搅拌培养26小时得到种子培养液，其中搅拌转速为80rpm，通风比为1:0.8；种子培养基按重量％计，其配方为：葡萄糖5％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.04％，硫酸镁0.04％，其余组分为水。
4.发酵罐生产：按照6％的接种量，将种子培养液接入到装有15000L发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中，在29℃温度下通气搅拌培养，搅拌转速为130rpm，通风比为1:0.8，发酵46小时后从其中一个流加管线流加25％(w/v)的葡萄糖溶液，流加速率为0.04吨/小时，从另一个流加管线同时流加由20％(w/v)的蛋白胨和1.4％(w/v)的硫酸锌组成的溶液，流加速率为0.03吨/小时，至发酵结束，放罐测定酶活水平，其中发酵培养基按重量％计，其配方为蔗糖5％，蛋白胨0.6％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.08％，硫酸镁0.04％，硫酸锌0.02％，麸皮0.375％，玉米浆0.3％，其余组分为水。发酵周期为200小时。
5.板框处理：采用板框过滤的方法进行固液分离，除去菌体，获得核酸酶P1粗酶液。
6.超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在15倍。
7.喷粉处理：进行喷粉处理得到固体核酸酶。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为3852u/ml。
实施例5
1.菌种活化：取桔青霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％的接种量接种到2L种子摇瓶培养基中进行摇瓶培养，置于29℃温度下培养20小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.25％的接种量，将种子菌液接入到装有750L种子培养基的种子罐(储存量为1吨)中，在29℃温度下通气搅拌培养24小时，搅拌转速为100rpm，通风比为1:1；其中种子培养基按重量％计，其配方为：葡萄糖5％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.04％，硫酸镁0.04％，其余组分为水。
4.发酵罐生产：按照5％的接种量，将种子培养液接入到装有15000L发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中，在30℃温度下通气搅拌培养，搅拌转速为150rpm，通风比为1:1，发酵48小时后从其中一个流加管线流加30％(w/v)的蔗糖水溶液，流加速率为0.03吨/小时，从另一个流加管线同时流加由15％(w/v)的蛋白胨和0.75％(w/v)的硫酸锌组成的溶液，流加速率为0.03吨/小时，至发酵结束，放罐测定酶活水平，其中发酵培养基按重量％计，其配方为蔗糖5％，蛋白胨0.6％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.08％，硫酸镁0.04％，硫酸锌0.02％，麸皮0.375％，玉米浆0.3％，其余组分为水。发酵周期为120小时。
5.板框处理：采用板框过滤的方法进行固液分离，除去菌体，获得核酸酶P1粗酶液。
6.超滤浓缩：将粗酶过滤液通过超滤浓缩设备进行浓缩，浓缩倍数控制在15倍。
7.冻干处理：通过冻干设备处理得到固体核酸酶。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为4018u/ml。
对比例1
1.菌种活化：取桔青霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照0.5％的接种量接种到2L种子摇瓶培养基中进行摇瓶培养，置于28℃温度下培养3d得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
其他步骤和实施例5中的步骤3-7相同，区别仅在于对比例1步骤4发酵罐生产的发酵周期为200小时。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为2031u/ml。
对比例2
1.菌种活化：取桔青霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照3％的接种量接种到2L种子摇瓶培养基中进行摇瓶培养，置于29℃温度下培养20小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
其他步骤和实施例5中的步骤3-7相同，区别仅在于对比例2步骤4发酵罐生产的发酵周期为102小时。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为2400u/ml。
对比例3
1.菌种活化：取桔青霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％的接种量接种到30L种子摇瓶培养基中，置于29℃温度下培养20小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照2％的接种量，将种子菌液接入到装有1500L种子培养基的种子罐(储存量为2吨)中，在29℃温度下通气搅拌培养24小时，搅拌转速为100rpm，通风比为1:1.5；其中种子培养基按重量％计，其配方为：葡萄糖5％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.04％，硫酸镁0.04％，其余组分为水。
4.发酵罐生产：按照10％的接种量，将种子培养液接入到装有15000L发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中，在30℃温度下通气搅拌培养，搅拌转速为150rpm，通风比为1:1.5，发酵48小时从其中一个流加管线流加30％(w/v)的蔗糖水溶液，流加速率为0.03吨/小时，从另一个流加管线同时流加由15％(w/v)的蛋白胨和0.75％(w/v)的硫酸锌组成的溶液，流加速率为0.03吨/小时，至发酵结束，放罐测定酶活水平，其中发酵培养基按重量％计，其配方为蔗糖5％，蛋白胨0.6％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.08％，硫酸镁0.04％，硫酸锌0.02％，麸皮0.375％，玉米浆0.3％，其余组分为水。发酵周期为97小时。
其他步骤和实施例5中的步骤5-7相同。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为1590u/ml。
对比例4
1.菌种活化：取桔青霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于28℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％的接种量接种到0.075L种子摇瓶培养基中进行摇瓶培养，置于29℃温度下培养20小时得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.05％的接种量，将种子菌液接入到装有150L种子培养基的种子罐(储存量为0.5吨)中，在29℃温度下通气搅拌培养40小时，搅拌转速为100rpm，通风比为1:1；其中种子培养基按重量％计，其配方为：葡萄糖5％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.04％，硫酸镁0.04％，其余组分为水。
4.发酵罐生产：按照1％的接种量，将种子培养液接入到装有15000L发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中，在30℃温度下通气搅拌培养，搅拌转速为50rpm，通风比为1:0.5，发酵48小时后从其中一个流加管线流加30％(w/v)的蔗糖水溶液，流加速率为0.03吨/小时，从另一个流加管线同时流加由15％(w/v)的蛋白胨和0.75％(w/v)的硫酸锌组成的溶液，流加速率为0.03吨/小时，至发酵结束，放罐测定酶活水平，其中发酵培养基按重量％计，其配方为蔗糖5％，蛋白胨0.6％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.08％，硫酸镁0.04％，硫酸锌0.02％，麸皮0.375％，玉米浆0.3％，其余组分为水。发酵周期为213小时。
其他步骤和实施例5中的步骤5-7相同。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为1805u/ml。
对比例5
1.菌种活化：取桔青霉孢子悬液甘油管一支，用10ul接种环挑取一环，在无菌环境下接入到100gPDA培养基中，置于25℃环境中培养3天，并用50ml无菌水洗脱，得到孢子悬液。
2.种子制备：将孢子悬液按照2％的接种量接种到2L种子摇瓶培养基中进行摇瓶培养，置于25℃温度下培养3天得到种子菌液，其中种子摇瓶培养基的配方同步骤3中种子培养基的配方。
3.种子罐培养：按照0.25％的接种量，将种子菌液接入到装有750L种子培养基的种子罐(储存量为1吨)中，在25℃温度下通气搅拌培养40小时制备得到种子培养液，搅拌转速为100rpm，通风比为1:1；其中种子培养基按重量％计，其配方为：葡萄糖5％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.04％，硫酸镁0.04％，其余组分为水。
4.发酵罐生产：按照5％的接种量，将种子培养液接入到装有15000L发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中，在25℃温度下通气搅拌培养，搅拌转速为150rpm，通风比为1:1，发酵48小时后从其中一个流加管线流加30％(w/v)的蔗糖水溶液，流加速率为0.03吨/小时，从另一个流加管线同时流加由15％(w/v)的蛋白胨和0.75％(w/v)的硫酸锌组成的溶液，流加速率为0.03吨/小时，至发酵结束，放罐测定酶活水平，其中发酵培养基的配方为蔗糖5％，蛋白胨0.6％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.08％，硫酸镁0.04％，硫酸锌0.02％，麸皮0.375％，玉米浆0.3％，其余组分为水。发酵周期为200小时。
其他步骤和实施例5中的步骤5-7相同。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为1000u/ml。
对比例6
对比例6步骤1-3和实施例5中步骤1-3相同。
4.发酵罐生产：按照5％的接种量，将种子培养液接入到装有15000L发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中，在30℃温度下通气搅拌培养，搅拌转速为150rpm，通风比为1:1，至发酵结束，放罐测定酶活水平；其中发酵培养基按重量％计，其配方为蔗糖5％，蛋白胨0.6％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.08％，硫酸镁0.04％，硫酸锌0.02％，麸皮0.375％，玉米浆0.3％，其余组分为水。发酵周期为67小时。
其他步骤和实施例5中的步骤5-7相同。
实验测得核酸酶P1的酶活最高水平为752u/ml。
对比例7
对比例7步骤1-3和实施例5中步骤1-3相同。
4.发酵罐生产：按照5％的接种量，将种子培养液接入到装有15000L发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中，在30℃温度下通气搅拌培养，搅拌转速为150rpm，通风比为1:1，发酵40小时后从其中一个管线开始流加30％(w/v)的果糖水溶液，另一个管线同时流加由15％(w/v)的酵母粉和0.75％(w/v)的硫酸锌组成的溶液进行补料至发酵结束，放罐测定酶活水平，其中发酵培养基按重量％计，其配方为蔗糖5％，蛋白胨0.6％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.08％，硫酸镁0.04％，硫酸锌0.02％，麸皮0.375％，玉米浆0.3％，其余组分为水。发酵周期为120小时。
其他步骤和实施例5中的步骤5-7相同。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为1539u/ml。
对比例8
对比例8步骤1-3和实施例5中步骤1-3相同。
4.发酵罐生产：按照5％的接种量，将种子培养液接入到装有15000L发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中，在30℃温度下通气搅拌培养，搅拌转速为150rpm，通风比为1:1，发酵55小时后从其中一个管线开始流加60％(w/v)的蔗糖水溶液，由另一个管线开始流加由40％(w/v)的蛋白胨和0.75％(w/v)的硫酸镁组成的溶液进行补料至发酵结束，放罐测定酶活水平，其中发酵培养基按重量％计，其配方为蔗糖5％，蛋白胨0.6％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.08％，硫酸镁0.04％，硫酸锌0.02％，麸皮0.375％，玉米浆0.3％，其余组分为水。发酵周期为120小时。
其他步骤和实施例5中的步骤5-7相同。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为1029u/ml。
对比例9
对比例9步骤1-3和实施例5中步骤1-3相同。
4.发酵罐生产：按照5％的接种量，将种子培养液接入到装有15000L发酵培养基的发酵罐(储存量为25吨)中，在30℃温度下通气搅拌培养，搅拌转速为150rpm，通风比为1:1，发酵45小时后从其中一个管线开始流加30％(w/v)的木糖，从另一个管线同时流加由5％(w/v)的蛋白胨和3％(w/v)的硫酸锌组成的溶液进行补料至发酵结束，放罐测定酶活水平，其中发酵培养基按重量％计，其配方为蔗糖5％，蛋白胨0.6％，磷酸二氢钾0.05％，磷酸氢二钾0.05％，氯化钙0.08％，硫酸镁0.04％，硫酸锌0.02％，麸皮0.375％，玉米浆0.3％，其余组分为水。发酵周期为120小时。
其他步骤和实施例5中的步骤5-7相同。
实验测得核酸酶P1的酶活水平为1237u/ml。
从实施例和对比例的酶活测定结果可以看出，该桔青霉菌株通过该生产方法，所产的核酸酶P1的酶活水平较高，酶活力达到3000-4100u/ml，具有大规模工业化的应用价值。

Claims (10)

1.一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌种活化：将保藏编号为CGMCC 3.3174的桔青霉（Penicillium citrinum）孢子接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；
（2）种子制备：将孢子悬液按照1%~2.5%重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中，置于28~29℃培养20~22小时，得到种子菌液；
（3）种子罐培养：按照0.1%~0.5%重量比的接种量，将种子菌液接入装有种子培养基的种子罐中，培养温度29~30℃，转速50~150rpm，通风比1: 0.5~1: 1，培养周期为24~28小时，得到种子培养液；
以及
（4）发酵罐生产：以发酵培养基15000升计，按照3%~8%重量比的接种量，将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度29~30℃，转速100~200rpm，通风比1: 0.5~1:1.2，发酵周期为110~200小时；其中期间，发酵45~48小时后开始补料，流加包含氮源、微量元素和碳源的培养基，直至发酵结束；
其中，步骤（4）中，所述流加氮源为蛋白胨，所述微量元素为硫酸锌，所述碳源为蔗糖或者葡萄糖；其中，包含所述氮源和微量元素的培养基的流加速率为0.01~0.04吨/小时，包含所述碳源的培养基的流加速率为0.01~0.05吨/小时。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（1）中，桔青霉孢子接入PDA培养基，置于28~29℃环境中培养2~3天。
3.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，所述蛋白胨的浓度为10~30%（w/v）；所述硫酸锌的浓度为0.1~2%（w/v）。
4.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，所述蛋白胨的浓度为10~25%（w/v）；所述硫酸锌的浓度为0.4~1.4%（w/v）。
5.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述蛋白胨的浓度为20 %（w/v）；所述硫酸锌的浓度为1.2%（w/v）。
6.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，所述蔗糖的浓度为10~50 %（w/v）；所述葡萄糖的浓度为10~30 %（w/v）。
7.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，所述蔗糖的浓度为20~40%（w/v）；所述葡萄糖的浓度为20~30%（w/v）。
8.根据权利要求1或2所述的生产方法，其特征在于，所述蔗糖的浓度为35%（w/v）；所述葡萄糖的浓度为25%（w/v）。
9.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的种子培养基，以100mL水计，包括：葡萄糖1~6g，蛋白胨0.2~1g，磷酸二氢钾0.01~0.08g，磷酸氢二钾0.01~0.08g，氯化钙0.02~0.1g和硫酸镁0.02~0.1g。
10.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的发酵培养基，以100mL水计，包括：蔗糖1~6g，蛋白胨0.2~1g，磷酸二氢钾0.05g，磷酸氢二钾0.01~0.08g，氯化钙0.08g，硫酸镁0.02~0.1g，硫酸锌0.01~0.08g，麸皮0.1~1g和玉米浆0.1~0.6g。
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