CN106434369B - 一株产l-苹果酸的米曲霉及其应用 - Google Patents

一株产l-苹果酸的米曲霉及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产L‑苹果酸的米曲霉及其应用，属于微生物领域。米曲霉菌株(Aspergillusoryzae FMME 338)，保藏编号CCTCC NO:M 2016401。本发明同时公开一种发酵生产L‑苹果酸方法，温度30℃，摇床转速200r/min，发酵周期120h，最终摇瓶L‑苹果酸产量可达109.2g/L，是一株高产L‑苹果酸的优良野生菌株。本发明发酵生产L‑苹果酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，且发酵液中L‑苹果酸纯度高，杂酸较少，发酵周期短，适用于工业化生产。

Description

一株产L-苹果酸的米曲霉及其应用
技术领域
本发明涉及一株产L-苹果酸的米曲霉及其应用，属于微生物领域。
背景技术
苹果酸(Malic acid)又名二羟基丁二酸，分子式为HOOCH2-CH(OH)COOH,相对分子质量为134.09。苹果酸是非常重要的有机酸之一，广泛的应用于化工、食品及医药工业等领域。因其分子结构中含一个不对称碳原子，所以具有旋光性，存在L-苹果酸和D-苹果酸两个手性对映体。其中L-苹果酸广泛存在于生物体中，作为三羧酸循环的一员参与细胞代谢。
苹果酸是天然果酸的重要组成部分。苹果酸的呈味作用明显，酸味持久柔和、性质稳定，是优良的酸味剂和调酸剂。L-苹果酸能增进药物的稳定性，促进人体对药物的吸收，可以作为药物稳定剂。苹果酸还能应用于日用化工方面。
目前，微生物发酵法生产苹果酸主要有三种方法，直接发酵法、两步发酵法和酶转化法。直接发酵法又称一步发酵法，该工艺采用糖质原料，用霉菌直接发酵生产苹果酸；两步发酵法制备L-苹果酸是采用两种不同功能的微生物，采用糖质原料，先由根霉发酵生成富马酸或富马酸与苹果酸的混合物，再由酵母或细菌等转化成单一的L-苹果酸；转化发酵是将两步发酵中第一步发酵产物富马酸转化为苹果酸，而酶转化法是利用微生物的延胡索酸酶将富马酸盐转化为苹果酸盐，成本高，不适合工业化生产。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株产L-苹果酸的米曲霉(Aspergillus oryzae)FMME 338，已于2016年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M2016401，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
本发明的第二个目的是提供一种应用所述米曲霉生产L-苹果酸的方法，其特征在于，将所述米曲霉接种于发酵培养基进行发酵；所述发酵培养基含有葡萄糖80～130g/L，蛋白胨4～8g/L，CaCO390～120g/L。
在本发明的一种实施方式中，接种量为6～12％。
在本发明的一种实施方式中，发酵温度为28～32℃。
在本发明的一种实施方式中，发酵周期为96h～168h。
在本发明的一种实施方式中，接种前进行种子培养，所述种子培养在种子培养基中进行，使孢子终浓度为106个/mL；所述种子培养基为：葡萄糖30g/L，蛋白胨3g/L，K2HPO40.56g/L，KH2PO40.56g/L，NaH2PO4·H200.925g/L，Na2HPO40.82g/L，MgSO4·7H2O0.075g/L，CaCl2·H2O 0.075g/L。
在本发明的一种实施方式中，种子培养前进行斜面培养，所述斜面培养是指接种一环菌株于PDA斜面培养基，于28℃培养7天。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基为葡萄糖120g/L，蛋白胨6g/L，K2HPO4 0.15g/L，KH2PO40.15g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，CaCl2·H2O 0.1g/L，CaCO3100g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述斜面培养基为称取洗净去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮烂(约20～30分钟)，双层纱布滤去马铃薯块，加入葡萄糖20g，琼脂15g，定容至1L，115℃灭菌20分钟。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是以10％的接种量接种，在30℃，200r/min发酵120h。
本发明的第三个目的是提供所述米曲霉在食品、化工领域的应用，尤其是在制备酸味剂、调味剂方面的应用。
本发明的有益效果：本发明的米曲霉FMME 338在摇瓶水平上发酵生产L-苹果酸产量达109.2g/L，发酵液中L-苹果酸纯度高，杂酸占总酸6％以下。本发明发酵生产L-苹果酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，且发酵周期短，适用于工业化生产。
生物材料保藏
米曲霉((Aspergillus oryzae)FMME 338，已于2016年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2016401，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
附图说明
图1为HPLC测定L-苹果酸的标准曲线；
图2为米曲霉菌落形态；
图3为米曲霉发酵过程L-苹果酸产量变化曲线。
图4为发酵液HPLC检测结果；A，1g/L L-苹果酸标样色谱图B，120h发酵液的色谱图。
具体实施方式
PDA培养基：称取洗净去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮烂(20～30分钟)，双层纱布滤去马铃薯块，加入葡萄糖20g，琼脂15g，定容至1L，115℃灭菌20分钟。
固体筛选培养基(g/L)：蔗糖30，NaNO33，K2HPO41，KCl 0.5，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.01，琼脂20。
产酸指示培养基(g/L)：葡萄糖80，(NH4)2SO42，K2HPO40.5，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O0.01，MnSO4·H2O 0.03，FeSO4·7H2O 0.05，CaCO310,琼脂20，溴甲酚绿0.02。
种子培养基(g/L)：葡萄糖30，蛋白胨3，K2HPO40.56，KH2PO40.56，NaH2PO4·H200.925，Na2HPO40.82，MgSO4·7H2O 0.075，CaCl2·H2O 0.075
微量元素溶液：5g/LNaCl，5g/LFeSO4·7H2O，1g/L柠檬酸。
L-苹果酸的测定：
发酵液预处理：取发酵液加入4mol/L的HCl，8000r/min离心10min取上清。
高效液相色谱条件：色谱柱：C18(5μm 4.6×250mm)；流动相：0.1mol/LKH2PO4，磷酸调pH至2.8；柱温：20℃；检测波长：215nm；进样量：10μl；流速:0.6ml/min。
实施例1
(1)米曲霉初步分离纯化
从无锡周边地区果园采集土壤样品，取适量的土壤，放入装有100mL无菌水的250mL三角瓶，振荡，稀释10-4～10-6倍分别涂布于产酸指示平板上，在28℃下培养3天。观察平板变色情况，挑取变色圈大的单菌落孢子接种于固体筛选培养基上于28℃培养7天，分离纯化至无杂菌，保藏于PDA斜面，以供使用。
(2)产L-苹果酸米曲霉的筛选
取10支长满孢子的上述分离纯化得到的菌株，每支加入5mL无菌水，在超净台中用接种环将孢子全部刮下，用玻璃珠震荡打散，通过宣纸过滤，得到单孢子悬液，将孢子悬液接种于种子培养基，30℃培养14h后转接于发酵培养基，30℃下培养5天收集发酵液，经高效液相分析，筛选L-苹果酸产量为80g/L的菌株为目的菌株。
(3)产L-苹果酸米曲霉的鉴定
提取目的菌株的基因组DNA，以出发菌株的基因组DNA为模板，使用真菌26S rDNAPCR通用引物正向引物EF3：5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'、:反向引物EF4：5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3进行扩增。用胶回收试剂盒纯化PCR产物，核酸电泳验证。18SrDNA测序由上海生工生物科技有限公司完成，将测序结果在Genbank数据库中与已有序列进行Blast比对分析，结果表明其与米曲霉的26S rDNA序列相似性最高达99％，将其命名为米曲霉(Aspergillus oryzae)FMME 338。
实施例2
(1)斜面培养：接种一环菌株于斜面培养基，于28℃培养7天；
(2)种子培养：向装液量100mL/250mL的种子培养基中接入孢子悬液，使孢子终浓度在106个/mL；温度30℃，摇床转速200r/min条件下，培养14h；
(3)发酵培养：将种子液以10％(v/v)接种至发酵培养基，温度30℃，摇床转速200r/min条件下，发酵120h。
发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K2HPO40.15，KH2PO40.15，MgSO4·7H2O0.1，CaCl2·2H2O 0.1，CaCO3100。
HPLC检测发酵液中L-苹果酸及杂酸含量，结果如表1所示。
表1发酵液中L-苹果酸及杂质含量
采用本实施例的方法应用米曲霉发酵生产L-苹果酸，发酵120h后，只有极少量其他杂酸的存在(如图4所示，L-苹果酸出峰时间为9.6min左右，琥珀酸出峰时间为11.6min左右，富马酸出峰时间为14.9min左右)，琥珀酸含量仅为3.2g/L，富马酸0.6g/L。
实施例3
发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K2HPO40.15，KH2PO40.15，MgSO47H2O 0.1，CaCl2·2H2O 0.1，CaCO390。
斜面培养、种子培养和发酵培养条件同实施例2。
实施例4
发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K2HPO40.15，KH2PO40.15，MgSO4·7H2O0.1，CaCl2·2H2O 0.1，CaCO3120。
斜面培养、种子培养和发酵培养条件同实施例2。
实施例5
发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K2HPO40.15，KH2PO40.15，MgSO4·7H2O0.1，CaCl2·2H2O 0.1，CaCO380。
斜面培养、种子培养和发酵培养条件同实施例2。
实施例6
发酵培养基(g/L)：葡萄糖100，蛋白胨6，K2HPO40.15，KH2PO40.15，MgSO4·7H2O0.1，CaCl2·2H2O 0.1。
斜面培养、种子培养和发酵培养条件同实施例2。
不同实施方式下L-苹果酸发酵结果见表2。结果表明CaCO3对米曲霉发酵生产L-苹果酸影响很大，发酵培养基中不添加CaCO3时，基本不产酸；当CaCO3添加量在80～100g/L时，L-苹果酸产量几乎保持在80g/L以上，且原料利用率高，残糖含量低于2.1g/L。
表2不同实施方式下米曲霉生产L-苹果酸发酵结果
实施例7
发酵培养基(g/L)：葡萄糖120，蛋白胨6，K2HPO40.15，KH2PO40.15，MgSO4·7H2O0.1，CaCl2·2H2O 0.1，CaCO3100。
斜面培养、种子培养和发酵培养条件同实施例2。
HPLC检测发酵液中L-苹果酸及杂酸含量，结果如表3所示。苹果酸含量为109.2g/L，杂酸含量仅为苹果酸含量的6.68％。
表3发酵液中L-苹果酸及杂质含量
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株产L-苹果酸的米曲霉(Aspergillus oryzae)FMME 338，已于2016年7月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO: M 2016401，保藏地址为中国武汉.武汉大学。
2.一种应用权利要求1所述菌株生产L-苹果酸的方法，其特征在于，将所述米曲霉接种于发酵培养基进行发酵；所述发酵培养基含有葡萄糖90~120 g/L，蛋白胨4~8 g/L，CaCO390~120 g/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，接种量为6~12%，发酵温度为28~32°C。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵周期为96 h~168 h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，接种前进行种子培养，所述种子培养在种子培养基中进行，在30~34 oC， 200 r/min培养12~18 h，使孢子终浓度为106个/mL；所述种子培养基为：葡萄糖30 g/L，蛋白胨3 g/L，K2HPO4 0.56 g/L，KH2PO4 0.56 g/L，NaH2PO4·H2O0.925 g/L，Na2HPO4 0.82 g/L，MgSO4· 7H2O 0.075 g/L，CaCl2· H2O 0.075 g/L。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子培养前进行斜面培养，所述斜面培养是指接种一环菌株于PDA斜面培养基于28°C培养7天；所述PDA培养基配制 方法为：称取马铃薯200g，煮烂，滤去块状物，加入葡萄糖20g，琼脂15g，定容至1L，灭菌。
7.据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为葡萄糖90 g/L，蛋白胨6g/L，K2HPO4 0.15 g/L，KH2PO4 0.15 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，CaCl2·H2O 0.1 g/L，CaCO3100 g/L。
8.据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵是以10%的接种量接种，在30 oC，200r/min发酵120 h。
9.权利要求1所述米曲霉在食品、化工领域的应用。
10.权利要求1所述米曲霉在制备酸味剂和调酸剂中的应用。
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