CN112280688B - 一株产苹果酸的米曲霉菌株的筛选及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产苹果酸的米曲霉菌株的筛选及其应用，属于微生物技术领域。使用ARTP、60Coγ、NTG迭代复合诱变的方式，筛选得到了一株苹果酸高产菌株，命名为FMME‑S‑38。在摇瓶优化条件下，苹果酸产量可达到140g/L及以上，在30L发酵罐苹果酸产量可达到191.5g/L，且具备良好的遗传稳定性，适用于工业化生产。

Description

一株产苹果酸的米曲霉菌株的筛选及其应用

技术领域

本发明涉及一株产苹果酸的米曲霉菌株的筛选及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

苹果酸(malate)，分子式为C₄H₆O₅，又名2-羟基丁二酸，其粉末呈白色结晶状，苹果酸是一种非常重要的四碳平台化合物，与琥珀酸、富马酸一起被美国能源部列为四碳1,4-二羧酸组中最有潜力的生物基大宗化学品。由于苹果酸分子结构式中有一个手性碳原子，所以在自然界中存在三种形式：D型、L型、DL型，其中L-苹果酸是TCA循环中的中间产物，在细胞质中的NADH通过苹果酸-天冬氨酸途径穿梭进入线粒体的过程中起到十分关键的作用。苹果酸具有令人愉悦的香味，在食品工业中主要用作酸味剂，据报道，世界上每年的苹果酸需求量超过了20万吨。使用化学法合成DL-苹果酸的技术从六十年代被发明以来一直沿用至今。生物法生产L-苹果酸拥有低污染、低能耗、低成本与可持续发展等优点，已经发展成为合成L-苹果酸的主流方法，其中包括酶催化法和微生物发酵法。酶催化法已经应用于L-苹果酸的工业生产，而微生物发酵法生产苹果酸的水平需得到进一步提高。

发明内容

为进一步提高苹果酸的产量，本申请通过ARTP、NTG、⁶⁰Coγ射线迭代复合诱变，筛选获得一株高苹果酸的米曲霉，并将其应用于苹果酸的发酵中，以使得苹果酸的产量得到更大的提高。

本发明提供了一株米曲霉(Aspergillusoryzae)，为菌株FMME-S-38，已于2020年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020294，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

本发明提供了一种微生物菌剂，所述菌剂中含有所述菌株FMME-S-38。

在本发明的一种实施方式中，将菌株FMME-S-38接种于PDA平板中，28～35℃下培养65～75h，待菌株FMME-S-38的孢子浓度达到10⁷cfu/mL以上时加入缓冲液(生理盐水或pH值为7的0.2M磷酸盐缓冲液)冲洗米曲霉孢子得到孢子悬液，在无菌环境下加入保护剂，得到微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述保护剂为15g/100mL的葡萄糖溶液。

本发明提供了一种生产苹果酸的方法，以所述菌株FMME-S-38为发酵菌株，或添加所述微生物菌剂。

在本发明的一种实施方式中，所述菌株FMME-S-38在单位体积mL或单位质量g的发酵体系中孢子个数处于10⁵～10⁷数量级。

在本发明的一种实施方式中，发酵体系中的氮源可以为胰蛋白胨，所述胰蛋白胨的初始浓度为6～6.5g/L。

在本发明的一种实施方式中，在发酵第18～24小时补加氮源。

在本发明的一种实施方式中，补加的氮源为胰蛋白胨，所述胰蛋白胨在体系中的浓度为2～3g/L。

在本发明的一种实施方式中，将含有孢子个数为10⁹～10¹⁰数量级的150mL的种子培养基以10mL/100mL的转接量，接种至发酵培养基，在32～37℃，150～200rpm下发酵。

在本发明的一种实施方式中，种子培养基中含有葡萄糖50～55g/L，酵母粉10～12g/L，KH₂PO₄ 0.5～0.8g/L，KH₂PO₄ 0.5～0.8g/L，NaCl 0.1～0.5g/L。

本发明提供了一种提高苹果酸产量的方法，利用所述菌株FMME-S-38，或所述微生物菌剂，转化生成苹果酸。

在本发明的一种实施方式中，发酵初始时胰蛋白胨浓度为6～6.5g/L。

在本发明的一种实施方式中，在发酵第18～24时一次性补加胰蛋白胨。

在本发明的一种实施方式中，补加的胰蛋白胨在发酵体系中的浓度为2～3g/L。

在本发明的一种实施方式中，将含有孢子数为10⁹～10¹⁰数量级的150mL的种子培养基以10mL/100mL的转接量，接种至发酵培养基，在32～37℃，150～200rpm下发酵。

在本发明的一种实施方式中，在30～35℃培养，发酵过程中pH维持6.1～6.8，搅拌550～650rpm，通气分为两阶段调控，发酵前期0～36h为3vvm，36h至发酵结束为1vvm。

在本发明的一种实施方式中，种子培养基中含有葡萄糖50～55g/L，酵母粉10～12g/L，KH₂PO₄ 0.5～0.8g/L，KH₂PO₄ 0.5～0.8g/L，NaCl 0.1～0.5g/L。

本发明还保护所述米曲霉，或所述微生物菌剂，或所述生产苹果酸的方法，或提高苹果酸产量的方法在生产苹果酸中的应用。

本发明的有益效果：

本发明以Aspergillus oryzaeNRRL3488为出发菌株，通过ARTP、NTG、⁶⁰Coγ射线迭代复合诱变，筛选获得一株高苹果酸的米曲霉，命名为FMME-S-38。在摇瓶优化条件下，苹果酸产量可达到140g/L及以上，在30L发酵罐苹果酸产量可达到191.5g/L，且具备良好的遗传稳定性，适用于工业化生产。

生物材料保藏

本发明所提供的菌株FMME-S-38，分类命名为Aspergillus oryzaeFMME-S-38，已于2020年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020294，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

附图说明

图1为菌株筛选过程中各突变菌株的苹果酸产量图。

图2为菌株FMME-S-38在30L发酵罐培养的发酵曲线图。

具体实施方式

筛选平板培养基以g/L计：葡萄糖150～160，胰蛋白胨15～18，KH₂PO₄ 0.1～0.5，K₂HPO₄0.1～0.5，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5，CaCl₂ 0.05～0.1，MnCl₂ 0.001～0.002，KNO₃ 0.5～0.8，NaCl0.01～0.02，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.02，溴甲酚绿0.01-0.02。

初筛培养基以g/L计：葡萄糖150～160，胰蛋白胨15～18，KH₂PO₄ 0.1～0.5，K₂HPO₄0.1～0.5，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5，CaCl₂ 0.05～0.1，MnCl₂ 0.001～0.002，KNO₃ 0.5-0.8，NaCl 0.01～0.02，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.02。

复筛培养基以g/L计：葡萄糖50～55，胰蛋白胨6～8，KH₂PO₄ 0.1～0.5，K₂HPO₄ 0.1～0.5，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5，CaCl₂ 0.05～0.1，MnCl₂ 0.001～0.002，KNO₃ 0.5-0.8，NaCl0.01～0.02，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.02。

种子培养基以g/L计：葡萄糖50～55，酵母粉10～12，KH₂PO₄ 0.5～0.8，KH₂PO₄ 0.5～0.8，NaCl 0.1～0.5。

发酵培养基以g/L计：葡萄糖150～160，胰蛋白胨6～8，KH₂PO₄ 0.1～0.5，K₂HPO₄0.1～1，MgSO₄·7H₂O 0.1～1，CaCl₂ 0.05～0.1，MnCl₂ 0.001～0.01，KNO₃ 0.1～1，NaCl0.01～0.02，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.02。

实施例1：菌株的获得

(1)NTG诱变

①单孢子悬液制备：将出发菌株(NRRL3488)转接于PDA斜面30℃培养4天，长好孢子后，用0.05％吐温洗下孢子，用灭菌过的脱脂棉过滤，然后计数，取一定量置于预先灭菌的装有9mL的0.1mol/L pH 6.0的磷酸缓冲液的三角瓶中(含直径为0.1～0.3mm玻璃珠100个)，使单孢子悬液终浓度为10⁶个/mL。30～32℃，200r/min振荡60min，然后取孢子悬液0.8mL添加到5mL的离心管中，每个菌2支，共4支，备用。

②诱变反应：分别吸取0.2mL NTG母液分别加入5mL、含有0.8mL菌悬液的离心管中混匀，使NTG终浓度为1mg/mL，30℃，200rpm振荡培养(注意避光)30min和60min。

③终止反应：将含有处理液的离心管在10000rpm离心5min，弃去上清液，再加入3mL的生理盐水，10000rpm、离心5min，倒掉上清液，重复以上操作3次。

④涂布筛选：取0.5mL菌悬液进行梯度稀释到10²，吸取60μL涂布平板。30～32℃倒置培养1-4天左右，观察结果，然后挑取单菌落。

(2)常压室温等离子体(ARTP)诱变

A、诱变器具：酒精灯，打火机，5mL注射器(底部塞上1mm左右的棉花)，10μL无菌枪头，10μL无菌枪一把，ARTP育种仪载片6个，装有0.1g甘油和9mL水的50mL锥形瓶，100个直径为0.1～0.3mm的玻璃珠。

B、灭菌操作：枪头、移液器使用高压蒸汽灭菌121℃，30min，ARTP育种仪载片使用火焰灼烧灭菌。

C、制备菌悬液

取NTG筛选出的菌株制成孢子悬液，通过塞有棉花的5mL注射器过滤获得2mL过滤后的孢子悬液，在50mL的锥形瓶中稀释至10⁶个/mL，震荡培养3～4h，制得菌悬液备用。

D、ARTP诱变处理

取制备好的菌悬液10μL均匀涂抹至已灭菌冷却的小铁片上，并置入ARTP育种机，诱变功率100W，高纯氦气通气量10SLM，处理距离2mm，分别处理120、150、180s。

E、后培养

将处理后的小铁片取出，放入装有1mL无菌水的5mL离心管中，用涡旋振荡仪振荡菌体至少100s，使其彻底悬浮于离心管中，得到菌悬液。

(3)⁶⁰Coγ射线辐照

A、制备菌悬液

取上述经ARTP筛选得到的菌株参照以上方法制备得到菌悬液，备用。

B、⁶⁰Coγ射线辐照处理

将制备好的菌悬液分置于五支试管中，每管10mL，直接进行γ射线处理，辐照剂量分别为0、0.6、0.8和0.9kGy。

将⁶⁰Coγ射线辐照处理过的菌株分别同时通过下述方法进行筛选：

①放线菌酮平板筛选：

将经辐照处理后的菌悬液分别稀释至10^-2和10^-3浓度，取50～100μL涂布于筛选固体培养基(放线菌酮浓度为0.02g/200mL)。以不经诱变处理的菌悬液为对照组。将涂布好的平板置于30～34℃恒温培养箱中培养1～3天。从含有抑制剂的平板上挑取萌发快、变色圈大、菌落直径大、菌落菌丝粗短、菌落中央孢子密集的单菌落，进行步骤(4)的初筛。

②氯化锂平板筛选：

将经辐照处理后的菌悬液分别稀释至10^-2和10^-3浓度，取50～100μL涂布于筛选三种固体培养基(氯化锂1.5g/200mL)。以不经诱变处理的菌悬液为对照组。将涂布好的平板置于30～34℃恒温培养箱中培养1～3天。从含有抑制剂的平板上挑取萌发快、变色圈大、菌落直径大、菌落菌丝粗短、菌落中央孢子密集的单菌落，进行步骤(4)的初筛。

③鱼藤酮平板筛选：

将经辐照处理后的菌悬液分别稀释至10^-2和10^-3浓度，取50～100μL涂布于筛选三种固体培养基(鱼藤酮0.05g/200mL)。以不经诱变处理的菌悬液为对照组。将涂布好的平板置于30～34℃恒温培养箱中培养1～3天。从含有抑制剂的平板上挑取萌发快、变色圈大、菌落直径大、菌落菌丝粗短、菌落中央孢子密集的单菌落，进行步骤(4)的初筛。

(4)菌株的初筛：

根据平板菌落的形态，挑出最为符合高产菌形态特征的菌落(菌落直径相对更大、气生菌丝少、孢子生长密集、颜色相对更深)，转接马铃薯斜面培养基上，于30-34℃培养1～3天。待孢子长好后，分别接入2～3环斜面孢子至初筛培养基中。通过观察发酵过程中菌球大小、发酵液颜色变化，可适当淘汰部分劣势菌株；最后通过测定120h苹果酸产量(产量超过95～100g/L)、残糖含量及pH(pH处于6.15～6.30)，从而挑选出优良菌株。

(5)菌株的复筛：

将初筛筛选到的菌株使用6～7mL 0.05％吐温80把对应的斜面中的孢子洗下，血球计数板计数，按接种量为1.2-1.6×10⁶个/mL接种到复筛培养基中进行第一次复筛实验(每组3瓶平行样)，观察发酵过程中菌球大小是否均匀、发酵液颜色变化是否正常，同时通过测定120h苹果酸产量(产量超过75g/L)、残糖含量及pH(pH为6.20～6.27)，从中选出苹果酸高产的优势菌株。

步骤1：配制培养基

种子培养基以g/L计：葡萄糖50～55，酵母粉10～12，KH₂PO₄ 0.5～0.8，KH₂PO₄ 0.5～0.8，NaCl 0.1～0.5。

发酵培养基以g/L计：葡萄糖150～160，胰蛋白胨6～8，KH₂PO₄ 0.1～0.5，K₂HPO₄0.1～1，MgSO₄·7H₂O 0.1～1，CaCl₂ 0.05～0.1，MnCl₂ 0.001～0.01，KNO₃ 0.1～1，NaCl0.01～0.02，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.02。

PDA固体培养基以g/L计：土豆200～300，琼脂粉20～25。

步骤2：种子制备

150mL种子培养基装于500mL三角瓶中置于121℃灭菌15～30min。菌株保藏于终浓度为50％的甘油管中，分别取四种孢子悬浮液(原始菌株、NTG所得菌株，ARTP所得菌株，⁶⁰Coγ所得菌株)1～3mL接种到种子培养基中进行种子培养，32～37℃，200rpm培养20～30h，培养至种子培养基中的孢子数为10⁹～10¹⁰数量级。

步骤3：摇瓶发酵培养

种子培养基以10mL/100mL的转接量，接入装有45mL发酵培养基的250mL三角瓶中进行发酵培养。在32～37℃，200rpm条件下发酵120h，取发酵液离心，收集上清液用HPLC测定发酵液中的苹果酸含量。结果如图1所示，复筛菌株摇瓶产量可达到79.8g/L，将此菌株命名为FMME-S-38。

实施例2：菌株FMME-S-38的生理生化特性

(1)菌株形态鉴定

对筛选的菌株按《微生物分类学》进行生理生化特性鉴定(见下表1)：

表1菌落形态特征对比

(2)菌株分子生物学鉴定

ITS2 rDNA基因的PCR扩增与序列测定：以提取的基因组DNA为模板扩增ITS2rDNA，以通用PCR引物扩增ITS2区域序列750bp，并送至公司测序，将测序结果在NCBI上进行BLAST，与现有的基因序列比对。结果表明菌株FMME-S-38与Aspergillus oryzaeNRRL3488的ITS2 rRNA序列同源性最高，相似度达到98％，因而菌株FMME-S-38鉴定为米曲霉(Aspergillusoryzae)。

ITS2-F：5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'；

ITS2-R：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

实施例3：菌株FMME-S-38摇瓶生产苹果酸

将菌株FMME-S-38接种到150mL种子培养基中在32～37℃，200rpm培养20～30h培养，至种子培养基中的孢子数为10⁹～10¹⁰数量级，将种子培养基以10mL/100mL的接种量接种至发酵培养基(装有45mL发酵培养基的250mL三角瓶)，在32～37℃，200rpm条件下发酵120h，取发酵液离心，收集上清液用HPLC测定发酵液中的苹果酸含量。

(1)初始氮浓度优化

原始发酵培养基中的胰蛋白胨的浓度为7g/L，将其替换为5.5、6、6.5、7.5g/L，进行摇瓶发酵，结果如表2所示：在初始发酵培养基中的浓度为6～6.5g/L，时，苹果酸产量可达到130g/L及以上。

表2初始氮浓度的优化

(2)补氮浓度优化

基于最优的初始胰蛋白胨浓度为6.5g/L的情况下，在发酵18h时，添加胰蛋白胨作为氮源，对添加氮的浓度做优化，结果如表3所示：在发酵过程中补加2～3g/L(在发酵体系中的浓度)的胰蛋白胨，可使苹果酸产量提升至135g/L及以上。

表3补氮浓度优化

(3)补氮时间的优化

分别在发酵开始的第12、18、24、36h对发酵体系添加终浓度为3g/L的胰蛋白胨(一次性补加)，发酵120h，结果如表4所示：在发酵开始后第18～24小时补加胰蛋白胨，可使苹果酸的产量提升至140g/L。

表4补料时间的优化

(4)传代稳定性：

在将菌株传代6代，在相同的发酵条件下(具体实施方式参见步骤(3)，发酵第24小时进行补氮)，测定其生产苹果酸的产量，结果如表5所示：将FMME-S-38传代6次，其苹果酸产量及其他相关的性质稳定，因而具备较好的遗传稳定性。

表5菌株FMME-S-38传代稳定性

实施例4：FMME-S-38在30L发酵罐发酵

150mL种子培养基装于500mL三角瓶中置于121℃灭菌15～30min，将菌株FMME-S-38菌株接种到种子培养基中进行种子培养，32～37℃，200rpm培养20～30h，培养至种子培养基中的孢子数为10⁹～10¹⁰；

30L发酵罐中发酵培养基初始装液量为15L，种子转接量为1.5L(10mL/100mL)，温度为30～35℃，过程中pH维持6.1～6.8，搅拌550～650rpm，通气分为两阶段调控，发酵前期0～36h为3vvm，36h至发酵结束为1vvm；发酵培养基中的初始氮浓度为6.5g/L，在发酵开始后的第24小时补加终浓度为3g/L的胰蛋白胨。

发酵过程中取一定量的发酵液，用1～2M的盐酸稀释后离心，收集上清液用HPLC测定发酵液中的L-苹果酸含量。结果表6所示，发酵时间120h，L-苹果酸产量可达到154.2g/L，当发酵168小时，苹果酸产量可达到191.5g/L。

表6 30L发酵罐发酵结果

实施例5：菌株FMME-S-38的微生物菌剂的制备

将菌株FMME-S-38接种于PDA平板中，30℃下培养72h，待菌株FMME-S-38的孢子浓度达到10⁷cfu/mL以上时加入缓冲液(生理盐水或pH值为7的0.2M磷酸盐缓冲液)冲洗米曲霉孢子得到孢子悬液，在无菌环境下加入保护剂(15g/100mL的葡萄糖溶液)，得到菌剂。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.米曲霉（Aspergillusoryzae），已于2020年7月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020294。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1所述米曲霉。

3.一种生产苹果酸的方法，其特征在于，用权利要求1所述米曲霉或权利要求2所述微生物菌剂发酵生产苹果酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述米曲霉在单位体积mL或单位质量g的发酵体系中孢子个数处于10⁵~10⁷数量级。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵体系中的氮源包括胰蛋白胨，所述胰蛋白胨的初始浓度为6~6.5g/L。

6.一种提高苹果酸产量的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的米曲霉或权利要求2所述的微生物菌剂，转化生成苹果酸；所述方法控制发酵初始时胰蛋白胨浓度为6~6.5g/L；在发酵第18~24时补加胰蛋白胨；补加的胰蛋白胨在发酵体系中的浓度为2~3 g/L。

7.权利要求1所述米曲霉，或权利要求2所述微生物菌剂，或权利要求3~6任一所述方法在生产苹果酸中的应用。

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