CN102994484B - 一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺，更具体地，涉及一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基及方法。所述培养基的原料含有1w%可溶性淀粉或葡萄糖，1w%蛋白胨或酵母粉，4×10^-4mol/LBa²⁺或Ca²⁺，0.01w%Vc或VB₁，培养基初始pH=5.5-7.0。该方法通过将发酵种子液接种于所述培养基中，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量15mL，于26℃，转速160r/min下培养。本发明的发酵方法具有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基，具有几丁质酶产率高，几丁质酶活力高等优点。

Description

一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基及方法

技术领域

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基及方法。

背景技术

扁座壳孢(Aschersonia placenta Berk. et Br.)是子囊菌门、粪菌纲、肉座菌目、麦角菌科、座壳孢属的一个种，主要寄生在粉虱和介壳上，在南亚和东南亚等地方都有分布。在我国南方等省的自然生境和农业生态系统中造成粉虱群流行病，从而可以控制粉虱类害虫的发生与危害。

几丁质酶在微生物中的分布情况，细菌中有粘质沙雷氏菌，环状芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，斯氏假单孢菌，巨大芽孢杆菌，液化沙雷氏菌，液化肠杆菌，嗜水气单孢菌等。放线菌中有灰色链霉菌，红色链霉菌及其它一些未定种的链霉菌。真菌中有溜曲霉，球孢白僵菌，米曲霉和木霉等（关海宁等，2006）。从植物、动物、真菌和细菌中都能获取几丁质酶，但由于细菌具有快速生长和易进行基因操作的特性而倍受人们青睐。目前报道的产几丁质酶细菌类型很多（杨水英等， 2007）。在真菌几丁质酶相应领域也报道了一些研究结果。肖炎农等对植物线虫卵寄生真菌淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)几丁质酶研究，翟逸对莱氏野村菌(Nomuraea rileyi)CQ031021几丁质酶的研究，张洁等球孢白僵(Beauveria bassiana)Bb174以麸皮:蚕蛹粉(4:1)、蛋白胨1g/L作为产酶最适培养基，在7.5 g 培养基中接种3ml液态种子，自然pH下28℃培养2d ,酶活可达最高，为126U/g (干培养基)。

目前，对虫生真菌几丁质酶的应用主要集中在对害虫的生物防治和几丁质、壳聚糖等生物资源的开发利用方面。在生物防治方面，主要通过基因工程方法来克隆表达一些具有很强的致病作用的真菌几丁质酶，或者通过将虫生真菌几丁质酶基因构建转化到植株中来提高植物对虫害的抗性，在这两方面都已经取得了较大进展。国内、外已经对很多虫生真菌的几丁质酶基因进行了克隆，特别是白僵菌、绿僵菌和蜡蚧菌的几丁质酶表现出良好的致病性作用。这些研究的目的是为了解决昆虫病原真菌杀虫速率缓慢的弱点，以期从分子生物水平上提高菌株的杀虫毒力，在最大程度上发挥真菌在害虫控制上的优势及潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基及方法。

本发明首先提供了一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基，所述培养基的原料含有1w%可溶性淀粉或者葡萄糖，1w%蛋白胨或者酵母粉，4×10^-4mol/L Ba²⁺或者Ca²⁺，0.01w%Vc或者VB₁，培养基初始pH=5.5-7.0。

更优选地，所述培养基的原料按重量分数计，1w%可溶性淀粉，1w%蛋白胨，4×10^-4mol/L Ba²⁺，0.01w%Vc，培养基初始pH=7.0。

其次，本发明还提供了一种扁座壳孢发酵产几丁质酶的方法，所述方法包含以下步骤：

（a）将扁座壳孢接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液接种于所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量15mL，于26℃，转速160 r/min下培养。

所述种子培养基的原料含有：200g/L土豆，葡萄糖20g/L，自然pH。

本发明采用的座壳孢为扁座壳孢(何学友等，油茶黑胶粉虱及扁座壳孢对其自然控制作用，中国森林病虫，2011年7月)。

采用本发明优化后的培养基，菌龄4d，发酵周期4d，发酵产生结果扁座壳孢产几丁质酶的酶活为4.0U/mL以上。

本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基，具有几丁质酶产率高，几丁质酶活力高等优点。

附图说明

图1 为NAG标准曲线；

图2 为不同碳源对产酶的影响；

图3 为不同氮源对产酶活性的影响。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

单因素实验确定培养基最优成分

（1）种子培养和基础培养基的配制：土豆200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL，自然pH， 分装于250mL的三角瓶，每个三角瓶含150mL。1.01MPa，灭菌20min。

（2）发酵种子的制作：将扁座壳孢接种于土豆琼脂培养基上，于25℃下培养5d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，26℃，转速160 r/min下培养4d，即为发酵液。

（3）酶液的制备：取步骤（2）中的发酵液在4℃下，5000 r/min离心，15min，得上清液即为粗酶液，待用。按酶活性测定在波长550nm处测定吸光值。换算成酶活单位U/mL。

（4）几丁质酶酶活测定：取1mL发酵上清液加入1mL磷酸盐缓冲液（0.2mol/L）（pH7.0）和50mL 5%胶体几丁质中（以不加胶体几丁质的上清液作为对照），37℃水浴1h，加入2mL DNS（二硝基水杨酸）（浓度为0.025 mol/L，下同）试剂终止反应，沸水浴10min后冷却，离心后取上清液在波长550nm下测紫外吸光度，计算出产生的N-乙酰氨基葡萄糖的含量。酶活力（U/g或U/mL）=A×K×V×n/(t×m)（A为样品的吸光度；K为吸光常数；V为反应试剂的总体积；n为酶液的稀释倍数；t为反应时间；m为酶液质量或体积，g或mL）。

（5）标准曲线的制作：N-乙酰葡萄糖胺（NAG）标准曲线的制定：在0～100μg/mL范围内，以550nm处的吸光值为横坐标（X）、N-乙酰葡萄糖胺（NAG）的浓度为纵坐标（Y）制定标准曲线。具体步骤如下：

a. 用超纯水配置浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、90和100μg/mL的NAG ；

b. 取上述浓度的NAG溶液各1mL分别与2mL DNS显色剂混合并沸水浴10min；

c. 反应完毕后，测定反应液在550nm处的吸光值，在上述反应体系中以超纯水取代NAG为空白对照。试验设置3个重复，其平均值用于制作标准曲线。根据待测样的吸收值在标准曲线上找到相应NAG的量，便可计算出样品中几丁质酶的活性。结果见图1。

（6）不同碳源、氮源对产几丁质酶的影响

（a）碳源对酶产量的影响，在粉状几丁质2% (w/v）、KH₂PO₄ 0.1 w %、MgSO₄·7H₂O 0.05 w %、NaCl 0.02 w %、pH6.5的培养基中分别添加1%的蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、D-山梨醇、麦芽糖、胶体几丁质、L-阿拉伯糖、海藻糖，分别接入5mL的扁座壳孢菌液，在26℃、160 r/min的摇床中培养4d，检测发酵液中几丁质酶活性。结果见图2。

（b）氮源对酶产量的影响，在粉状几丁质2% (w/v）、KH₂PO₄ 0.1 w %、MgSO₄·7H₂O 0.05 w %、NaCl 0.02 w %、pH6.5的培养基中分别添加1%的酵母浸粉、蛋白胨、牛肉浸膏、干酪素、KNO₃、(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、Ca(NO₃)₂，分别接入5mL的扁座壳孢菌液，在26℃、160 r/min的摇床中培养4d，检测发酵液中几丁质酶活性。结果见图3。

结果：

碳源对酶产量的影响的实验结果：从图2分析，不同碳源对扁座壳孢产几丁质酶有不同的影响，不同处理产酶活性分别是：葡萄糖1.39 U/mL、可溶性淀粉1.35 U/mL、麦芽糖0.70 U/mL、L-阿拉伯糖0.59 U/mL，最低的是海藻糖酶活0.45 U/mL，最高的葡萄糖是最低的将近3倍，所以葡萄糖对扁座壳孢产几丁质酶有较大的影响（图2）。

氮源对酶产量的影响的实验结果：从图3分析，不同的氮源对扁座壳孢产几丁质酶的影响不同，产酶最大的蛋白胨达到了酶活最高值为1.69 U/mL，酵母粉、NH₄Cl、干酪素酶活分别是1.39 U/mL、1.38 U/mL、1.10 U/mL，最低的是(NH₄)₂SO₄0.49 U/mL，有机氮源比无机氮源更有利于扁座壳孢产几丁质酶。因此，蛋白胨为扁座壳孢产酶的最佳氮源（图3）。

实施例2

正交实验确定最优发酵条件

（1）正交实验确定最佳培养基

分别选取不同碳源、氮源、金属离子、维生素和pH值（表1），配置不同的培养基，方法同实施例1中步骤（1）、（2）。见表1，将相同量的接种量（10%）菌种接种于250mL，装有50mL培养液，在26℃，转速160 r/min下培养培养4d。然后按实施例1步骤（3）、（4）测定酶活。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。

表1扁座壳孢几丁质酶五因子四水平（4⁵）正交实验设计

表2扁座壳孢几丁质酶五因子四水平（4⁵）正交实验设计实验结果

注:K1 为各因素水平1的所有酶活力之和，K2 为各因素水平2的所有酶活力之和，K3为各因素水平3的所有酶活力之和，K4为各因素水平4的所有酶活力之和，R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。

正交实验中，筛选出了较有利于产酶的培养基。最高酶活力达到2.63U/mL，相应水平的碳源、氮源、金属离子、维生素、pH分别是可溶性淀粉、蛋白胨、Ba²⁺、Vc、pH7.0，即A₂B₁C₂D₃E₄。正交实验结果分析该培养基最有助于产酶(表1)。从表1可见，氮源对产酶影响最大，pH的改变对产酶作用最小。

正交实验确定最优培养条件

在从正交实验确定的最优培养基的基础上，通过设定不同接种量，装液量，菌龄，培养时间（见表3），在26℃，转速160 r/min下培养。然后按实施例1步骤（3）、（4）测定酶活。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。

表3扁座壳孢几丁质酶四因子三水平（3⁴）正交实验

表4扁座壳孢几丁质酶四因子三水平（3⁴）正交实验设计实验结果

注: K1 为各因素水平1的所有酶活力之和，K2 为各因素水平2的所有酶活力之和，K3为各因素水平3的所有酶活力之和， R为极差，酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。

总结了4个因子(接种量、装液量、菌龄、培养时间)对扁座壳孢几丁质酶产生的影响。由表4可知，最高酶活力达到4.06U/mL，其相应的实验条件A₁B₂C₂D₂(接种量5ml，装液量80ml，菌龄4d，培养时间4d)。但由表4可见，正交实验分析结果表明最有利于产酶的条件是A₃B₁C₂D₂，即有利于产酶的接种量、装液量、菌龄和培养时间分别为15mL、50mL、4d和4d。由表4的极差R值可知，培养条件中，装液量(14.7 ml)对产酶影响最大，相对而言，接种量对产酶作用最小。

实施例3

扁座壳孢产几丁质酶发酵方法

（1）   发酵种子的制备

（A）菌种和培养基

菌种：扁座壳孢；

斜面培养基：PDA培养基；

液体种子培养基：土豆200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL，自然pH，1.01MPa，灭菌20min。

（B）种子液制备

将斜面上的纯种扁座壳孢转接到多个250mL三角瓶中，其中装有100mL培养基，然后在27℃，在往复式震荡摇床转速160 r/min下培养培养4d，带菌丝生长健壮，菌液呈粘稠状时，说明种子已经生长好了。

（2）   发酵培养

发酵培养基：按照培养基优化正交实验结果配制，即1g可溶性淀粉，1g 蛋白胨，0.083g BaCl₂ (4×10^-4mol/L Ba²⁺)， 0.01g Vc，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，1.01MPa，灭菌20min。

将上一步骤中制备的扁座壳孢发酵种子液，按培养条件正交实验得出的最佳条件，接种量15mL接种于250mL三角瓶中，瓶中装有50mL发酵培养液；

摇床温度：26℃±1℃，转速160 r/min；

发酵周期：4d；

发酵产生结果：扁座壳孢生产几丁质酶的酶活为4.0U/mL以上，该实施例表明本发明的摇瓶实验工艺良好。

Claims (3)

1.一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的培养基，其特征在于，所述培养基的原料按重量分数计，配方为：1w%可溶性淀粉，1w%蛋白胨，4×10^-4mol/L Ba²⁺，0.01 w %Vc，培养基初始pH=7.0。

2.一种扁座壳孢发酵生产几丁质酶的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

（a）将扁座壳孢接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液接种于如权利要求1所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为50mL，接种量15mL，于26℃，转速160 r/min下培养。

3.如权利2所述扁座壳孢发酵生产几丁质酶的方法，其特征在于，所述种子培养基的原料含有：200g/L土豆，葡萄糖20g/L。