CN102660493B - 木霉菌产孢培养基及产孢方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种木霉菌产孢培养基及产孢方法。该木霉菌产孢培养基由果糖、木糖和一种基本培养基(酵母提取物、酒石酸铵、硝酸铵、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、氯化钠、二水合氯化钙、七水合硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠和水)组成。分别以果糖和木糖为碳源，以酒石酸铵和酵母提取物为氮源；加入的无机盐具有构成微生物细胞的组成成分，并具有调节酶活性及细胞的渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位等功能；其中的磷酸氢盐调节培养基的酸碱度，维持该菌生长的最适pH值；满足了该菌的生长需要。本发明的产孢方法为22～28℃，光照培养。本发明的胡桃球内生真菌木霉菌产孢培养基培养五天产孢量可达到7.4×107个孢子/毫升培养基。

Description

木霉菌产孢培养基及产孢方法
技术领域
本发明涉及一种胡桃楸内生真菌高效的产孢方法，特别是木霉菌产孢培养基及产孢方法。
背景技术
该内生真菌是从胡桃楸树皮部分离得到的其发酵产物具有抗癌活性的菌株，进行初步鉴定该菌为半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，木霉菌属。对该菌的发酵产物进行抗癌活性检测，其发酵产物能显著抑制肝癌细胞的生长，发酵液抗癌能力与1mg/L紫杉醇溶液基本相当。因此研究该木霉菌的分生孢子对其发酵产物抗癌活性和其机理的研究及其菌种的保藏具有重要的作用。目前，该木霉菌(木霉菌属长枝木霉(Trichoderimalongibrachiatm)保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M208102；该菌株已经在中国专利CN101487022中公开。)为受专利保护的本实验室独有菌种，因此国内外尚无关于该种木霉菌产孢培养方法的报道，真菌通用的培养基不能很好的满足该菌的产孢要求，这极大地限制了对该种胡桃楸内生真菌以及其发酵产生的抗癌物质的进一步深入研究。
发明内容
本发明目的在于提供一种木霉菌的产孢培养基及产孢条件。本发明的胡桃球内生真菌木霉菌产孢培养基及产孢条件能很好的满足该菌种的产孢要求，培养五天产孢量可达到7.4×107个孢子/毫升培养基。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明涉及一种木霉菌的产孢培养基，该培养基含有以下重量百分比的物质：0.5～5％果糖，0.5～5％木糖以及90～99％的基本培养基。
优选地，所述基本培养基含有以下重量百分比的物质：0.025～2.5％酒石酸铵、0.005～0.5％酵母提取物、0.005～0.5％硝酸铵、0.005～0.5％磷酸二氢钾、0.0025～0.25％七水合硫酸镁、0.0005～0.05％氯化钠、0.00065～0.065％二水合氯化钙、0.01～1％七水合硫酸亚铁、0.01205～1.205％乙二胺四乙酸二钠、0.04～4％琼脂，余量为水。
本发明还涉及一种木霉菌的产孢方法，包括斜面菌种的制备，发酵种子的制备和产孢培养基配制及产孢工艺步骤，产孢培养基配制时，将前述的产孢培养基中含有的物质按重量百分比含量混合溶解后在100～140℃，高压灭菌20～60分钟；产孢工艺步骤为：将前述的产孢培养基分装到250ml三角瓶中，每瓶10～25毫升，4℃保藏备用；吸取已保藏的孢子悬液或已培养好的该菌菌球置于产孢培养基中；产孢条件为：温度22～28℃，每天光照时间0～15小时。
本发明的有益效果在于：
1、本发明产孢培养基中各物质性能稳定，分别以果糖和木糖为碳源，以酒石酸铵和酵母提取物为氮源，提供了该菌产孢的碳元素和氮元素；加入的无机盐具有构成微生物细胞的组成成分，并且具有调节酶活性及细胞的渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位等功能；其中的磷酸氢盐调节培养基的酸碱度，维持该菌生长的最适PH值；满足了该菌的生长需要。
2、本发明的产孢条件温和，容易控制。
3、本发明的胡桃球内生真菌木霉菌产孢培养基培养五天产孢量可达到7.4×107个孢子/毫升培养基。
附图说明
图1为孢子数量与培养时间之间关系的曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
以下实施例及对比例中选用的木霉菌为木霉菌属长枝木霉(Trichoderimalongibrachiatm)，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M208102；该菌株已经在中国专利CN101487022中公开。
对比例1
真菌通用培养基-PDA培养基各原料含量关系如下：
Figure BDA0000152531930000021
Figure BDA0000152531930000031
产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在120℃、高压灭菌40分钟，4℃保藏备用；
产孢条件：200微升孢子悬液或直径约5毫米左右的菌球接种到含有20毫升固体培养基的三角瓶中，室温，每天光照时间10小时，培养5天。培养五天产孢量可达到2.3×106个孢子/毫升培养基。
对比例2
产孢培养基各原料含量关系如下：
Figure BDA0000152531930000032
产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在120℃、高压灭菌40分钟，4℃保藏备用；
产孢条件：200微升孢子悬液或直径约5毫米大小的菌球接种到含有20毫升固体培养基的三角瓶中，室温，每天光照时间10小时，培养5天。培养五天产孢量可达到1.4×105个孢子/毫升培养基。
实施例1
一种木霉菌产孢培养基各原料含量关系如下：
Figure BDA0000152531930000033
产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在120℃、高压灭菌40分钟，4℃保藏备用；
产孢条件：200微升孢子悬液或直径约5毫米大小的菌球接种到含有20毫升产孢培养基的三角瓶中，室温，每天光照时间10小时，培养5天。该木霉菌的孢子数量与培养时间之间关系的曲线图如图1所示，由图1可知：培养五天产孢量可达到7.4×107个孢子/毫升培养基。
由实施例1与对比例2的比较可知，实施例1的采用果糖和木糖作为碳源的产孢培养基，培养五天产孢量可达到7.4×107个孢子/毫升培养基，其效果远高于对比例2的采用葡萄糖作为碳源的产孢培养基(培养五天产孢量为1.4×105个孢子/毫升培养基)。
由实施例1与对比例1的比较可知，本发明的产孢培养基的产孢效果高于真菌通用培养基-PDA培养基的产孢效果(培养五天产孢量为2.3×106个孢子/毫升培养基)。
实施例2
产孢培养基各原料含量关系如下：
Figure BDA0000152531930000042
产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在100℃、高压灭菌60分钟，4℃保藏备用；
产孢条件：200微升孢子悬液或直径约5毫米大小的菌球接种到含有20毫升固体培养基的三角瓶中，22℃，培养5天。培养五天产孢量可达到1.2×107个孢子/毫升培养基。
实施例3
产孢培养基各原料含量关系如下：
Figure BDA0000152531930000052
产孢培养基配制时，将上述各物质按重量百分比含量混合溶解后在140℃、高压灭菌20分钟，4℃保藏备用；
产孢条件：200微升孢子悬液或直径约5毫米大小的木霉菌菌球接种到含有20毫升固体培养基的三角瓶中，28℃，每天光照时间15小时，培养5天。培养五天产孢量可达到5.2×106个孢子/毫升培养基。

Claims (2)

1.一种木霉菌的产孢培养基，其特征在于，所述产孢培养基含有以下基于所述产孢培养基总重的重量百分比的物质：0.5～5％果糖，0.5～5％木糖以及90～99％的基本培养基；
所述基本培养基含有以下基于所述基本培养基总重的重量百分比的物质：0.025～2.5％酒石酸铵、0.005～0.5％酵母提取物、0.005～0.5％硝酸铵、0.005～0.5％磷酸二氢钾、0.0025～0.25％七水合硫酸镁、0.0005～0.05％氯化钠、0.00065～0.065％二水合氯化钙、0.01～1％七水合硫酸亚铁、0.01205～1.205％乙二胺四乙酸二钠、0.04～4％琼脂，余量为水。
2.一种木霉菌的产孢方法，包括斜面菌种的制备，发酵种子的制备和产孢培养基配制及产孢工艺步骤，其特征在于，产孢培养基配制时，将权利要求1所述的产孢培养基中含有的物质按重量百分比含量混合溶解后在100～140℃、高压灭菌20～60分钟，保藏备用；产孢工艺步骤为：吸取已保藏的孢子悬液或已培养好的木霉菌菌球置于所述产孢培养基中，其中产孢条件为：温度22～28℃，每天光照时间0～15小时。
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大肠杆菌积累丙酮酸的研究;王佶;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20080915(第9期);正文第39页第3.3.1节、第48页倒数第2段 *
王佶.大肠杆菌积累丙酮酸的研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》.2008,(第9期),正文第39页第3.3.1节、第48页倒数第2段.

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