CN100381557C - 金龟子绿僵菌固态发酵的培养方法 - Google Patents

金龟子绿僵菌固态发酵的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明是一种金龟子绿僵菌固态发酵的培养方法，包括配制金龟子绿僵菌孢悬液并接种在固态反应器中的固态发酵培养基上进行固态发酵培养，收集金龟子绿僵菌分生孢子粉后干燥作为成品，固态发酵培养基主要原料为甘蔗渣，并配以一定的辅料及营养盐，按重量份计包括如下成分组成：甘蔗渣15～50份、玉米粉1～25份、水10～55份、硫酸铜0.001～0.01份、硫酸镁0.01～0.2份、磷酸二氢钾0.01～0.2份。本发明生产工艺简单，甘蔗渣原料成本不高；培养时间缩短；发酵过程中甘蔗渣固体形态保持较好，疏松度较大，孔隙率较高，易于传热传质，有利于深层固态发酵中过程控制；易收集孢子；生产可以实现规模化，可减缓对环境的污染。

Description

金龟子绿僵菌固态发酵的培养方法
技术领域
本发明涉及生物发酵工程技术领域，具体地指一种用甘蔗渣作为培养基的金龟子绿僵菌固态发酵的培养方法。
背景技术
微生物防治害虫最早可追溯到上世纪初，俄国人梅契尼可夫就利用绿僵菌防治金龟子幼虫，但直到上世纪50年代，“以菌治虫”的研究和生产才得到迅速发展。化学防治虽具有防效高、速度快、防治谱广、成本低、使用简便等优点，但由于化学杀虫剂大规模地生产和无限制地大量使用，严重地污染了人类环境和农林牧产品，危害了人畜健康和水资源，并使害虫产生抗性，天敌消失，自然生态系统遭到破坏。而微生物杀虫剂具有对人畜安全、对天敌昆虫无害、选择性高、对生态系统影响小、不易产生抗药性等特点，因此世界各国越来越强调应用昆虫病原体作杀虫剂。其中，金龟子绿僵菌(Metarhiziumanisopliae)是一种广谱虫生真菌，具有寄主范围广、致病力强、对人、畜、农作物无毒、无残毒、菌剂易生产、后效期长等优点，具有广泛的应用前景。
目前，金龟子绿僵菌液态发酵生产工艺研究较多，但固态发酵生产工艺研究相对较少。供固态发酵的基质通常有麸皮、米糠等。金龟子绿僵菌在此类基质上进行生长、繁殖并产生代谢产物，会受到基质的物理因素(底物颗粒大小、形状、空隙率、纤维含量、黏度、颗粒之间扩散率等)和化学因素(聚合度、疏水性、结晶度及电化学性质等)的影响，麸皮、玉米粉等混合培养基经过高温灭菌后，存在着粘度增加(影响传质传热)、疏松度不够、孔隙率低、后续接种(过程控制)困难等情况。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述现有技术中存在的不足之处，提供一种金龟子绿僵菌固态发酵的培养方法。该方法采用甘蔗渣作为培养基原料及载体，克服了采用麸皮、米糠等混合培养基在发酵过程中所遇到的疏松度不够、孔隙率低、影响传质传热、过程控制较难等问题。
本发明通过如下技术方案来实现：本发明所述金龟子绿僵菌固态发酵的培养方法，包括配制金龟子绿僵菌孢悬液并接种在固态反应器中的固态发酵培养基上进行固态发酵培养，收集金龟子绿僵菌分生孢子粉后干燥作为成品，所述固态发酵培养基主要原料为甘蔗渣，并配以一定的辅料及营养盐，按重量份计由如下成分组成：甘蔗渣15～50份、玉米粉1～25份、水10～55份、硫酸铜0.001～0.01份、硫酸镁0.01～0.2份、磷酸二氢钾0.01～0.2份。
为了更好地实现本发明，所述金龟子绿僵菌孢悬液首先在固态发酵培养基上培养固态发酵生产种，再将所述固态发酵生产种接种在固态反应器中的固态发酵培养基上进行固态发酵培养；所述固态发酵种子的接种量为固态反应器中固态发酵培养基总重量的1～15％；所述固态反应器中通入0～5vvm(m3空气/m3培养基·min)的无菌空气。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
本发明生产工艺简单，设备条件要求不高，且甘蔗渣原料来源广泛、集中、成分单一、质量可控、不需分选处理，生产成本不高；培养时间缩短；发酵过程中甘蔗渣固体形态保持较好，疏松度较大，孔隙率较高，易于传热传质，有利于深层固态发酵中过程控制；发酵结束时，基料干燥后，孢子粉易与甘蔗渣分离易收集孢子；生产可以实现规模化，可减缓对环境的污染。因此，本发明的生产工艺有着切实的经济效益和实用价值。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。
在本发明的各实施例中，所用金龟子绿僵菌菌种(Metarhizium anisopliae)为公知公用的菌种。
实施例一
第一步生产种的培养
1、金龟子绿僵菌孢悬液的配制
将保藏在PDA斜面的金龟子绿僵菌菌种活化，在27℃培养3天，产生大量橄榄绿色分生孢子。在超净工作台上用已灭菌的0.05％吐温-80洗出孢子，转移到无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡2小时，显微镜检查，孢子分散即可，纱布过滤除去菌丝，调整分生孢子浓度至105～106孢子/ml。此金龟子绿僵菌孢悬液作为母种。
2、固态发酵生产种的制备
以20克甘蔗渣、1克玉米粉、15克水、0.01克KH2PO4、0.01克MgSO4、0.001克CuSO4混合成固态发酵培养基，调节pH值为5.5，放入250ml的三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，覆盖八层纱布；121℃蒸汽灭菌30～45分钟；冷却后在超净工作台上接入孢悬液，于27℃、相对湿度60～70％的黑暗条件下培养3天，培养固态发酵生产种。
第二步 固态反应器中的培养
在10L固态反应器中加入与前述相同配比的固态发酵培养基，调节pH值为6.0，121℃蒸汽灭菌30～45分钟。冷却后，在黑暗培养室内，将占固态发酵培养基总重量的1％固态发酵生产种接入反应器中，置于26℃、相对湿度60～70％的条件下，前12小时通入通气率为0vvm、12～24小时通入通气率为3vvm、24小时之后通入通气率为2vvm的无菌空气，进行固态发酵培养，培养5天，产孢量达到1.2×109孢子/g干培养基。
第三步80目过筛收集固态发酵生产的金龟子绿僵菌分生孢子，将其放入真空干燥箱内进行干燥，温度设为25℃，干燥24小时后取出，测得其含水率为5.7％。
实施例二
第一步生产种的培养
1、金龟子绿僵菌孢悬液的配制
将保藏在PDA斜面的金龟子绿僵菌菌种活化，在27℃培养5天，产生大量橄榄绿色分生孢子。在超净工作台上用已灭菌的0.05％吐温-80洗出孢子，转移到无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡3小时，显微镜检查，孢子分散即可，纱布过滤除去菌丝，调整分生孢子浓度至105～106个孢子/ml。此金龟子绿僵菌孢悬液作为母种。
2、固态发酵生产种的制备
以15克甘蔗渣、25克玉米粉、10克水、0.1克KH2PO4、0.05克MgSO4、0.01克CuSO4混合成固态发酵培养基，调节pH值为6.5，放入250ml的三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，覆盖八层纱布；121℃蒸汽灭菌30～45分钟；冷却后在超净工作台上接入孢悬液，于27℃、相对湿度60～70％的光照条件下培养3天。
第二步 固态反应器中的培养
在10L固态反应器中加入与前述相同配比的固态发酵培养基，调节pH值为5.5，121℃蒸汽灭菌30～45分钟。冷却后，在黑暗培养室内，将占固态发酵培养基总重量的2％固态发酵生产种接入反应器中，置于24℃、相对湿度60～70％的条件下，前12小时通入通气率为0vvm、12～24小时通入通气率为5vvm、24小时之后通入通气率为1vvm的无菌空气，进行固态发酵培养，培养5天，产孢量达到4.0×109孢子/g干培养基。
第三步  80目过筛收集固态发酵生产的金龟子绿僵菌分生孢子，将其放入真空干燥箱内进行干燥，温度设为24℃，干燥24小时后取出，测得其含水率为6.2％。
实施例三
第一步生产种的培养
1、金龟子绿僵菌孢悬液的配制
将保藏在PDA斜面的金龟子绿僵菌菌种活化，在27℃培养4天，产生大量橄榄绿色分生孢子。在超净工作台上用已灭菌的0.05％吐温-80洗出孢子，转移到无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡2小时，显微镜检查，孢子分散即可，纱布过滤除去菌丝，调整分生孢子浓度至105～106个孢子/ml。此金龟子绿僵菌孢悬液作为母种。
2、固态发酵生产种的制备
以50克甘蔗渣、15克玉米粉、55克水、0.2克KH2PO4、0.1克MgSO4、0.005克CuSO4混合成固态发酵培养基，调节pH值为6.0，放入250ml的三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，覆盖八层纱布；121℃蒸汽灭菌30～45分钟；冷却后在超净工作台上接入孢悬液，于27℃、相对湿度60～70％的黑暗条件下培养3天。
第二步 固态反应器中的培养
在10L固态反应器中加入与前述相同配比的固态发酵培养基，调节pH值为6.5，121℃蒸汽灭菌30～45分钟。冷却后，在光照条件下，将占固态发酵培养基总重量的15％固态发酵生产种接入反应器中，置于25℃、相对湿度60～70％的条件下，前12小时通入通气率为0vvm、12小时之后通入通气率为4vvm的无菌空气，进行固态发酵培养，培养4天，产孢量达到1.3×109孢子/g干培养基。
第三步  80目过筛收集固态发酵生产的金龟子绿僵菌分生孢子，将其放入真空干燥箱内进行干燥，温度设为24℃，干燥24小时后取出，测得其含水率为5.9％。
实施例四
第一步生产种的培养
1、金龟子绿僵菌孢悬液的配制
将保藏在PDA斜面的金龟子绿僵菌菌种活化，在27℃培养3天，产生大量橄榄绿色分生孢子。在超净工作台上用已灭菌的0.05％吐温-80洗出孢子，转移到无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡2小时，显微镜检查，孢子分散即可，纱布过滤除去菌丝，调整分生孢子浓度至105～106个孢子/ml。此金龟子绿僵菌孢悬液作为母种。
2、固态发酵生产种的制备
以30克甘蔗渣、5克玉米粉、25克水、0.05克KH2PO4、0.2克MgSO4、0.008克CuSO4混合成固态发酵培养基，调节pH值为7.5，放入250ml的三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，覆盖八层纱布；121℃蒸汽灭菌30～45分钟；冷却后在超净工作台上接入孢悬液，于24℃、相对湿度60～70％的黑暗条件下培养5天。
第二步 固态反应器中的培养
在10L固态反应器中加入与前述相同配比的固态发酵培养基，调节pH值为7.0，121℃蒸汽灭菌30～45分钟。冷却后，在黑暗培养室内，将占固态发酵培养基总重量的5％固态发酵生产种接入反应器中，置于30℃、相对湿度60～70％的条件下，前12小时通入通气率为0vvm、12小时之后通入通气率为2.5vvm的无菌空气，进行固态发酵培养，培养3天，产孢量达到1.8×1010孢子/g干培养基。
第三步80目过筛收集固态发酵生产的金龟子绿僵菌分生孢子，将其放入真空干燥箱内进行干燥，温度设为24℃，干燥24小时后取出，测得其含水率为5.8％。
实施例五
第一步生产种的培养
1、金龟子绿僵菌孢悬液的配制
将保藏在PDA斜面的金龟子绿僵菌菌种活化，在27℃培养3～5天，产生大量橄榄绿色分生孢子。在超净工作台上用已灭菌的0.05％吐温-80洗出孢子，转移到无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡2小时，显微镜检查，孢子分散即可，纱布过滤除去菌丝，调整分生孢子浓度至105～106个孢子/ml。此金龟子绿僵菌孢悬液作为母种。
2、固态发酵生产种的制备
以25克甘蔗渣、7.5克玉米粉、45克水、0.08克KH2PO4、0.03克MgSO4、0.009克CuSO4混合成固态发酵培养基，调节pH值为7.0，放入250ml的三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，覆盖八层纱布；121℃蒸汽灭菌30～45分钟；冷却后在超净工作台上接入孢悬液，于27℃、相对湿度60～70％的光照条件下培养3天。
第二步 固态反应器中的培养
在10L固态反应器中加入与前述相同配比的固态发酵培养基，调节pH值为6.0，121℃蒸汽灭菌30～45分钟。冷却后，在光照条件下，将占固态发酵培养基总重量的4.5％固态发酵生产种接入反应器中，置于30℃、相对湿度60～70％的条件下，前12小时通入通气率为0vvm、12～24小时通入通气率为2.5vvm、24小时之后通入通气率为1vvm的无菌空气，进行固态发酵培养，培养5天，产孢量达到5.0×109孢子/g干培养基。
第三步 80目过筛收集固态发酵生产的金龟子绿僵菌分生孢子，将其放入真空干燥箱内进行干燥，温度设为24℃，干燥24小时后取出，测得其含水率为6.1％。
实施例六
第一步 生产种的培养
1、金龟子绿僵菌孢悬液的配制
将保藏在PDA斜面的金龟子绿僵菌菌种活化，在27℃培养3天，产生大量橄榄绿色分生孢子。在超净工作台上用已灭菌的0.05％吐温-80洗出孢子，转移到无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡2小时，显微镜检查，孢子分散即可，纱布过滤除去菌丝，调整分生孢子浓度至105～106个孢子/ml。此金龟子绿僵菌孢悬液作为母种。
2、固态发酵生产种的制备
以40克甘蔗渣、10克玉米粉、35克水、0.15克KH2PO4、0.15克MgSO4、0.003克CuSO4混合成固态发酵培养基，调节pH值为5.5，放入250ml的三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，覆盖八层纱布；121℃蒸汽灭菌30～45分钟；冷却后在超净工作台上接入孢悬液，于26℃、相对湿度60～70％的黑暗条件下培养3天。
第二步 固态反应器中的培养
在10L固态反应器中加入与前述相同配比的固态发酵培养基，调节pH值为7.0，121℃蒸汽灭菌30～45分钟。冷却后，在黑暗培养室内，将占固态发酵培养基总重量的8％固态发酵生产种接入反应器中，置于28℃、相对湿度60～70％的条件下，进行固态发酵培养，通入0vvm的无菌空气，培养3天，产孢量达到5×1010孢子/g干培养基。
第三步 80目过筛收集固态发酵生产的金龟子绿僵菌分生孢子，将其放入真空干燥箱内进行干燥，温度设为24℃，干燥24小时后取出，测得其含水率为6.0％。
实施例七
第一步 生产种的培养
1、金龟子绿僵菌孢悬液的配制
将保藏在PDA斜面的金龟子绿僵菌菌种活化，在27℃培养3天，产生大量橄榄绿色分生孢子。在超净工作台上用已灭菌的0.05％吐温-80洗出孢子，转移到无菌的放有玻璃珠的三角瓶中，120rpm振荡2小时，显微镜检查，孢子分散即可，纱布过滤除去菌丝，调整分生孢子浓度至105～106孢子/ml。以此金龟子绿僵菌孢悬液直接作为生产种。
第二步 固态反应器中的培养
在10L固态反应器中加入与前述相同配比的固态发酵培养基，调节pH值为6.0，121℃蒸汽灭菌30～45分钟。冷却后，在黑暗培养室内，将占固态发酵培养基总重量的10％生产种接入反应器中，置于26℃、相对湿度60～70％的条件下，前12小时通入通气率为0vvm、12～24小时通入通气率为3vvm、24小时之后通入通气率为5vvm的无菌空气，进行固态发酵培养，培养5天，产孢量达到8.0×109孢子/g干培养基。
第三步 80目过筛收集固态发酵生产的金龟子绿僵菌分生孢子，将其放入真空干燥箱内进行干燥，温度设为25℃，干燥24小时后取出，测得其含水率为6％。
如上所述，即可较好地实现本发明。

Claims (4)

1.金龟子绿僵菌固态发酵的培养方法，包括配制金龟子绿僵菌孢悬液并接种在固态反应器中的固态发酵培养基上进行固态发酵培养，收集金龟子绿僵菌分生孢子粉后干燥作为成品，其特征是，所述固态发酵培养基为甘蔗渣培养基，按重量份计由如下成分组成：甘蔗渣15～50份、玉米粉1～25份、水10～55份、硫酸铜0.001～0.01份、硫酸镁0.01～0.2份、磷酸二氢钾0.01～0.2份。
2.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固态发酵的培养方法，其特征是，所述金龟子绿僵菌孢悬液首先在固态发酵培养基上培养固态发酵生产种，再将所述固态发酵生产种接种在固态反应器中的固态发酵培养基上进行固态发酵培养。
3.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固态发酵的培养方法，其特征是，所述固态发酵种子的接种量为固态反应器中的固态发酵培养基总重量的1～15％。
4.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固态发酵的培养方法，其特征是，所述固态反应器中通入0～5vvm的无菌空气。
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