CN103409327B - 一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法 - Google Patents

一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法。本发明提供的培养绿色木霉的方法，包括如下步骤：(1)将绿色木霉进行液体发酵，得到液体发酵产物；(2)将液体发酵产物进行固体发酵。本发明提供的绿色木霉的培养方法，生产工艺经济实用、生产效率高、投资少、占地小、生产可以实现规模化且无三废问题，适于大量推广应用，将产生巨大的经济效益。

Description

一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵应用技术领域，具体涉及一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法。
背景技术
香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌引起的一种土传毁灭性的病害，已严重危害到香蕉的生产及香蕉产业。目前综合防控技术是香蕉枯萎病防治的主要手段，木霉（Trichoderma spp.）作为一种重要的植病生防菌一直受到普遍关注。绿色木霉菌(Trichoderma viride)广泛地分布于自然界，可在多种营养基质上快速生长，对多种植物病原菌有重寄生作用，能有效地竞争营养和生存空间，还可以产生抗生素和攻击多种病原所需要的酶，所以被认为是一种很有开发潜力的生防菌。
现有的绿色木霉菌的培养方法都存在生产周期长、菌剂含孢量低、成本高的问题，阻碍了绿色木霉菌的生产进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种液固双相发酵生产绿色木霉的方法。
本发明提供的培养绿色木霉的方法，包括如下步骤：
（1）将绿色木霉进行液体发酵，得到液体发酵产物；
（2）将液体发酵产物进行以膨胀蛭石为载体的固体发酵。
所述液体发酵的条件可为：27-29℃，通入空气且通气量为9-11L/min，0.02-0.04Mpa。所述液体发酵的条件具体可为：28℃，通入空气且通气量为10L/min，0.03Mpa。所述液体发酵的发酵体系具体可为60-65L。
所述液体发酵可进行至发酵体系呈如下状态：有菌丝及液生孢子、无断裂的菌丝且菌丝体中无液泡。
所述液体发酵的时间可为65小时-72小时，具体可为65小时、68小时或72小时。
所述液体发酵是在液体发酵培养基中进行的；所述液体发酵培养基的制备方法如下：取蔗糖9-11g、玉米粉9-13g、NH4NO31.8-2.2g、大豆粕4-5.5g、MgSO4·7H2O0.8-1.2g和KH2PO42-4g，溶于水并用水定容至1000mL。所述液体发酵培养基的制备方法具体如下：取蔗糖10g、玉米粉9-13g、NH4NO32g、大豆粕4-5.5g、MgSO4·7H2O1g和KH2PO42-4g，溶于水并用水定容至1000mL。所述液体发酵培养基的制备方法具体如下：取蔗糖10g、玉米粉11g、NH4NO32g、大豆粕4.5g、MgSO4·7H2O1g，KH2PO43g，溶于水并用水定容至1000mL。所述液体发酵培养基的pH具体可为6.5。
所述固体发酵依次包括a阶段、b阶段和c阶段：
a阶段：在温度为23-25℃、湿度为93-97%的条件下培养；
b阶段：在温度为27-29℃、湿度为78-82%的条件下培养；
c阶段：在温度为25-27℃、湿度为38-42%的条件下培养。
所述a阶段具体可为：在温度为24℃、湿度为95%的条件下培养。所述b阶段具体可为：在温度为28℃、湿度为80%的条件下培养。所述c阶段具体可为：在温度为26℃、湿度为40%的条件下培养。所述a阶段中，培养时间可为2-3天。所述b阶段中，培养时间可为3天。所述c阶段中，培养时间可为1天。
所述以膨胀蛭石为载体的固体发酵是在固体发酵培养基中进行的；所述固体发酵培养基的制备方法如下：将300-400质量份膨胀蛭石、50-70质量份玉米粉、10-20质量份麸皮、0.8-1.2质量份KH2PO4、0.4-0.6质量份MgSO4和150-250份水混合均匀。所述固体发酵培养基的制备方法具体如下：将300-400质量份膨胀蛭石、50-70质量份玉米粉、10-20质量份麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和150-250份水混合均匀。所述固体发酵培养基的制备方法具体如下：将300质量份膨胀蛭石、50质量份玉米粉、10质量份麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和150质量份水混合均匀。所述固体发酵培养基的制备方法具体如下：将350质量份膨胀蛭石、60质量份玉米粉、15质量份麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和200质量份水混合均匀。所述固体发酵培养基的制备方法具体如下：将400质量份膨胀蛭石、70质量份玉米粉、20质量份麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和250质量份水混合均匀。
所述步骤（2）中，将18-22体积份所述步骤（1）得到的液体发酵产物接种至78-82体积份所述固体发酵培养基，即为所述固体发酵的初始时刻。所述步骤（2）中，将20体积份所述步骤（1）得到的液体发酵产物接种至80体积份所述固体发酵培养基，即为所述固体发酵的初始时刻。
所述步骤（1）中，具体可将所述绿色木霉的种子液接种至进行所述液体发酵培养基，即为所述液体发酵的初始时刻。所述步骤（1）中，具体可将4-6体积份种子液接种至94-96体积份所述液体发酵培养基。所述步骤（1）中，具体可将5体积份种子液接种至95体积份所述液体发酵培养基。所述种子液的菌浓度具体可为6.2-8.5×108CFU/mL，具体可为7×108CFU/mL。所述种子液的制备方法具体如下：将所述绿色木霉接种于PDA培养基平板，28℃培养至菌丝长满平板并产孢（通常需要4-5天），然后在液体种子培养基中接种平板菌种，接种量为每400ml液体种子培养基接种1/6培养皿平板菌种（培养皿规格为90mm），28℃、180rpm培养3-4天，得到种子液。所述液体种子培养基的制备方法具体为：取蔗糖20g、NH4NO35g、MgSO4·7H2O1.5g和KH2PO42.5g，溶于水并用水定容至1000mL。所述液体种子培养基的pH具体可为6.5。
所述膨胀蛭石具体可为粒径为3-5mm的膨胀蛭石。
所述麸皮具体可为小麦麸皮。
所述方法中还可包括如下步骤：将所述固体发酵的产物进行干燥，过筛（具体可为80目过筛）后，得到含水量为6%-10%的终产物。
所述绿色木霉具体可为绿色木霉（Trichoderma viride）H06CGMCC No.6229。绿色木霉（Trichoderma viride）H06，已于2012年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏编号为CGMCC No.6229。
所述固体发酵培养基中，利用膨胀蛭石为载体，玉米粉和麸皮为培养基质。生蛭石原矿经过高温焙烧后，成为膨胀蛭石。作为发酵载体，膨胀蛭石具有疏松基质，密度小，质量轻，吸水性好，隔热性好的优点。所述固体发酵的过程中还可包括翻料的步骤。所述固体发酵最好在无菌条件下进行。所述固体发酵具体可采用如下容器：一种培养架，腔内设有若干尼龙纱网隔层的柱体；所述固体培养体系置于位于所述尼龙纱网隔层上。
本发明提供了一种用于绿色木霉的固双相发酵培养法，该方法将液体发酵生产与固体发酵生产相结合，先利用液体培养快速生长的大量孢子、菌丝体，然后转接到固体营养基质上产生分生孢子，从而缩短绿色木霉产孢的生长周期，提高产率，避免前期污染。本发明提供的方法，生产工艺简单，显著减少了培养过程中的污染机率，缩短了发酵时间，而且不需要复杂设备。本发明提供的方法中，培养基的原料主要为农副产品，麸皮、玉米粉来源广泛、充足，成本低廉，易调控，成功率高。固体发酵中，以膨胀蛭石为发酵载体，明显改善了培养基的粘度、空隙率和疏松度，而且膨胀蛭石经过清洗、晾干还可以重复利用。综上所述，本发明提供的绿色木霉的培养方法，生产工艺经济实用、生产效率高、投资少、占地小、生产可以实现规模化且无三废问题，适于大量推广应用，将产生巨大的经济效益。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
绿色木霉（Trichoderma viride）H06，简称绿色木霉H06，分离自香蕉的根际土壤，已于2012年06月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），其保藏编号为CGMCCNo.6229。
膨胀蛭石：购于灵寿县金土矿产品加工厂，粒径为3-5mm。
实施例1、液固双相发酵培养绿色木霉菌
1、一级平板菌种培养
将绿色木霉H06接种于PDA培养基平板，28℃培养至菌丝长满平板并产孢（通常需要4-5天）。
PDA培养基：马铃薯200g、蛋白胨10g、葡萄糖20g、琼脂20g，用水定容至1000ml。
2、液体种子培养
在1000ml三角瓶中装入400ml液体种子培养基，然后接种步骤1得到的平板菌种，接种量为每个三角瓶接种1/6培养皿平板菌种（培养皿规格为90mm），28℃、180rpm培养3-4天，得到种子液（种子液中的菌浓度为7×108CFU/mL）。
液体种子培养基：取蔗糖20g、NH4NO35g、MgSO4·7H2O1.5g和KH2PO42.5g，溶于水并用水定容至1000mL；pH=6.5；121℃高压灭菌30分钟，冷却至40℃后用于接种。
3、液体发酵生产
在100升机械搅拌发酵罐中装入60升液体发酵培养基，然后接种步骤2得到的种子液，接种量为5%（即每5体积份种子液接种至95体积份液体发酵培养基）。
培养条件：28℃，通入空气且通气量为10L/min，保压0.03Mpa，培养65小时。
完成上述培养后，将发酵罐内的所有物质记作液体发酵产物。
液体发酵产物中出现大量菌丝及液生孢子，发酵液较粘稠，另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡，发酵液中无明显断裂的菌丝。
液体发酵培养基：取蔗糖10g、玉米粉11g、NH4NO32g、大豆粕4.5g、MgSO4·7H2O1g和KH2PO43g，溶于水并用水定容至1000mL；pH=6.5；121℃高压灭菌30分钟，冷却至40℃后用于接种。
4、固体发酵生产
培养架：腔内具有尼龙纱网隔层的四立柱架子，长3.2m、宽0.7m、高2.6m，用尼龙纱网隔成7层结构，层间距30cm，四立柱材质是碳钢喷塑。
固体发酵培养基：将300质量份膨胀蛭石、50质量份玉米粉、10质量份小麦麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和150质量份水混合均匀；自然pH；121℃蒸汽灭菌60分钟。
在经甲醛和高锰酸钾薰蒸灭菌的发酵室内，将液体发酵产物接种至固体发酵培养基并混合均匀，接种量为20%（即20体积份液体发酵产物接种至80体积份固体发酵培养基），然后将混合物置于发酵室内的培养架的尼龙纱网上，依次按如下阶段培养：
a阶段：在温度为24℃、湿度为95%（体积百分含量）的条件下培养，时间为2d，期间用塑料薄膜覆盖以保持湿度；该阶段为菌丝生长阶段，要求低温高湿；
b阶段：在温度为28℃、湿度为80%（体积百分含量）的条件下培养，时间为3d；期间用灭过菌的报纸覆盖以保持湿度；该阶段开始形成孢子，要求高温中湿；
c阶段：在温度为26℃、湿度为40%（体积百分含量）的条件下培养，时间为1d；期间不需要覆盖；该阶段菌要求高温低湿。
上述培养过程中，要经常进行翻料。
完成上述培养后，将容器内的所有物质记作固体发酵产物。
5、发酵产物的干燥
将固体发酵产物在发酵室里用空调和抽湿机干燥，80目过筛，得到终产物（经检测，含水量为6.0%）。
采用平板计数计算终产物中绿色木霉H06的孢子浓度，为1.39×1010个活性孢子/克终产物。
实施例2、液固双相发酵培养绿色木霉菌
1、一级平板菌种培养
同实施例1的步骤1。
2、液体种子培养
在1000ml三角瓶中装入400ml液体种子培养基，然后接种步骤1得到的平板菌种，接种量为每个三角瓶接种1/6培养皿平板菌种（培养皿规格为90mm），28℃、180rpm培养3-4天，得到种子液（种子液中的菌浓度为6.2×108CFU/mL）。
液体种子培养基：同实施例1的步骤2中的液体种子培养基。
3、液体发酵生产
在100升机械搅拌发酵罐中装入60升液体发酵培养基，然后接种步骤2得到的种子液，接种量为5%。
培养条件：25℃，通入空气且通气量为10L/min，保压0.03Mpa，培养68小时。
完成上述培养后，将发酵罐内的所有物质记作液体发酵产物。
液体发酵产物中出现大量菌丝及液生孢子，发酵液较粘稠，另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡，发酵液中无明显断裂的菌丝。
液体发酵培养基：取蔗糖10g、玉米粉9g、NH4NO32g、大豆粕4g、MgSO4·7H2O1g和KH2PO42g，溶于水并用水定容至1000mL；pH=6.5；121℃高压灭菌30分钟，冷却至40℃后用于接种。
4、固体发酵生产
培养架：腔内具有尼龙纱网隔层的四立柱架子，长3.2m、宽0.7m、高2.6m，用尼龙纱网隔成7层结构，层间距30cm，四立柱材质是碳钢喷塑。
固体发酵培养基：将350质量份膨胀蛭石、60质量份玉米粉、15质量份麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和200质量份水混合均匀；自然pH；121℃蒸汽灭菌60分钟。
在经甲醛和高锰酸钾薰蒸灭菌的发酵室内，将液体发酵产物接种至固体发酵培养基并混合均匀，接种量为20%，然后将混合物置于发酵室内的培养架的尼龙纱网上，依次按如下阶段培养：
a阶段：在温度为24℃、湿度为95%（体积百分含量）的条件下培养，时间为3d，期间用塑料薄膜覆盖以保持湿度；该阶段为菌丝生长阶段，要求低温高湿；
b阶段：在温度为28℃、湿度为80%（体积百分含量）的条件下培养，时间为3d；期间用灭过菌的报纸覆盖以保持湿度；该阶段开始形成孢子，要求高温中湿；
c阶段：在温度为26℃、湿度为40%（体积百分含量）的条件下培养，时间为1d；期间不需要覆盖；该阶段菌要求高温低湿。
上述培养过程中，要经常进行翻料。
完成上述培养后，将容器内的所有物质记作固体发酵产物。
5、发酵产物的干燥
将固体发酵产物在发酵室里用空调和抽湿机干燥，80目过筛，得到终产物（经检测，含水量为8%）。
实施例3、液固双相发酵培养绿色木霉菌
1、一级平板菌种培养
同实施例1的步骤1。
2、液体种子培养
在1000ml三角瓶中装入400ml液体种子培养基，然后接种步骤1得到的平板菌种，接种量为每个三角瓶接种1/6培养皿平板菌种（培养皿规格为90mm），28℃、180rpm培养3-4天，得到种子液（种子液中的菌浓度为8.5×108CFU/mL）。
液体种子培养基：同实施例1的步骤2中的液体种子培养基。
3、液体发酵生产
在100升机械搅拌发酵罐中装入60升液体发酵培养基，然后接种步骤2得到的种子液，接种量为5%。
培养条件：28℃，通入空气且通气量为10L/min，保压0.03Mpa，培养72小时。
完成上述培养后，将发酵罐内的所有物质记作液体发酵产物。
液体发酵产物中出现大量菌丝及液生孢子，发酵液较粘稠，另外镜检菌丝变细、菌丝体中无明显的液泡，发酵液中无明显断裂的菌丝。
液体发酵培养基：取蔗糖10g、玉米粉13g、NH4NO32g、大豆粕5.5g、MgSO4·7H2O1g和KH2PO44g，溶于水并用水定容至1000mL；pH=6.5；121℃高压灭菌30分钟，冷却至40℃后用于接种。
4、固体发酵生产
培养架：腔内具有尼龙纱网隔层的四立柱架子，长3.2m、宽0.7m、高2.6m，用尼龙纱网隔成7层结构，层间距30cm，四立柱材质是碳钢喷塑。
固体发酵培养基：将400质量份膨胀蛭石、70质量份玉米粉、20质量份麸皮、1质量份KH2PO4、0.5质量份MgSO4和250质量份水混合均匀；自然pH；121℃蒸汽灭菌60分钟。
在经甲醛和高锰酸钾薰蒸灭菌的发酵室内，将液体发酵产物接种至固体发酵培养基并混合均匀，接种量为20%，然后将混合物置于发酵室内的培养架的尼龙纱网上，依次按如下阶段培养：
a阶段：在温度为24℃、湿度为95%（体积百分含量）的条件下培养，时间为2d，期间用塑料薄膜覆盖以保持湿度；该阶段为菌丝生长阶段，要求低温高湿；
b阶段：在温度为28℃、湿度为80%（体积百分含量）的条件下培养，时间为3d；期间用灭过菌的报纸覆盖以保持湿度；该阶段开始形成孢子，要求高温中湿；
c阶段：在温度为26℃、湿度为40%（体积百分含量）的条件下培养，时间为1d；期间不需要覆盖；该阶段菌要求高温低湿。
上述培养过程中，要经常进行翻料。
完成上述培养后，将容器内的所有物质记作固体发酵产物。
5、发酵产物的干燥
将固体发酵产物在发酵室里用空调和抽湿机干燥，80目过筛，得到终产物（经检测，含水量为10%）。

Claims (1)

1.一种培养绿色木霉的方法，包括如下步骤：
(1)将绿色木霉进行液体发酵，得到液体发酵产物；
(2)将液体发酵产物进行以膨胀蛭石为载体的固体发酵；
所述液体发酵的条件为：27-29℃，通入空气且通气量为9-11L/min，0.02-0.04Mpa；所述液体发酵的时间为65小时-72小时；
所述液体发酵是在液体发酵培养基中进行的；所述液体发酵培养基的制备方法如下：取蔗糖9-11g、玉米粉9-13g、NH4NO31.8-2.2g、大豆粕4-5.5g、MgSO4·7H2O 0.8-1.2g和KH2PO42-4g，溶于水并用水定容至1000mL；
所述固体发酵依次包括a阶段、b阶段和c阶段：
a阶段：在温度为23-25℃、湿度为93-97％的条件下培养，培养时间为2-3天；
b阶段：在温度为27-29℃、湿度为78-82％的条件下培养，培养时间为3天；
c阶段：在温度为25-27℃、湿度为38-42％的条件下培养，培养时间为1天；
所述固体发酵是在以膨胀蛭石为载体的固体发酵培养基中进行的；所述固体发酵培养基的制备方法如下：将300-400质量份膨胀蛭石、50-70质量份玉米粉、10-20质量份麸皮、0.8-1.2质量份KH2PO4、0.4-0.6质量份MgSO4和150-250份水混合均匀；
所述步骤(1)中，将4-6体积份所述绿色木霉的种子液接种至94-96体积份所述液体发酵培养基，即为所述液体发酵的初始时刻；所述种子液的菌浓度为6.2-8.5×108CFU/mL；
所述步骤(2)中，将18-22体积份所述步骤(1)得到的液体发酵产物接种至78-82体积份所述固体发酵培养基，即为所述固体发酵的初始时刻；
所述绿色木霉为绿色木霉(Trichoderma viride)H06 CGMCC No.6229。
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