CN104087539A - 细黄链霉菌固体发酵培养基、制备方法及其发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种细黄链霉菌固体发酵培养基、制备方法及其发酵方法，包括30～60重量份的玉米粉、10～20重量份的米糠、30～50重量份的沙土和30重量份的营养液；沙土由重量比为3～5∶1的细土和沙子组成。本发明提供的培养基通过加入米糠，并协调玉米粉和沙土的混合量，使其既能保证足够的有机质的同时，通过增加沙土的相对加入量，使得菌种能在沙土之间进行增殖，增加固体培养基内的透气量，使得细黄链霉菌的增殖量和产孢子量得到提高。

Description

细黄链霉菌固体发酵培养基、制备方法及其发酵方法

技术领域

本发明涉及细黄链霉菌固体发酵领域，特别地，涉及一种细黄链霉菌固体发酵培养基、制备方法及其发酵方法。

背景技术

链霉菌(Streptomycetaceae)是抗生素类物质的主要生产菌，在微生物产生的20000多种活性物质中，链霉菌占到60％以上，是一类作物有益菌。细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)作为链霉菌属(Streptomyces)内的一个种类，在自然栽培条件下，其自身代谢产物可有效地促进植物生长，可产生玉米素、激动素等有效活性成分，已广泛应用于果树、蔬菜等多种植物栽培中，并对蔬菜等作物具有明显的促生、抗病作用。

但是，土壤中自然生长的细黄链霉菌数量太少，无法发挥上述作用。而现有技术中细黄链霉菌固体发酵周期长、产孢量少，难以实现工业化生产。

发明内容

本发明目的在于提供一种细黄链霉菌固体发酵培养基、制备方法及其发酵方法，以解决现有技术中细黄链霉菌增殖少、产孢子量少的技术问题。

为实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种细黄链霉菌固体发酵培养基，包括30～60重量份的玉米粉、10～20重量份的米糠、30～50重量份的沙土和30重量份的营养液；沙土由重量比为3～5∶1的细土和沙子组成。

进一步地，营养液为高氏一号培养液。

进一步地，由30～60重量份的玉米粉、10～20重量份的米糠、30～50重量份的沙土和30重量份的高氏一号培养液组成。

进一步地，由40重量份的玉米粉、10重量份的米糠、50重量份的沙土和30重量份的高氏一号培养液组成；沙土由重量比为4∶1的细土和沙子组成。

进一步地，细土的粒径为-80目，沙子的粒径为-60目。

根据本发明的另一方面还提供了一种细黄链霉菌固体培养基的制备方法，包括以下步骤：1)按权利要求1～5中任一项的比例称量各原料；2)将玉米粉、米糠和沙土混合，形成混合物；3)在混合物中加入营养液，并调节pH值至7.5～8.5，经灭菌处理，得到固体培养基。

进一步地，灭菌处理条件为：在128～135℃下施加1.5～3kg/cm²压力60～90分钟。

根据本发明的另一方面还提供了一种细黄链霉菌菌粉的发酵方法，包括以下步骤：1)液体发酵：将菌悬液接种到高氏一号培养液中进行液体发酵，至液体发酵中菌体生长进入细黄链霉菌的对数生长期，得到液体发酵液；2)固体发酵：将液体发酵液接种至如权利要求1～5中任一项的固体培养基中，进行固体发酵；固体发酵结束后干燥得到细黄链霉菌粉。

进一步地，液体发酵条件为：28～30℃，150～250r/分钟恒温振荡培养48～72小时；优选固体发酵条件为：在28～36℃下培养5～7天；优选固体发酵包括发酵初期和产孢期，发酵初期固体培养基的水分含量为40～50％，进入产孢期后固体培养基的水分含量小于35％。

进一步地，液体发酵步骤中，菌悬液的接种量为高氏一号培养液体积的8～12％；固体发酵步骤中，液体发酵液的接种量为固体培养基质量的8～12％；优选干燥条件为40-60℃下以空气作为干燥介质。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的培养基通过加入米糠，并协调玉米粉和沙土的混合量，使其既能保证足够的有机质的同时，通过增加沙土的相对加入量，使得菌种能在沙土之间进行增殖，增加固体培养基内的透气量，使得细黄链霉菌的增殖量和产孢子量得到提高。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行详细说明，但是本发明可以由权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

本发明一方面提供了一种细黄链霉菌固体发酵培养基，包括30～60重量份的玉米粉、10～20重量份的米糠、30～50重量份的沙土和营养液；沙土由重量比为3～5∶1的细土和沙子组成。

现有技术中常用的麸皮和黄豆粉存在以下问题：麸皮基质中杂菌含量较高，生产、发酵过程中易感染杂菌，而提高所得菌粉的杂菌含量。以黄豆粉为菌体氮源时，菌体生长速度缓慢，不利于孢子的萌发和生长，产孢子数量较少。其中本文细土是指细粒土，颗粒最大粒径≤4.75mm，公称最大粒径大于2.36mm的土。包括各种黏质土、粉质土、砂和石屑。

本发明提供的固体培养基避免使用常规细黄链霉菌固体发酵培养基中常用的麸皮和黄豆粉，而代之以玉米粉和米糠。按此量加入玉米粉中的氮源利于细黄链霉菌所分泌酶系分解利用，因而能促进细黄链霉菌的生长，缩短发酵周期，避免发酵时间过长导致杂菌感染机会增加的问题。同时玉米粉中的烟酸和维生素B6，在细黄链霉菌的分解作用下，所产生的物质还能促进细黄链霉菌产孢子，从而提高孢子的产量。

米糠是指大米收获后壳体磨成的粉。采用米糠替代麸皮，一方面米糠内部存在大量孔洞结构，能起到提高固体培养基透气性的效果，同时按此量加入米糠，米糠中含有大量营养物质如蛋白质、油酸和亚油酸能协助玉米粉发挥促进菌体生长和产孢子的作用。

沙土是指由重量比为3～5∶1的细土和沙子组成的混合物。其中细土是指磨细的土壤。沙子是指细小的石粒。按此比例混合的细土和沙子一方面能作为固体培养所需的支持体。另一方面通过协调玉米和沙土的加入量，使得玉米粉能与沙土颗粒实现均匀混合，使得沙土颗粒附近均能存在玉米粉或米糠，以作为附着于沙土颗粒上的菌体的营养物质，从而起到促进菌体生长的作用。优选细土的粒径为-80目，沙子的粒径为-60目。此处的-60目是指过60目筛后的筛下物。其余粒径以此类推。采用该粒径的细土和沙子混合能保证粒径更小的细土能对沙子产生包覆作用。从而使得菌体附着于细土上时，能得到沙子的制成。细土与细土之间的接触面增大也能起到促进菌体生长的作用。

本发明提供的固体培养基还包括营养液，该营养液为常用固体发酵过程中，提供充足的氮源和无机盐的液体培养基。液体培养基的加入量可根据常规加入量选取。优选采用30重量份的高氏一号培养液。采用高氏一号培养液能有效提高菌体的生长能力。按此量加入培养液能避免加入过多的培养液导致菌体附着的沙土颗粒之间距离过大，导致影响菌体的增殖。也能避免加入营养液过少，导致菌体生长所需的无机盐和氮源不足，导致菌体生长受限制。

还可以包括豆粕、豆饼粉或花生壳等常用固体培养基的氮源。

更优选的，由30～60重量份的玉米粉、10～20重量份的米糠、30～50重量份的沙土和30重量份的高氏一号培养液组成。采用该组成的固体培养基所得菌体产孢子量和菌体数量较多。更优选的，由40重量份的玉米粉、10重量份的米糠、50重量份的沙土和30重量份的高氏一号培养液组成。其中沙土由由重量比为4∶1的细土和沙子组成。采用该比例混合得到的固体培养基具有最优的孢子量、菌体数量和最低的杂菌含量。

本发明另一方面还提供了一种细黄链霉菌固体培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)按上述的比例称量玉米粉、米糠、沙土后混合后得到混合物；

2)向混合物中加入营养液，并调节pH值至7.5～8.5，并经灭菌处理，得到固体培养基。

将按上述比例称量后的玉米粉、米糠、沙土混合均匀，加入营养液之后调节混合物的pH值至7.5～8.5。调节pH值可以根据所得混合物的pH值进行选择。避免引入对菌体生长存在刺激或毒害作用的物质的酸或碱即可。优选采用石灰，价格低廉，获取简便，对菌体毒害作用小。营养液优选为高氏一号培养液。

灭菌处理条件为：在128～135℃下施加1.5～3kg/cm²压力60～90分钟。按此条件进行灭菌，能充分杀灭固体培养基内的杂菌，尤其是对深藏于米糠孔洞内的杂菌具有较好的灭除效果，能有效降低所得菌粉中的杂菌数量。

本发明的另一面还提供了一种细黄链霉菌菌粉的发酵方法，包括以下步骤：

1)液体发酵：将菌悬液接种到高氏一号培养液中进行液体发酵，至液体发酵中菌体生长进入细黄链霉菌的对数生长期，得到液体发酵液；

2)固体发酵：将液体发酵液接种至上述的固体培养基中，进行固体发酵；

固体发酵结束后干燥得到细黄链霉菌粉。

本发明通过先液体发酵的方法，使得菌悬液中的细黄链霉菌孢子充分萌发。液体发酵时采用适于细黄链霉菌生长的条件。避免其他杂菌的生长。随着液体发酵的进行，使得细黄链霉菌进入对数生长期。进入对数生长期后，细黄链霉菌能持续保持高速增殖。将进入对数生长期的菌液接种至上述固体发酵培养基上，由于菌体已经进入高速生长期，因而能在固体培养基上维持该生长势头，从而将固体培养基中残存的杂菌竞争去掉。从而降低菌粉中杂菌的含量。

菌悬液的制备为先将斜面孢子用无菌水混匀。接高氏一号液体培养基发酵罐培养扩大菌液。菌悬液的接种量为高氏一号培养液体积的8～12％。采用该比例接种在节约菌液的同时，提高液体发酵的效率。液体发酵液的接种量为固体培养基质量的8～12％。采用该比例接种，能保证进入固体培养基中的菌体数量适宜，避免接种过量，导致后续增殖困难。

液体发酵条件按常规条件既可，优选液体发酵条件为：28～30℃，150～250r/分钟恒温培养48～72小时。采用该条件培养能有利于细黄链霉菌的生长，避免杂菌的生长。

固体发酵可以按常规方法进行，优选固体发酵条件为：在28～36℃下培养5～7天。按此条件发酵，能避免过度培养，导致杂菌的再次入侵，增加菌粉中杂菌的含量。

对于菌粉中杂菌的含量控制，还可以通过对固体培养过程中水分含量的控制实现。优选固体发酵包括发酵初期和产孢期，发酵初期固体培养基的水分含量为40～50％，进入产孢期后固体培养基的水分含量小于35％。按此含水量调整固体培养基中的含水量，结合固体发酵的温度，使得发酵过程中的温湿度利于细黄链霉菌的生长，而不利于各类杂菌的生长。从而避免米糠中残留的杂菌对菌粉的污染。

优选，干燥条件为40～60℃下以空气作为干燥介质。采用空气作为干燥介质，能使得孢子体受热均匀，避免局部过度受热。此时固体培养基所具有的良好透气性能，使得采用空气进行干燥能有效的提高干燥效果。

采用本发明提供的方法，生产一批菌粉的周期为15～20天，液体发酵约3天，固体发酵约7天，干燥3～5天，孢子粉活菌数检测5～7天。采用本发明提供的方法生产时间得到有效缩短。生产效率得到提高。

实施例

以下实施例和对比例中所用原料和设备均为市售，其中各类培养基均按常规方法配置。以下过程中接种均在无菌操作台上完成。液体发酵在数显恒温振荡器上为完成。灭菌处理在矩形卧式高压灭菌锅上完成。固体发酵在1.5m³发酵罐内完成。转入干燥过程中采用固体物料转运车。

菌粉活菌数检测方法：培养基为改良高氏一号培养基，硝酸钾1.0g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.5g/L，可溶性淀粉20g/L，琼脂15g/L，PH值7.2-7.425℃，高压蒸汽灭菌116℃30分钟冷却至50～55℃，每300ml培养液中加入3％重铬酸钾1ml，混匀，倾入无菌平皿。培养5～7天后检测。

实施例1

培养基的制备方法：

1)称取30重量份的玉米粉、10重量份的米糠、30重量份的沙土和15重量份的花生壳，其中沙土为由重量比为3∶1的细土和沙子组成。细土的粒径为-60目，沙子的粒径为-40目。混合均匀各物质；

2)加入25重量份马铃薯蔗糖培养液，用石灰水调节pH值至7.5，并在128℃下施加1.5kg/cm²压力90分钟，得到固体培养基。

细黄链霉菌菌粉的发酵方法：

1)斜面孢子加入适量无菌水，孢子在无菌水内均匀分散，没有团聚，制成孢子菌悬液，

2)液体发酵：将菌悬液接种到高氏一号培养液中，接种量为高氏一号培养液体积的8％，在28℃，150r/分钟恒温振荡培养72小时进行液体发酵，至液体发酵中菌体生长进入细黄链霉菌的对数生长期，即闻到菌液有一股放线菌特殊药味时，得到液体发酵液；

3)固体发酵：将液体发酵液接种所得固体培养基中，接种量为固体培养基质量的8％，在28℃下培养7天，在此过程中取样用显微镜观察长出白色或者杏仁黄色气生菌丝体的固体培养基表面是否出现孢子，在出现孢子之前，控制固体培养基的水含量为40～50％，待固体培养基表面出现孢子后，将固体培养基的水分含量降低至28％；

4)固体发酵结束后以空气作为干燥介质在40℃下干燥固体培养基，得到细黄链霉菌粉。

实施例2

培养基的制备方法：

1)称取60重量份的玉米粉、20重量份的米糠、50重量份的沙土和20重量份的豆饼粉，其中沙土为由重量比为5∶1的细土和沙子组成。细土的粒径为-60目，沙子的粒径为-40目。混合均匀各物质；

2)加入25重量份马铃薯蔗糖培养液，用石灰水调节pH值至8.5，并在135℃下施加3kg/cm²压力60分钟，得到固体培养基。

细黄链霉菌菌粉的发酵方法：

1)斜面孢子加入适量无菌水，孢子在无菌水内均匀分散，没有团聚，制成孢子菌悬液，

2)液体发酵：将菌悬液接种到高氏一号培养液中，接种量为高氏一号培养液体积的12％，在30℃，250r/分钟恒温振荡培养48小时进行液体发酵，至液体发酵中菌体生长进入细黄链霉菌的对数生长期，即闻到菌液有一股放线菌特殊药味时，得到液体发酵液；

3)固体发酵：将液体发酵液接种所得固体培养基中，接种量为固体培养基质量的12％，在36℃下培养5天，在此过程中取样用显微镜观察长出白色或者杏仁黄色气生菌丝体的固体培养基表面是否出现孢子，在出现孢子之前，控制固体培养基的水含量为50％，待固体培养基表面出现孢子后，将固体培养基的水分含量降低至30％；

4)固体发酵结束后以空气作为干燥介质在60℃下干燥固体培养基，得到细黄链霉菌粉。

实施例3

培养基的制备方法：

1)称取30重量份的玉米粉、10重量份的米糠、30重量份的沙土，其中沙土为由重量比为3∶1的细土和沙子组成。细土的粒径为-80目，沙子的粒径为-60目。混合均匀各物质；

2)加入和30重量份的高氏一号培养液，用石灰水调节pH值至7.5，并在128℃下施加1.5kg/cm²压力60分钟，得到固体培养基。

细黄链霉菌菌粉的发酵方法：

1)斜面孢子加入适量无菌水，孢子在无菌水内均匀分散，没有团聚，制成孢子菌悬液，

2)液体发酵：将菌悬液接种到高氏一号培养液中，接种量为高氏一号培养液体积的8％，在28℃，150r/分钟恒温振荡培养72小时进行液体发酵，至液体发酵中菌体生长进入细黄链霉菌的对数生长期，即闻到菌液有一股放线菌特殊药味时，得到液体发酵液；

3)固体发酵：将液体发酵液接种所得固体培养基中，接种量为固体培养基质量的8％，在28℃下培养7天，在此过程中取样用显微镜观察长出白色或者杏仁黄色气生菌丝体的固体培养基表面是否出现孢子，在出现孢子之前，控制固体培养基的水含量为40％，待固体培养基表面出现孢子后，将固体培养基的水分含量降低至32％；

4)固体发酵结束后以空气作为干燥介质在40℃下干燥固体培养基，得到细黄链霉菌粉。

实施例4

培养基的制备方法：

1)称取60重量份的玉米粉、20重量份的米糠、50重量份的沙土，其中沙土为由重量比为5∶1的细土和沙子组成。细土的粒径为-80目，沙子的粒径为-60目。混合均匀各物质；

2)加入和30重量份的高氏一号培养液，用石灰水调节pH值至8.5，并在135℃下施加3kg/cm²压力60分钟，得到固体培养基。

细黄链霉菌菌粉的发酵方法：

1)斜面孢子加入适量无菌水，孢子在无菌水内均匀分散，没有团聚，制成孢子菌悬液，

2)液体发酵：将菌悬液接种到高氏一号培养液中，接种量为高氏一号培养液体积的12％，在30℃，250r/分钟恒温振荡培养48小时进行液体发酵，至液体发酵中菌体生长进入细黄链霉菌的对数生长期，即闻到菌液有一股放线菌特殊药味时，得到液体发酵液；

3)固体发酵：将液体发酵液接种所得固体培养基中，接种量为固体培养基质量的12％，在36℃下培养5天，在此过程中取样用显微镜观察长出白色或者杏仁黄色气生菌丝体的固体培养基表面是否出现孢子，在出现孢子之前，控制固体培养基的水含量为50％，待固体培养基表面出现孢子后，将固体培养基的水分含量降低至28％；

4)固体发酵结束后以空气作为干燥介质在60℃下干燥固体培养基，得到细黄链霉菌粉。

实施例5

培养基的制备方法：

1)称取40重量份的玉米粉、10重量份的米糠、50重量份的沙土，其中沙土为由重量比为4∶1的细土和沙子组成。细土的粒径为-80目，沙子的粒径为-60目。混合均匀各物质；

2)加入和30重量份的高氏一号培养液，用稀硫酸或石灰水调节pH值至7，并在130℃下施加2.5kg/cm²压力70分钟，得到固体培养基。

细黄链霉菌菌粉的发酵方法：

1)斜面孢子加入适量无菌水，孢子在无菌水内均匀分散，没有团聚，制成孢子菌悬液，

2)液体发酵：将菌悬液接种到高氏一号培养液中，接种量为高氏一号培养液体积的10％，在30℃，200r/分钟恒温振荡培养48小时进行液体发酵，至液体发酵中菌体生长进入细黄链霉菌的对数生长期，即闻到菌液有一股放线菌特殊药味时，得到液体发酵液；

3)固体发酵：将液体发酵液接种所得固体培养基中，接种量为固体培养基质量的10％，在35℃下培养5天，在此过程中取样用显微镜观察长出白色或者杏仁黄色气生菌丝体的固体培养基表面是否出现孢子，在出现孢子之前，控制固体培养基的水含量为45％，待固体培养基表面出现孢子后，将固体培养基的水分含量降低至32％；

4)固体发酵结束后以空气作为干燥介质在50℃下干燥固体培养基，得到细黄链霉菌粉。

对比例1

与实施例3的区别在于：采用粒径为-80目的细土替代沙土。

对比例2

与实施例1的区别在于：称量29重量份的玉米粉、9重量份的米糠、29重量份的沙土。

对比例3

与实施例1的区别在于：称量61重量份的玉米粉、21重量份的米糠、51重量份的沙土。实施例1～5和对比例1～3中所得结果列于表1中。

表1实施例1～5和对比例1～3菌粉中产孢率、菌剂有效活菌数、杂菌含量、固体发酵天数表

由表1可见，实施例1～5的产孢率较对比例提高80～90％。实施例1～5中菌剂有效活菌数是对比例1～3的2～3倍。杂菌含量实施例1～5中均较低，而对比例中均较高，影响所得菌粉的使用效果。

采用本发明提供的固体培养基能有效抑制培养过程中杂菌的感染。同时还能提高所得菌粉中的有效活菌数和孢子含量。而且生产周期缩短，提高了生产效率。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细黄链霉菌固体发酵培养基，其特征在于，包括30～60重量份的玉米粉、10～20重量份的米糠、30～50重量份的沙土和30重量份的营养液；

所述沙土由重量比为3～5∶1的细土和沙子组成。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述营养液为高氏一号培养液。

3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，由30～60重量份的玉米粉、10～20重量份的米糠、30～50重量份的沙土和30重量份的高氏一号培养液组成。

4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，由40重量份的玉米粉、10重量份的米糠、50重量份的沙土和30重量份的高氏一号培养液组成；所述沙土由重量比为4∶1的细土和沙子组成。

5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述细土的粒径为-80目，所述沙子的粒径为-60目。

6.一种细黄链霉菌固体培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)按权利要求1～5中任一项所述的比例称量各原料；

2)将玉米粉、米糠和沙土混合，形成混合物；

3)在所述混合物中加入营养液，并调节pH值至7.5～8.5，经灭菌处理，得到所述固体培养基。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述灭菌处理条件为：在128～135℃下施加1.5～3kg/cm²压力60～90分钟。

8.一种细黄链霉菌菌粉的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)液体发酵：将菌悬液接种到高氏一号培养液中进行液体发酵，至所述液体发酵中菌体生长进入所述细黄链霉菌的对数生长期，得到液体发酵液；

2)固体发酵：将所述液体发酵液接种至如权利要求1～5中任一项所述的固体培养基中，进行固体发酵；

所述固体发酵结束后干燥得到细黄链霉菌粉。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述液体发酵条件为：28～30℃，150～250r/分钟恒温振荡培养48～72小时；优选所述固体发酵条件为：在28～36℃下培养5～7天；优选所述固体发酵包括发酵初期和产孢期，所述发酵初期所述固体培养基的水分含量为40～50％，进入产孢期后所述固体培养基的水分含量小于35％。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述液体发酵步骤中，所述菌悬液的接种量为所述高氏一号培养液体积的8～12％；所述固体发酵步骤中，所述液体发酵液的接种量为所述固体培养基质量的8～12％；优选所述干燥条件为40-60℃下以空气作为干燥介质。