CN109824392A - 一种有机肥及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种有机肥及其制备方法。本发明将湿芝麻渣和花生壳合理地再利用，并利用具有高效降解黄曲霉毒素B1的LH‑F001菌株经发酵形成优势菌后，再接种由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、硝化细菌、酵母菌组成的有机肥发酵剂，采用堆肥发酵生产有机肥。本发明的有机肥具有不含黄曲霉毒素、有机质含量高、营养成分丰富、绿色环保、肥效长等特点。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，尤其涉及一种有机肥及其制备方法。
背景技术
湿芝麻渣，是生产水代法小磨芝麻香油的副产物，水分含量高达70％，富含有机氮、有机磷等营养物质，适合微生物生长。湿芝麻渣除少量直接用于饲料外，绝大部分通过自然晾晒进行干燥后再用于精炼提油。自然晾晒容易滋生细菌、蛆虫并产生恶臭，造成严重的环境污染。也有文献报道采用先离心再热风干燥的方式进行湿芝麻渣脱水，但是成本高昂，难以大规模推广应用。
花生壳，是花生脱壳加工的废弃物，我国花生壳资源丰富，年产量约450万吨。花生收获后，常常因储存不当而吸水受潮，极易滋生黄曲霉菌而污染黄曲霉毒素，其中大部分霉菌和毒素存在于花生壳上。目前花生壳除少量用于加工生物质颗粒燃料外，大部分被作为废弃物丢弃或者焚烧，造成环境污染。
如何充分开发、利用湿芝麻渣和花生壳资源，提高经济效益及社会效益，是目前急需解决的问题。有文献公开花生壳发酵制备有机肥的方法，但均未提到降低黄曲霉毒素污染的问题。黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉、寄生曲霉等曲霉产生的次级代谢产物，具有极强的致癌、致畸、致突变性。目前已鉴定出的黄曲霉毒素种类有20多种，其中黄曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最强，1993年被国际癌症研究机构(International Agency for Researchon Cancer,IARC)归为一级致癌物。AFB1分子结构稳定，若未经脱毒的花生壳发酵有机肥直接用于大田作物，很可能会通过肥料污染作物，具有极大的安全风险。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种有机肥及其制备方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种有机肥，其组分按照重量份数计包括：湿芝麻渣30-60份、花生壳粉40-70份、LH-F001菌株发酵液1-10份和有机肥发酵剂2-5份。
进一步，所述湿芝麻渣为水代法提取芝麻油后的副产物；以干基计，所述湿芝麻渣的含水量为65-75wt％，总氮含量为6.5-7.2wt％；
所述的花生壳粉为花生壳粉碎至粒径小于2mm；所述花生壳的水分含量小于8％；
所述有机肥发酵剂由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、硝化细菌和酵母菌按照重量比1:1:1:1组成；
所述LH-F001菌株发酵液的制备方法，步骤如下：
(1)取LH-F001菌株冻干粉0.1-0.5g，接种到100-500mL YPD液体培养基中，37℃条件下活化培养24h；
(2)取步骤(1)的活化液，按1-10％体积比接种到扩大培养基中，37℃条件下扩大培养24h，得到LH-F001菌株发酵液；其中，所述的扩大培养基由花生粕、葡萄糖、纯化水按照重量比1:1:50混合后灭菌所得。
更进一步，所述LH-F001菌株的分离方法，步骤如下：
(1)将采集自山东省莱阳市花生种植基地的土壤在无菌生理盐水中摇床震荡10-20min，制备菌悬液；其中，土壤与无菌生理盐水的用量比为10g：(80-120)mL；
(2)将步骤(1)的菌悬液用无菌生理盐水进行梯度稀释后，涂布在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基平板上，在35-40℃条件下培养24h；
(3)挑取平板上形态不同的单菌落，采用平板划线法纯化，纯化后的菌株采用黄曲霉毒素降解实验筛选，得到高效降解黄曲霉毒素B1的菌株，即为LH-F001菌株。
其中，步骤(2)中所述的梯度稀释具体操作为：取步骤(1)的菌悬液静置5min，取上层清液1mL，用无菌生理盐水进行逐级稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，取不同稀释度的菌悬液，分别吸取100μL均匀涂布于培养基平板上。
本发明的第二个目的在于提供上述有机肥的制备方法，步骤如下：
(1)将湿芝麻渣与花生壳粉混合，并调整水分至45-55％；接种LH-F001菌株发酵液，自然发酵24h后，继续接种有机肥发酵剂；
(2)取步骤(1)的混合物料，采用堆肥发酵30-45天，期间每隔1天翻堆1次，直至物料颜色呈深褐色；将物料温度降至35℃以下、水分降至25-30wt％，堆肥发酵结束；筛分、包装，得到成品有机肥。
【生物保藏说明】
本发明所用的菌株，其保藏编号为CGMCC No.17142；生物材料：LH-F001；分类命名：鲁梅利杆菌(Rummeliibacillus stabekisii)；已于2019年01月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
本发明的有益效果是：
本发明将湿芝麻渣和花生壳合理地再利用，并利用具有高效降解黄曲霉毒素B1的LH-F001菌株经发酵形成优势菌后，再接种由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、硝化细菌、酵母菌组成的有机肥发酵剂，采用堆肥发酵生产有机肥。本发明的有机肥具有不含黄曲霉毒素、有机质含量高、营养成分丰富、绿色环保、肥效长等特点。
附图说明
图1示LH-F001菌株的平板培养性状；
图2示黄曲霉毒素标准品(5μg/kg)的高效液相图谱；
图3示发霉花生粕发酵前(上图)、后(下图)黄曲霉毒素B1的高效液相图谱。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
一、菌株LH-F001的分离与鉴定
1、菌株的分离纯化
(1)将采集自山东省莱阳市花生种植基地的土壤10g在100mL无菌生理盐水中摇床震荡10-20min，制备菌悬液；
(2)取步骤(1)的菌悬液静置5min，取上层清液1mL，用无菌生理盐水进行逐级稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，取不同稀释度的菌悬液，分别吸取100μL均匀涂布于酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基平板上，在37℃条件下培养24h；
(3)挑取平板上形态不同的单菌落，采用平板划线法纯化，纯化后的菌株采用黄曲霉毒素降解实验筛选，得到高效降解黄曲霉毒素B1的菌株，即为LH-F001菌株。
将所得菌株LH-F001在YPD培养基上、在37℃条件下培养24h，见图1，菌落呈圆形、半透明、边缘整齐。革兰氏染色镜检阳性，菌体有芽孢。
2、菌株的鉴定
提取LH-F001的总DNA，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，将扩增产物测序，经NCBI数据库同源序列比对分析，菌株LH-F001与Rummeliibacillus stabekisiistrain PP9(2016)(GenBank登录号为CP014806.1)同源性为100％，判定该菌株为鲁梅利杆菌Rummeliibacillus stabekisii。
二、菌株LH-F001在降解黄曲霉毒素B1中的应用
1、菌种培养液
菌株LH-F001接种于液体YPD培养基中，在37℃条件下培养24h，作为菌种培养液，用于后续黄曲霉毒素B1的降解实验。
2、菌株LH-F001用于降低发霉花生粕中黄曲霉毒素B1的方法，步骤如下：
(1)取180g污染有黄曲霉毒素B1的花生粕粉碎，加入20g麸皮，混合均匀后置于1L烧杯中，高压蒸汽灭菌；
(2)将菌株LH-F001接种于液体YPD培养基中，在37℃条件下培养24h，作为菌种培养液；
(3)将步骤(2)的菌种培养液以10％(v/w)的接种量接入冷却后的花生粕麸皮混合物料，调整料水比为1:0.6，混合均匀，用8层纱布包裹烧杯口；将烧杯置于培养箱中，在37℃条件下发酵24h，45℃条件下继续发酵24h，在50℃条件下继续发酵36h；将发酵后的花生粕烘干、粉碎。
3、检测黄曲霉毒素B1
a)检测方法：称取样品20.00g，使用甲醇：水(体积比6:4)溶液进行萃取，萃取液经免疫亲和柱净化提取后，用高效液相色谱(柱后碘液衍生)对样品进行检测。
样品为黄曲霉毒素标准品(5μg/kg)、上述步骤(1)的污染有黄曲霉毒素B1的花生粕、步骤(3)发酵后的花生粕、对照样品；其中，对照样品为上述步骤(1)的污染有黄曲霉毒素B1的花生粕不接种菌株LH-F001，调整料水比为1:0.6，混合均匀，用8层纱布包裹烧杯口；将烧杯置于培养箱中，在37℃条件下发酵24h，45℃条件下继续发酵24h，在50℃条件下继续发酵36h所得。
b)检测结果：
步骤(1)的污染有黄曲霉毒素B1的花生粕中黄曲霉毒素B1含量为219.87μg/kg；步骤(3)发酵后的花生粕中黄曲霉毒素B1含量降低至15.17μg/kg，降解率达93.1％；对照样品中黄曲霉毒素B1的含量为197.88μg/kg。
高效液相色谱检测图谱及降解效果见图2、图3。
可见，脱毒后发酵花生粕中黄曲霉毒素B1含量远低于国家对饲料的限量要求(≤50μg/kg)，适合应用于对发霉花生粕中黄曲霉毒素B1的工业化脱毒处理。因此，充分证明LH-F001菌株能够降解花生中的黄曲霉毒素B1。
注：AFB1降解率(％)＝(发酵前原料AFB1含量-发酵后残留AFB1含量)/发酵前原料AFB1含量×100。
三、菌株LH-F001在制备有机肥中的应用
实施例1
一种有机肥，其组分包括：湿芝麻渣30份、花生壳粉60份、LH-F001菌株发酵液8份和有机肥发酵剂2份。
上述有机肥的制备方法，步骤如下：
(1)将30份湿芝麻渣与60份花生壳粉混合，并调整水分至45-55％；接种8份LH-F001菌株发酵液，自然发酵24h后，继续接种2份有机肥发酵剂；
(2)取步骤(1)的混合物料，采用堆肥发酵30天，期间每隔1天翻堆1次，直至物料颜色呈深褐色；将物料温度降至35℃以下、水分降至25-30wt％，堆肥发酵结束；筛分、包装，得到成品有机肥。
实施例2
一种有机肥，其组分包括：湿芝麻渣47份、花生壳粉45份、LH-F001菌株发酵液3份和有机肥发酵剂5份。
上述有机肥的制备方法，步骤如下：
(1)将47份湿芝麻渣与45份花生壳粉混合，并调整水分至45-55％；接种3份LH-F001菌株发酵液，自然发酵24h后，继续接种5份有机肥发酵剂；
(2)取步骤(1)的混合物料，采用堆肥发酵38天，期间每隔1天翻堆1次，直至物料颜色呈深褐色；将物料温度降至35℃以下、水分降至25-30wt％，堆肥发酵结束；筛分、包装，得到成品有机肥。
实施例3
一种有机肥，其组分包括：湿芝麻渣55份、花生壳粉41份、LH-F001菌株发酵液1份和有机肥发酵剂3份。
上述有机肥的制备方法，步骤如下：
(1)将55份湿芝麻渣与41份花生壳粉混合，并调整水分至45-55％；接种1份LH-F001菌株发酵液，自然发酵24h后，继续接种3份有机肥发酵剂；
(2)取步骤(1)的混合物料，采用堆肥发酵42天，期间每隔1天翻堆1次，直至物料颜色呈深褐色；将物料温度降至35℃以下、水分降至25-30wt％，堆肥发酵结束；筛分、包装，得到成品有机肥。
取实施例1-3所得有机肥进行成分测定，结果见表1。
表1有机肥指标检测结果
由表1可以看出，由本发明组分制备的有机肥，其黄曲霉毒素含量极低，且含有较高含量的有机质和营养成分。
四、有机肥的肥效试验
有机肥在小白菜(绿星青菜)上的应用
如表2所示，试验设4种处理方式，均采用深沟整畦栽培方式，施肥深度15-20cm，撒播，行距25cm，用种量300g/亩。出苗后按要求间苗，苗间距15cm。
不同处理方式的小白菜产量，如表3所示。由表3可以看出，施用本发明制备的有机肥做底肥，化肥施用量减少40％，且无需追肥，与常规施肥方式相比，小白菜产量均有不同程度增加。
表2田间试验处理方式
表3不同处理方式的小白菜产量
| 组别 | 产量kg/亩 | 比常规施肥±kg/亩 |
| 处理方式1 | 628.3 | +39.7 |
| 处理方式2 | 641.9 | +53.3 |
| 处理方式3 | 635.2 | +46.6 |
| 处理方式4 | 588.6 |
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种有机肥，其特征在于，其组分按照重量份数计包括：湿芝麻渣30-60份、花生壳粉40-70份、LH-F001菌株发酵液1-10份和有机肥发酵剂2-5份。
2.根据权利要求1所述的有机肥，其特征在于，所述湿芝麻渣为水代法提取芝麻油后的副产物；以干基计，所述湿芝麻渣的含水量为65-75wt％，总氮含量为6.5-7.2wt％。
3.根据权利要求1所述的有机肥，其特征在于，所述的花生壳粉为花生壳粉碎至粒径小于2mm；所述花生壳的水分含量小于8％。
4.根据权利要求1所述的有机肥，其特征在于，所述有机肥发酵剂由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、硝化细菌和酵母菌按照重量比1:1:1:1组成。
5.根据权利要求1所述的有机肥，其特征在于，所述LH-F001菌株发酵液的制备方法，步骤如下：
(1)取LH-F001菌株冻干粉0.1-0.5g，接种到100-500mL YPD液体培养基中，37℃条件下活化培养24h；
(2)取步骤(1)的活化液，按1-10％体积比接种到扩大培养基中，37℃条件下扩大培养24h，得到LH-F001菌株发酵液；其中，所述的扩大培养基由花生粕、葡萄糖、纯化水按照重量比1:1:50混合后灭菌所得。
6.根据权利要求5所述的有机肥，其特征在于，所述LH-F001菌株，其保藏编号为CGMCCNo.17142。
7.根据权利要求6所述的有机肥，其特征在于，所述LH-F001菌株的分离方法，步骤如下：
(1)将采集自山东省莱阳市花生种植基地的土壤在无菌生理盐水中摇床震荡10-20min，制备菌悬液；其中，土壤与无菌生理盐水的用量比为10g：(80-120)mL；
(2)将步骤(1)的菌悬液用无菌生理盐水进行梯度稀释后，涂布在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基平板上，在35-40℃条件下培养24h；
(3)挑取平板上形态不同的单菌落，采用平板划线法纯化，纯化后的菌株采用黄曲霉毒素降解实验筛选，得到高效降解黄曲霉毒素B1的菌株，即为LH-F001菌株。
8.根据权利要求7所述的有机肥，其特征在于，步骤(2)中所述的梯度稀释具体操作为：取步骤(1)的菌悬液静置5min，取上层清液1mL，用无菌生理盐水进行逐级稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，取不同稀释度的菌悬液，分别吸取100μL均匀涂布于培养基平板上。
9.一种权利要求1所述有机肥的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)将湿芝麻渣与花生壳粉混合，并调整水分至45-55％；接种LH-F001菌株发酵液，自然发酵24h后，继续接种有机肥发酵剂；
(2)取步骤(1)的混合物料，采用堆肥发酵30-45天，期间每隔1天翻堆1次，直至物料颜色呈深褐色；将物料温度降至35℃以下、水分降至25-30wt％，堆肥发酵结束；筛分、包装，得到成品有机肥。
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