CN101899395A - 一种快速降解水稻秸秆的复合菌系的筛选构建方法及复合菌系 - Google Patents

Abstract

本发明一种快速降解水稻秸秆的复合菌系的筛选构建方法及复合菌系，属于微生物筛选方法技术领域。包括以下步骤：(1)菌种池的构建，(2)固体培养基的制备，和(3)复合菌系的筛选构建。该方法筛选的复合菌系包括细菌和真菌。本发明具有以下优点：是在固体培养基条件下筛选得到的，其复合菌系包括了细菌和真菌，具有更好的腐解效果；复合菌系RSS-4是在未灭菌的固体培养基条件下进行的，筛选得到的复合菌系在中温即22℃条件下具有较好的腐解效果，有效的弥补了现有技术中的复合菌只能在28℃条件下进行腐解的不足。

Description

一种快速降解水稻秸秆的复合菌系的筛选构建方法及复合菌系

技术领域

本发明属于微生物筛选方法技术领域，具体涉及一种快速降解水稻秸秆的复合菌系的筛选构建方法及复合菌系。

背景技术

我国作为农业大国，各类农作物秸秆资源十分丰富，每年的作物秸秆产量已达7亿多吨，几乎占世界总量的1/3。近年来，随着农村经济的快速发展，农村能源结构也发生了根本的改变，绝大部分秸秆已不再作为燃料使用，焚烧或是随处堆积、丢弃农作物秸秆已成为一个社会问题。而农作物秸秆是一种重要的可再生性生物质资源，含有钾、硅、氮、钙、镁、磷等元素及纤维素、半纤维素、木质素、蛋白质、氨基酸等有机质成分。仅其氮磷钾含量，就相当于全国每年化肥用量的四分之一。若将秸秆还田，秸秆与土壤翻耕混合后在土壤微生物的作用下形成腐殖质，有利于土壤团粒体的形成，改善了土壤耕作性能，提高土壤肥力。因此，秸秆还田具有增加土壤有机物含量、改善土壤理化性状、培肥土壤、提高作物产量等多种作用。

水稻是我国主要的粮食作物之一，常年种植面积和产量分别占粮食作物的29％和44％。2008年水稻播种面积达到29241.1千公顷。我国水稻生产布局日趋集中，南方是我国的主要稻区，包括长江流域的江苏、安徽、湖北、湖南、江西、重庆、四川、贵州、云南和河南南部等省(直辖市)，东南沿海优势产区的上海、浙江、福建、广西、广东和海南6省(直辖市、自治区)，水稻种植面积占总的水稻播种面积80％以上。

目前作物秸秆还田从操作方式上可粗分为两类：一是将秸秆收集，挖坑填埋(或是堆垛)后补充添加促腐物(腐解菌剂、氮素营养或畜禽粪便等)腐解后再还田，二是将其原位就地直接还田(粉碎或是覆盖还田)。

通常前者微生物活动较旺盛，腐解效果较稳定，但需要占用大量的人力和场地，难以推广。

而秸秆原位还田则可较好地与农机作业结合，省时省工，易于推广。但由于构成秸秆主要成分的纤维素、半纤维素、木质素、蜡质物质等物质的结构稳定，腐解是一个困难且复杂的过程，需要多菌群、多酶系的接力协同才能完成，若不添加高效腐解微生物，仅依靠环境中的自然菌群，秸秆腐解速度较慢。但是由于秸秆中含量达到40％～50％纤维素大分子被木质素包围，而木质素分子很稳定，使得秸秆中的纤维素的难于被分解利用，秸秆腐解速度慢、腐解效果差。在自然条件下一年秸秆腐解率不到50％，会影响下茬作物的生根和成活，造成生产管理上的不便，所有这些都使得秸秆直接还田不能广泛应用，这已成为限制秸秆资源利用的瓶颈。

我国南方的种植结构多是双季，水稻收获后，一般马上要进行下茬作物的播种，因此水稻秸秆的腐解成为一个迫切需要解决的问题。

目前，已有多种用于腐解有机废弃物、制造有机肥的腐熟菌剂产品及申报的专利，如公告号CN1158225C、名称为“有机物快速腐熟菌剂”专利申请中崔宗均等采用外淘汰筛选法从高温堆肥作为原料筛选构建了一组高效稳定的纤维素分解菌复合系MCl，该复合系8d可将水稻秸秆完全降解。

李为等在《新疆农业科学》2009年第46卷第1期第72-77页中发表的“一组高效棉秆降解菌复合系的构建及其降解特性研究”中所述的从多种样品中筛选构建了一组高效棉秆降解菌复合系zFC，在28℃静置培养条件下经过13d的液体发酵，zFC菌系对棉秆中纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别为21.0％、65.1％和46.3％，加速了棉秆的降解。

但是上述的复合菌系均是在常温及高温、且是液体发酵条件下具有较好的降解秸秆能力，而关于中低温尤其是固体条件下腐解农作物秸秆的复合菌系的研究报道则较少。又由于这些技术采用液体培养的方法，复合菌系的组成多以细菌为主体。

发明内容

利用微生物来分解各种作物秸秆，是促进和推动秸秆还田、培肥地力为农业的可持续发展做出贡献的一个重要方面。随着降解机理研究的逐步深入，人们发现依靠单一微生物或者几种微生物简单组合很难将秸秆降解，秸秆降解需要多种微生物、多种酶的协同参与。因此，充分利用自然界多种微生物的协同关系，筛选构建能够产生多种纤维素酶的高效稳定复合菌系，引起了人们的高度重视，并成为了一个新的研究热点。因此，若能筛选并应用高效秸秆促腐菌剂，加快还田后的秸秆在田间自然条件下的腐解速度和效果，对于促进秸秆还田技术在我国广大农区的应用推广具有积极意义。

本发明的目的是为了解决现有技术中秸秆直接还田工艺上只能在常温及高温、且是液体发酵条件下具有较好的降解秸秆能力的缺陷，发明了一种新的快速降解水稻秸秆的复合菌系筛选构建方法。

本发明的另一个目的在于提供了用上述筛选构建方法获得的复合菌系。

本发明的技术方案如下：

一种快速降解水稻秸秆的复合菌系筛选构建方法，包括以下步骤：

(1)、菌种池的构建：取水稻土，保持含水量60％左右，搅拌均匀，以水稻秸秆为唯一碳源，加入尿素120mg/kg、磷酸二氢钾50mg/kg和氯化钾120mg/kg作基肥；采集多年原位还田土样施入水稻土中，室温下静置培养；

(2)、固体培养基的制备：取水稻秸秆粉75g，麸皮30g，营养盐溶液100ml，翻搅均匀；所述营养盐溶液中含有质量百分比的下述物质(NH4)2SO42％，KH2PO4 0.1％，MgSO4.7H2O 0.5％，CaCl2 0.01％，NaCI 0.01％，FeSO4.7H2O0.005％，MnSO4.H2O 0.0016％，ZnSO4.7H2O 0.0014％，CoCl2 0.002％；

(3)、复合菌系的筛选构建：在步骤(2)中得到的固体培养基中以水稻秸秆粉为碳源，调节C/N值到28，加水调匀后加入步骤(1)中菌种池中的菌种，培养的初始温度为28℃，含水量控制在60％左右，待pH值趋于稳定及C/N值小于20时取15％固体发酵菌进行转接并连续继代培养，待水稻秸秆腐解时间和速度稳定后，得到22℃条件下的水稻秸秆腐解复合菌系RSS-4。

上述技术方案所述的复合菌系筛选构建方法中，在所述步骤(3)中通过添加麸皮和无机氮来调节C/N值到28。

上述技术方案所述的复合菌系筛选构建方法中，在所述步骤(3)中取15％固体发酵菌进行转接并连续继代培养的同时以0.5℃/代进行低温梯度诱导。

由上述技术方案所述的构建方法构建的复合菌系，其中所述复合菌系为RSS-4复合菌系，包括细菌和真菌，其中细菌包括假单胞菌Pseudomonas、芽孢杆菌属Rummeliibacillus stabekisii、非脱羧勒克菌Leclerciaadecarboxylata和苍白杆菌Ochrobactrum sp.；

其中真菌包括青霉状粘束孢Graphium penicillioides和卷枝毛霉Mucorcircinelloides。

本发明具有以下有益效果：

(1)、与现有技术相比，本发明是在固体培养基条件下筛选得到的，其复合菌系的组成更具多样性，包括了细菌和真菌，从而具有更好的腐解效果；

(2)、采用本发明的筛选构建方法得到的复合菌系RSS-4是在未灭菌的固体培养基条件下进行的，筛选得到的复合菌系在中温即22℃条件下具有较好的腐解效果，有效的弥补了现有技术中的复合菌只能在28℃条件下进行腐解的不足。

说明书附图：

1、图1为水稻秸秆腐解过程中C/N比变化图；

2、图2为水稻秸秆腐解过程中pH值的变化图；

3、图3为水稻秸秆腐解过程中CMC酶活性变化；

4、图4为水稻秸秆腐解过程中半纤维素酶活性变化；

5、图5为腐解过程中水稻秸秆重量的变化；

6、图6为腐解过程中木质纤维素类物质含量的变化。

具体实施方式：

为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例1：

一种快速降解水稻秸秆的复合菌系的筛选构建方法，包括以下步骤：

(1)固体培养基的制备：

水稻秸秆粉(水稻秸秆粉碎后过60目筛)75g，麸皮(粉碎后过60目筛)30g，营养盐溶液100ml，翻搅均匀，自然pH，并进行灭菌和不灭菌两种处理；其中所述的营养盐溶液中含有(NH4)2SO4 2％、KH2PO4 0.1％、MgSO4.7H2O 0.5％、CaCl2 0.01％、NaCI 0.01％、FeSO4.7H2O0.005％、MnS04.H2O 0.0016％、ZnSO4.7H2O 0.0014％和CoCl 20.002％。

(2)菌种池的构建：

取十二个5L的塑料桶，桶中装入5kg采自中国农业科学院作科所昌平农场水稻土，保持含水量60％左右，搅拌均匀，以水稻秸秆为唯一碳源，加入尿素、磷酸二氢钾、氯化钾作基肥，施用量分别为120mg/kg、50mg/kg、120mg/kg，以此模拟大田的营养环境。

以成都采集的多年原位还田土样为原材料，将各土壤样品500g或菌剂20g依次施入桶中，在室温条件下静置培养，并且定期喷洒水分，注入新的营养盐溶液。

(3)复合菌系的筛选构建：

在不灭菌的固体发酵培养基中以水稻秸秆粉为碳源，用本领域常用手段调节C/N值至28，加水调匀后加入菌种池中的样品，培养的初始温度为28℃，含水量控制在60％左右，待pH值趋于稳定及C/N小于20(16d)时取15％固体发酵菌曲进行转接。如此连续继代培养，同时进行温度诱导，淘汰分解能力弱和不稳定的复合系，待稻秆腐解时间和速度稳定以后，即得22℃中温条件下水稻秸秆腐解复合菌系。

实施例2：

本实施例与实施例1完全相同，区别仅在于在步骤(3)中采用添加无机氮来调节固体培养基中的C/N值至28。

实施例3：

本实施例与实施例1完全相同，区别仅在于在步骤(3)中采用添加麸皮和无机氮来调节固体培养基中的C/N值至28。

实施例4：

本实施例与实施例2完全相同，区别仅在于在步骤(3)中取15％固体发酵菌进行转接并连续继代培养的同时以0.5℃/代进行低温梯度诱导。

实施例5：复合菌系RSS-4中菌种组成

在实施例1～4中筛选得到的22℃中温条件下水稻秸秆腐解复合菌系，同时发现在不灭菌的固体发酵培养基中筛选得到的复合菌系RSS-4比在灭菌的固体发酵培养基中筛选得到的复合菌系RSS-4’腐解效果要好。下述菌种组成是指复合菌系RSS-4中的菌种组成。

(1)、采用传统的平板计数法分离得到了四种细菌，分别进行了形态观察、16S rDNA测序等，鉴定结果如下：

表1 复合菌系中细菌组成

(2)、采用传统的平板计数法分离得到了三种真菌，分别进行了菌体形态观察、18S rDNA测序等，鉴定结果如下：

表2 复合菌系中真菌组成

试验例：

以下通过试验例来具体说明用本发明所述的筛选构建方法构建的复合菌系RSS-4所具有的有益效果，本试验例中所述的RSS-4是在未灭菌的固体发酵培养基中筛选得到的复合菌系；RSS-4’是在灭菌的固体发酵培养基中筛选得到的复合菌系，试验的温度条件为22℃中温条件；菌剂A为腐秆菌，购自佛山金葵子植物营养有限公司。

试验例1：腐解过程中C/N比的变化

C/N值是检验肥料腐熟度的一个重要指标。一般来讲，堆肥C/N值达到20以下，就可以认为基本腐熟，可以直接施用。腐解前的固体培养基C/N在28左右，在经过RSS-4腐解的前4d内，其比值迅速下降到23.8，此后的减小速度变慢，12d后趋于平稳，直到腐解完成后降至18.6(数值用均数±标准差表示)，说明腐解过程已经基本完成。其变化趋势如图1所示。

试验例2：腐解过程中pH的变化

由图2可知，固体培养基的初始pH偏酸，在接种复合系RSS-4后的2d内腐解产物的pH值从起始的6.23迅速升高到最高值8.15，2d后pH值开始下降，这时腐解微生物开始起作用，pH逐渐下降到7.20左右并趋于稳定。这很可能是由于开始时固体培养基中的NH4+水解使得pH偏低，随着微生物的加入及其对NH4+的利用，分泌的碱类物质得以积累，pH值开始上升；之后随着碱类物质被降解、菌种的更替及稻秆的腐解，pH值逐渐下降并最终稳定在中性条件。RSS-4’腐解稻秆的pH变化趋势与RSS-4的基本相似，只是其最初的pH更低(5.35)，最后稳定在7.50(数值用均数±标准差表示)附近，比后者的稍微高一些；而菌剂A和空白对照则与文献报道的基本相似，均经历了先降后升的变化趋势。

试验例3：腐解过程中酶活的变化

RSS-4腐解过程中用糖化力法每48h测定一次纤维素酶活力，其CMC酶活的变化曲线图3所示。由该图可知，CMC酶活在腐解的整个过程中处于升降交替的变化之中，但是其总体趋势仍可认为是先高后低，最高酶活出现在第16d，为0.90U/g，之后迅速下降并趋于稳定。相比之下，RSS-4’、菌剂A和空白对照的变化要缓和许多，其最高值分别出现在16d(0.67U/g)、14d(0.49U/g)、16d(0.34U/g)(数值用均数±标准差表示)。

半纤维素酶活的变化曲线如图4所示。据图可知，其变化趋势也大致同CMC酶活及滤纸酶活，也经历了先高后低的走势。它在腐解的12d就达到最高酶活，为3.40U/g。而RSS-4’、菌剂A和空白对照得最高值却出现在12d(2.35U/g)、16d(2.0U/g)、16d(1.30U/g)(数值用均数±标准差表示)。

综上所述，无论是CMC酶活还是半纤维酶活，复合菌系RSS-4在腐解过程中的最高值和平均值都要远大于RSS-4’、菌剂A和空白对照。这说明了复合系RSS-4不仅能够加速稻秆的腐解，并且采用未灭菌的方法筛得的复合菌系(RSS-4)比灭菌方法所得的复合菌系(RSS-4’)和菌剂A腐解效果要好。

试验例4：腐解进程中稻秆的重量变化

分别在处理培养的0d、2d、4d、6d、8d、10d、12d、14d、16d、18和20d测定稻秆的分解率，结果如图5所示。

在20d的腐解过程中，稻秸干重从起始的5.00g减少到2.73g.失重率达到了45.4％；从图中还可看出，稻秆重量的减少主要发生在腐解的前16d，腐解到16d时稻秆还剩余2.75g，重量减少45.0％，平均每天减重2.8％，此后几乎不再减少。由此可见，本实验中所构建的复合菌系RSS-4在腐解的前16d内对稻秆的分解活性始终处于较高水平。

相比之下，RSS-4’从开始的5.00g减少到3.18g，失重率为36.4％；而菌剂A和空白对照只分别减少到3.25g、3.52g(数值用均数±标准差表示)，失重率分别为35.0％、29.6％。与后面得3个处理相比，接种RSS-4处理的失重率分别要多出9.0％、10.4％和15.8％。说明复合系RSS-4能够加速稻秆的腐解，并且腐解的能力比RSS-4’和菌剂A均有所增强。

试验例5：腐解进程中木质纤维素类物质含量的变化

分别对RSS-4不同腐解时间稻秆中的纤维素类、半纤维素以及木质素含量进行了测定。其结果如图6所示。

从图6可以看出，纤维素和半纤维素含量在整个腐解过程中均逐渐减少，而且二者均在发酵的前12d内降解速度最快，其中前者的下降趋势比后者要大些。纤维素含量在前12d内下降了50.0％，而半纤维素下降了约37.0％。12d后二者的下降趋势都开始变慢，在发酵结束时纤维素的含量共减少了55.5％，半纤维素含量共减少了44.1％(数值用均数±标准差表示)；而木质素百分含量在整个发酵过程中呈上升趋势，而且前4d随着稻秸重量的迅速减少，纤维素和半纤维素的较快分解，木质素的百分含量上升速度也较快，随后处于较为平缓和的状态。这说明木质素在干稻秸中的绝对含量在发酵过程中有增无减。这表明该复合菌系对木质素几乎没有多少分解作用，进一步验证了木质素的降解是最困难的。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (4)

1.一种快速降解水稻秸秆的复合菌系的筛选构建方法，包括以下步骤：

(1)、菌种池的构建：取水稻土，保持含水量60％左右，搅拌均匀，以水稻秸秆为唯一碳源，加入尿素120mg/kg、磷酸二氢钾50mg/kg和氯化钾120mg/kg作基肥；采集多年原位还田土样施入水稻土中，室温下静置培养，获得菌源；

(2)、固体培养基的制备：取水稻秸秆粉75g，麸皮30g，营养盐溶液100ml，翻搅均匀；所述营养盐溶液中含有质量百分比的下列物质(NH4)2S042％，KH2PO4 0.1％，MgS04.7H2O 0.5％，CaCl2 0.01％，NaCI 0.01％，FeS04.7H2O0.005％，MnS04.H20 0.0016％，ZnS04.7H2O 0.0014％，CoCl2 0.002％；

(3)、复合菌系的筛选构建：在步骤(2)中得到的固体培养基中以水稻秸秆粉为碳源，调节C/N值到28，加水调匀后加入步骤(1)中菌种池中的菌源，培养的初始温度为28℃，含水量控制在60％左右，待pH值趋于稳定及C/N值小于20时取15％固体发酵菌进行转接并连续继代培养，待水稻秸秆腐解时间和速度稳定后，得到22℃条件下水稻秸秆腐解复合菌系RSS-4。

2.根据权利要求1所述的复合菌系的筛选构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中通过添加麸皮和无机氮来调节C/N值。

3.根据权利要求1或2所述的复合菌系的筛选构建方法，其特征在于：步骤(3)中取15％固体发酵菌进行转接并连续继代培养的同时以0.5℃/代进行低温梯度诱导。

4.由权利要求1～3中任一权利要求所述的筛选构建方法筛选的复合菌系，其特征在于：所述复合菌系为RSS-4复合菌系，包括细菌和真菌，其中细菌包括假单胞菌Pseudomonas、芽孢杆菌属Rummeliibacillus stabekisii、非脱羧勒克菌Leclercia adecarboxylata和苍白杆菌Ochrobactrum sp.；

其中真菌包括青霉状粘束孢Graphium penicillioides和卷枝毛霉Mucorcircinelloides。

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