CN105524873A - 一种产α-淀粉酶的菌株及其产生的酸性α-淀粉酶 - Google Patents

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Abstract

一种产α-淀粉酶的菌株及其产生的酸性α-淀粉酶，其特征在于：该菌株的名称为勒克氏菌属（<i>Leclercia？</i>sp.）菌株Z1-2-1，于2015年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为？CGMCC？No.？11587。该菌株为自主分离自土壤并经紫外诱变育种筛选而得到。利用该Z1-2-1菌株发酵制备的酸性α-淀粉酶，耐受pH范围3.4-6.4，最适作用pH6.0，最适作用温度55℃，于80℃下仍有酶活，在Ca2+？1？mmol/L时酶活最高，为未加Ca2+的124%，一定浓度的Ca2+对酶活有促进作用。

Description

一种产α-淀粉酶的菌株及其产生的酸性α-淀粉酶
技术领域
本发明涉及一种产α-淀粉酶的菌株及其产生的酸性α-淀粉酶以及其酶学性质，属于生物工程领域。
背景技术
α-淀粉酶可作用于淀粉的α-1,4糖苷键，能够快速有效地分解淀粉，广泛应用于纺织、发酵及制糖等诸多方面，在工业生产中占有极其重要的地位，是目前用途较广泛的一种酶制剂。特别是微生物产α-淀粉酶已广泛应用于食品、饮料、制药、纺织等行业。
不同的α-淀粉酶来自不同的植物、动物、微生物。微生物由于其生物多样性以及基因操作使得酶更易于积累，现在利用微生物发酵富集生产已经逐渐替代了传统从复杂真核细胞中提取α-淀粉酶的方法，成为工业α-淀粉酶生产的重点。
目前，工业生产中α-淀粉酶主要来自芽孢杆菌与曲霉。高效菌种的获得是微生物发酵α-淀粉酶的关键前提，大多从发酵废液、海底火山口处、酒糟或富含淀粉的土样中分离，诱变育种有助于进一步筛选高产菌株。
发明内容
本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种自主分离并经物理诱变筛选培育而得到的产α-淀粉酶的菌株及其产生的酸性α-淀粉酶，并得到其酸性α-淀粉酶酶学性质。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种产α-淀粉酶的菌株，菌株的名称为勒克氏菌属（Leclerciasp.）的菌株Z1-2-1，该菌株2015年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为CGMCCNo.11587。
该Z1-2-1菌株为自主分离自土壤并经紫外诱变育种筛选而得到，该菌株16SrRNA基因序列已提交GenBank数据库，登录号为KU055632。
更具体的说，本发明对自然筛选出菌株Z1-2进行紫外诱变，在经十代传代并测定酶活后，挑选出酶活较高且传代稳定菌株Z1-2-1，为62.70U/mL。
本发明提供了菌株Z1-2-1的酸性α-淀粉酶热稳定性性质，所述酸性α-淀粉酶最适温度在55℃，酶在40-50℃下相对较稳定，在60℃放置60min后，仍有较高残余酶活。
本发明提供了菌株Z1-2-1的酸性α-淀粉酶pH稳定性性质，所述酸性α-淀粉酶在pH6.0时酶活性最高，pH5.0-6.0间酶活性下降不大，该酶pH耐受范围为3.4-6.4。
本发明提供了菌株Z1-2-1的酸性α-淀粉酶Ca2+对其的影响，Z1-2-1在Ca2+浓度为1mmol/L时酶活最高，为对照的124%，一定浓度的Ca2+对酶活有促进作用。5、10、15、20mmol/LCa2+浓度对酶活有抑制作用，且随浓度升高抑制作用越强。
本发明的有益效果：自采集的面粉厂土壤中筛选获得一种产酸性α-淀粉酶的细菌菌株Z1-2-1（Leclerciasp.Z1-2-1），所产酸性α-淀粉酶酶活较高，使用pH范围广，具有良好的耐酸性和一定的耐高温性。
附图说明：
图1：不同pH下酶的稳定性。
图2：Ca2+浓度对酶活的影响。
具体实施方式
本发明用下列实例来进一步说明本发明，但不限于下列实例。
实施例1
实验室驯化土壤，制备菌悬液并以十倍梯度稀释法涂布于筛选培养基。滴加碘液，记录有透明圈的菌株。将初筛有透明圈的菌株，接种种子培养基，以10%的接种量转至发酵培养基，相同条件培养24h。发酵液离心，上清为粗酶液，测定酶活。菌种接种至种子培养基，生长至对数期，离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤两次后重悬，稀释至菌体含量108个/mL。置于紫外灯下30cm处，处理0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s，将诱变完菌液，梯度稀释，选择合适的稀释度涂布，避光培养，以未处理为对照计算致死率。
筛选培养基（g/L）：牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，可溶性淀粉10，琼脂粉15。使用前将pH调至5.0。
种子培养基（g/L）：胰蛋白胨5，可溶性淀粉10，(NH4)2SO42.5，KH2PO43，CaCl20.2，pH调至5.0。
发酵培养基：同于上述种子培养基。
酶活测定方法为DNS法。
酶活定义：60℃、pH6.0条件下，1mL酶液每分钟水解淀粉产生1mg麦芽糖的酶量为一个酶活力单位，单位为U/mL。
酶活公式：待测酶活（U/mL）=D*(R-R0)/10/0.5，其中D：稀释倍数，R0：对照麦芽糖量，R：酶液反应10min后麦芽糖量，10：反应10min，0.5：0.5mL酶液。
筛选出产酸性α-淀粉酶的菌株中，Z1-2菌株的透明圈/菌落直径比最大，D/d为5，选其作为实验菌株。
Z1-2经紫外诱变，以酶活提高最大的菌株Z1-2-1为实验菌株，诱变后酶活达62.70U/mL。经十代传代培养测定酶活，其传代较稳定，酶活基本保持不变。
实施例2
热稳定性：37℃、200r/min培养12h的发酵液上清作为粗酶，设置40、50、55、60、65、70、80和90℃温度条件测定酶活以确定酶反应最适温度。
酶液在40、50、60、70、80、90℃水浴锅中保温60min，每隔15min取1mL酶液迅速放在冰上冷却，然后测定酶活性，判断酶的热稳定性，该酶在40-50℃下相对较稳定，在60℃放置60min后，仍有较高酶活。
pH稳定性：37℃、200r/min培养12h的发酵液上清作为粗酶，将酶反应体系pH值设为3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0、6.4。酶活性最高的反应体系pH即为酶的最适作用pH值。该酶pH6.0时酶活最高，pH4.4-6.4条件下均保持80%以上的相对酶活。
将粗酶液放在上述不同pH值的缓冲液中，55℃保温30min，然后测定酶活性，从而判断酶对pH的稳定性，测定结果见图1。
Ca2+对酶活的影响：37℃、200r/min培养12h的发酵液上清作为粗酶，在酶反应体系分别添加1、5、10、15、20mmol/LCa2+，测定酶活，确定Ca2+对酶活的影响，测定结果见图2。

Claims (3)

1.一种产α-淀粉酶的菌株，其特征在于：菌株的名称为勒克氏菌属（Leclerciasp.）Z1-2-1，该菌株2015年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.11587。
2.根据权利要求1所述的产α-淀粉酶的菌株，其特征在于：该菌株为自主分离自土壤并经紫外诱变育种筛选而得到，该菌株16SrRNA基因序列已提交GenBank数据库，登录号为KU055632。
3.一种利用权1-2所述菌株发酵制备的酸性α-淀粉酶，其特征在于：所述酸性α-淀粉酶耐受pH范围3.4-6.4，pH6.0、温度55℃时酶活最高，于80℃下仍有酶活，在Ca2+1mmol/L时酶活最高，为未加Ca2+的124%，一定浓度的Ca2+对酶活有促进作用。
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