CN103571762A - 一种高山被孢霉重组基因表达系统及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高山被孢霉（Mortierella alpina ATCC 32222）的重组基因表达系统及应用。本发明采用高山被孢霉ATCC 32222尿嘧啶营养缺陷型菌株为材料，运用根癌土壤杆菌介导的遗传操作技术进行基因操作，构建了一套高山被孢霉重组基因表达系统。并运用这套系统操作，得到多株高产多不饱和脂肪酸高山被孢霉菌株，对产油真菌高山被孢霉ATCC 32222的基础理论研究及产品开发具有重要的意义。

Description

一种高山被孢霉重组基因表达系统及其构建方法和应用
【技术领域】
本发明涉及一种高山被孢霉的重组基因表达系统及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。 
【背景技术】
高山被孢霉是一种重要的产油丝状真菌，它具有花生四烯酸（AA）含量高、安全、多不饱和脂肪酸（PUFAs）组成合理等特点，已经应用于工业生产AA。目前对高山被孢霉高产菌株的研究主要集中在菌种选育和发酵条件优化等方面。由于缺乏一种有效的高山被孢霉的基因操作系统，目前还不能对这种极具价值的丝状真菌进行遗传改造。这就为高山被孢霉脂肪酸合成途径的基础理论研究和基因工程生产菌株的构建构成了不可逾越的障碍。 
丝状真菌的基因操作系统一直落后于其它物种而没有被很好地建立起来，主要归咎于丝状真菌难以被转化的特点。尤其以具有高山被孢霉这类特点的真菌最难以被转化：多核，无隔，产孢能力低且对抗生素不敏感。因此，国内一直未见这种重要的工业生产微生物遗传改造的报道。除了不同丝状真菌种类自身的特点及偏好性，转化方法的选择也是决定丝状真菌能否被转化的关键因素。目前，丝状真菌的转化和方法主要由以下几种：原生质体转化，电穿孔转化，基因枪转化和农杆菌介导转化方法。其中，原生质体转化和电穿孔转化需要将受体的细胞壁降解制备原生质体，培养难度大，再生频率低且实验周期长。基因枪转化虽然具有简单便捷的优点，但是需要较大的受体基数且转化成本过高。农杆菌的转化技术作为一种最早被应用于植物的常规转化技术，早在20年前就已经被报道具有转化真菌的能力。到目前为止，农杆菌的转化技术已经成功的应用到超过一百二十多种真菌。和其它转化方法相比，农杆菌转化方法具有几个突出优点：受体细胞广泛，可以是孢子或菌丝，且不需要制备原生质体；转化效率高，成功率高，载体可容纳大片段的异源DNA；基本上为单拷贝随机插入宿主染色体中；可以提高同源重组效率。因此，根癌土壤杆菌的转化方法为高山被孢霉表达系统的构 建提供了重要的操作手段。 
苹果酸酶（malic enzyme；EC1.1.1.40），催化细胞内苹果酸生成丙酮酸的反应，是生物体内一种重要的NADPH产生来源。早在上世纪九十年代，苹果酸酶就被推测为产油丝状真菌脂肪酸合成途径中的重要因素。在另外一种同属于接合菌亚门的丝状真菌—卷枝毛霉中，苹果酸酶的活性在被芝麻粉（一种特异性抑制卷枝毛霉苹果酸酶活的化学抑制剂）抑制的情况下，细胞内总脂肪含量受到了显著影响。在英国赫尔大学Colin教授等人的相关研究基础上，苹果酸酶被推断为产油真菌脂肪酸合成过程中的重要限速步骤。随后，在对高山被孢霉发酵过程中一系列产生NADPH的酶活的系统研究中，苹果酸酶也被推测与高山被孢霉细胞内脂肪酸合成密切相关。但是，由于缺乏一种有效的重组基因表达系统，此种理论在高山被孢霉中一直没有得到验证和应用。本发明以申请号为201310347934.8的专利申请中公开的Mortierella alpina ATCC32222尿嘧啶营养缺陷型菌株作为转化菌株，在其基础上通过进一步的基因重组方法构建了一种新的能够高表达重组苹果酸酶的遗传表达系统。申请号为201310347934.8的专利申请所公开的全部内容均引入本申请作为参考。 
中国专利申请201310347934.8公开的技术方案包括一种高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，该菌株是通过失活Mortierella alpina ATCC32222基因组中编码乳清酸磷酸核糖转移酶OPRTase的ura5基因构建而成的。 
所述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株，ura5基因的失活是通过缺失654bp的ura5基因中的213bp-230bp共18bp的序列而实现的。 
中国专利申请201310347934.8还公开一种制备上述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株的方法，通过同源重组使高山被孢霉ura5基因中的213bp-230bp共18bp序列缺失从而使ura5基因失活，所使用的同源臂分别是ura5基因上游-1180至+212的1393bp和下游+231至+1592的1362bp的片段，具体步骤为：首先获得ura5敲除基因片段，并进一步构建敲除质粒pBIG4KOura5，然后用重组质粒pBIG4KOura5转化根癌土壤杆菌，最后用经转化的含质粒pBIG4KOura5的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉并对转化后的高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得尿嘧啶营养缺陷型菌株。 
所述方法使用的根癌土壤杆菌为：Agrobacterium tumefaciensC58C1。 
基因敲除使用的根癌土壤杆菌起始载体为：pBIG2RHPH2。 
基因敲除载体构建的具体步骤如下： 
1）用PCR的方法获得质粒pBluescript II SK+的MCS基因片段； 
2）用限制性内切酶EcoRI和XbaI对MCS基因片段和质粒pBIG2RHPH2进行酶切，并通过连接反应将MCS基因片段插入质粒pBIG2RHPH2的EcoRI和XbaI位点之间得到质粒pBIG4； 
3）用融合PCR的方法获得并连接ura5基因的上下游序列，得到敲除基因片段； 
4）用限制性内切酶EcoRI和KpnI对敲除基因片段和质粒pBIG4进行酶切，并通过连接反应将敲除基因片段插入质粒pBIG4获得pBIG4KOura5。 
优选地，步骤3）中的敲除基因片段是通过下述步骤获得的， 
首先根据NCBI数据库设计如下引物 
P1：GACCGGAATTCCGACGCTGACATTACACATTTATCC 
P2：TGACGGTGGTGCAGGCCAGAGGGCCAAAGATGATGTCGTGCTCAATG 
P3：TTGAGCACGACATCATCTTTGGCCCTCTGGCCTGCACCACCGTCATT 
P4：TGCGGGGTACCCATGCGAATCACAGATATGG 
然后以高山被孢霉ATCC32222基因组为模板，用引物P1、P2和引物P3、P4分别扩增上下游片段，再以上下游片段为模板，在反应体系中加入P1、P4进行融合PCR反应，获得KOura5敲除基因片段。 
优选地，根据质粒pBluescript II SK+的序列信息设计如下引物： 
MCS上游：TTTCGCTAGCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT 
MCS下游：AACAACAATTGGGGCTCCACCGCGGTGGCGGCCG 
然后用PCR的方法获得步骤1）中的质粒pBluescriptIISK+的MCS基因片段。 
优选地所述的根癌土壤杆菌介导的基因敲除方法是采用根癌土壤杆菌转化高山被孢霉，具体为：取100μL根癌土壤杆菌与100μL高山被孢霉孢子液混合，均匀涂布于铺有玻璃纸IM固体培养基上，进行转化培养，然后筛选获得高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株。 
优选地，根癌土壤杆菌转化高山被孢霉的具体步骤如下： 
（1）取保存于-80℃的含有质粒pBIG4KOura5的根癌土壤杆菌C58C1于含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板划线；30℃倒置避光培养48小时； 
⑵挑取单克隆接种至20mL含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的液体YEP培养基中30℃，200rpm避光培养24-48小时； 
⑶4000g离心5分钟收集菌体，倒掉上清，加5mLIM培养基重悬菌体，4000g离心5分钟，倒掉上清，加2mLIM培养基重悬菌体； 
⑷用IM培养基调整菌浓度至OD600=0.9，30℃，200rpm避光培养至ＯＤ600＝1.5； 
⑸收集高山被孢霉孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到106个每100μL； 
⑹取100μL根癌土壤杆菌与100μL孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸IM固体培养基上，23℃避光培养48-96小时； 
⑺将玻璃纸转移到含有100μg/mL壮观霉素，100μg/mL头孢噻肟，0.05g/L尿嘧啶的GY平板上，25-30℃培养至产生大量孢子。 
中国专利申请201310347934.8获得的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens C58C1-pBIG4K Oura5已于2013年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.7730。 
【发明内容】
本发明要解决的技术问题是提供一种高山被孢霉的重组基因表达系统。所述高山被孢霉的重组基因表达系统通过根癌土壤杆菌转化（ATMT）的方法转化Mortierella alpina ATCC32222尿嘧啶营养缺陷菌株型来实现的。 
所述重组基因表达系统的选择标记ura5基因，苹果酸酶1基因malE1和苹果酸酶2基因malE2的DNA序列来源于Mortierella alpina ATCC32222基因组（DDBJ/EMBL/GenBank accession ADAG00000000,first version ADAG01000000）中。 
本发明还提供了一种构建高山被孢霉重组基因表达系统的方法，具体步骤如图1，所述方法包括用PCR的方法从pD4质粒上获得HPH表达单元，将HPH表达单元用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，插入到EcoRI和XbaI酶切过的pET28a（+）的多克隆位点（MCS）中，得到质粒pET28a-HPHs。利用PCR从高山被孢霉cDNA中获得ura5(乳清酸磷酸核糖转移酶；OPRTase）基因，并利用限制性内切酶BspHI和BamHI酶切ura5基因，将酶切过的ura5基因插入到NcoI和BamHI酶切过的质粒pET28a-HPHs中，以替换的hpt基因，构建质粒 pET28a-ura5s。用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切质粒pET28a-ura5s得到ura5s表达单元。将ura5s表达单元替换质粒pBIG2RHPH2中的HPH表达单元，进一步构建质粒转化质粒pBIG2-ura5s，然后用重组质粒pBIG2-ura5s转化根癌土壤杆菌，最后用经转化的含质粒pBIG2-ura5s的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型并对转化后的高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得表型互补菌株，从而实现高山被孢霉的遗传转化。 
进一步在质粒pBIG2-ura5s的基础上，构建苹果酸酶1过表达载体。用PCR的方法从高山被孢霉cDNA中获得苹果酸酶1基因malE1。用限制性内切酶BspHI和BamHI，NcoI和BamHI分别对malE1基因片段和质粒pET28a-HPHs进行酶切，并通过连接反应将malE1基因片段插入质粒pET28a-HPHs的NcoI和BamHI位点之间得到质粒pET28a-malE1。用限制性内切酶SpeI和XbaI双酶切质粒pET28a-malE1，得到malE1表达单元。将malE1表达单元插入到XbaI酶切过的质粒pBIG2-ura5s中，得到质粒pBIG2-ura5s-malE1。然后用重组质粒pBIG2-ura5s-malE1转化根癌土壤杆菌，最后用经转化的含质粒pBIG2-ura5s-malE1的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens C58C1pBIG2-ura5s-malE1转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型并对转化后的高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得表型互补菌株高山被孢霉MA-malE1-1、MA-malE1-2和MA-malE1-3，从而实现构建苹果酸酶1基因在高山被孢霉的同源过量表达。 
更进一步的在质粒pBIG2-ura5s和质粒pET28a-HPHs的基础上，构建高山被孢霉基因操作通用载体。具体步骤如图2，用PCR的方法从高山被孢霉基因组中获得非编码的内含子DNA片段IT。用限制性内切酶NcoI和BamHI分别对IT基因片段和质粒pET28a-HPHs进行酶切，并通过连接反应将IT片段取代质粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到质粒pET28a-ITs。用限制性内切酶SpeI和XbaI双酶切质粒pET28a-ITs得到ITs表达单元。将ITs表达单元插入到XbaI酶切过的质粒pBIG2-ura5s中，高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs。 
再进一步，在高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs的基础上，构建苹果酸酶2过表达载体。分别用KpnI和XmaI双酶切malE2基因和 pBIG2-ura5s-ITs，用连接酶进行连接，得到malE2表达质粒pBIG2-ura5s-malE2。然后用重组质粒pBIG2-ura5s-malE2转化根癌土壤杆菌，最后用经转化的含质粒pBIG2-ura5s-malE2的根癌土壤杆菌Agrobacterium tumefaciens C58C1pBIG2-ura5s-malE2转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型并对转化后的高山被孢霉进行筛选和鉴定，获得表型互补菌株MA-malE2-1、MA-malE2-2和MA-malE2-3，从而实现构建苹果酸酶2基因在高山被孢霉的同源过量表达。 
具体地，本发明提供一种高山被孢霉重组基因表达系统，该系统是通过ATMT的方法转化Mortierella alpina ATCC32222尿嘧啶营养缺陷型菌株构建成的。并且利用这一重组基因表达系统构建了高山被孢霉苹果酸酶1（malic enzyme1；ME1）和苹果酸酶2（malic enzyme2；ME2）过量表达菌株。 
其中所使用的质粒pD4（Mackenzie D A,Wongwathanarat P,Carter A T,et al.Isolation and use of a homologous histone H4 promoter and a ribosomal DNA region in a transformation vector for the oil-producing fungus Mortierella alpina[J].Applied and environmental microbiology,2000,66(11):4655-4661），质粒pBIG2RHPH2和Agrobacterium tumefaciens C58C1（Tsuji G,Fujii S,Fujihara N,et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation for random insertional mutagenesis in Colletotrichum lagenarium[J].Journal of General Plant Pathology,2003,69(4):230-239.）均为公开获得。 
高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株为PUFAs生产菌株的基因操作提供了先决条件。本发明的方法在现有的尿嘧啶营养缺陷型菌株的基础上，通过基因工程方法最终获得了表型互补菌株，实现了苹果酸酶1基因和苹果酸酶2基因在高山被孢霉中的同源过量表达。该互补菌株对于进一步研究苹果酸酶与高山被孢霉细胞内脂肪酸的合成的相互关系具有重要意义，可用作高水平生产脂肪酸的候选菌株。 
本发明的涉及的菌种保藏信息如下： 
Agrobacterium tumefaciens C58C1pBIG2-ura5s-malE1，于2013年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址100101北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.8250； 
Agrobacterium tumefaciens C58C1pBIG2-ura5s-malE2，于2013年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.8261； 
Agrobacterium tumefaciens C58C1pBIG2-ura5s-ITs，于2013年9月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址100101北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.8249。 
【附图说明】
图1为构建转化高山被孢霉所用质粒pBIG2-ura5s-malE1的示意图。 
图2为构建转化高山被孢霉所用质粒pBIG2-ura5s-malE2的示意图。 
图3为鉴定的重组菌株琼脂糖凝胶电泳图， 
图4为鉴定的重组菌株琼脂糖凝胶电泳图。 
图5为malE1过表达菌株ME1转录水平、翻译水平、酶活检测及脂肪组检测结果图。 
图6为malE2过表达菌株ME2转录水平，酶活检测及脂肪酸检测结果图。 
【具体实施方式】
以下通过实施例来进一步阐述本发明，下例实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册进行实验操作。 
实施例1：高山被孢霉ATCC32222基因组生物信息学分析 
根据高山被孢霉ATCC32222基因组信息（DDBJ/EMBL/GenBank accession ADAG00000000,first version ADAG01000000）预测的蛋白质编码序列经BLAST对蛋白数据库NR(www.ncbi.nlm.nih.gov)，KOGs和COGs，KEGG，UniRef100和Swiss-Prot，BRENDA搜索比对。使用InterProScan对蛋白质结构数据库进行比对。预测得到编码OPRTase的ura5基因coding序列全长654bp。预测得到的 编码ME1的malE1基因coding序列全长1752bp。预测得到的编码ME2的malE2基因coding序列全长1857bp。 
实施例2：高山被孢霉总RNA提取 
⑴取出适量在液氮中冻存的菌体于无菌无酶研钵中充分研磨。 
⑵加入TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)试剂1mL继续研磨后室温放置至溶解。 
⑶吸取1mL⑵中液体于无酶离心管中，加入200μL三氯甲烷混均。 
⑷12000rpm，4℃，离心15min吸上清于新的无酶离心管中。 
⑸加入等体积异丙醇，静置15min，12000rpm，4℃，离心15min。 
⑹无酶枪头吸取去出异丙醇尽量吸干。 
⑺沉淀用70%乙醇洗一次，12000rpm，4℃，离心15min。 
⑻无酶水溶解总RNA，-80℃储存。 
⑼浓度测定：取2μL总RNA于离心管中Nanodrop2000测定浓度。 
⑽跑胶：取1μg总RNA跑1.2%琼脂糖电泳检测总RNA完整性。 
实施例3：获得ura5基因，malE1基因和malE2基因以及IT片段 
⑴取0.5-1μg总RNA为模板，根据PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa,Otsu,Shiga,Japan)试剂盒说明进行操作，获得高山被孢霉cDNA。 
⑵根据基因组生物信息学分析结果，针对预测的ura5基因，malE1基因和malE2以及IT基因编码序列设计引物（酶切位点用下划线表示）： 
URA5F：ACATCATGACCATCAAGGAATACCAGCGCG 
URA5R：TCGGGATCCCTAAACACCGTACTTCTCC 
malE1F：CATGCGTCATGACTGTCAGCGAAAACACC 
malE1R：TACGCGGATCCTTAGAGGTGAGGGGCAAAGG 
malE2F：ATCGGGGTACCATGTTGAGGAATCCTGCTCTCA 
malE2R：TAATTCCCCCGGGTCAGGGGTGCGATTCCAG 
ITF：GCATGCCATGGAGAAGCTTGGTACCGCTAGCTCCCAAGCGAATTTGTCATCTCG 
ITR：CGCGGATCCGAGCTCCCCGGGGGACTCGAGAGCATACGGAAGTCCATCAGTTACG 
⑶以cDNA为模板，用以上两对引物进行PCR反应，得到ura5基因和malE1基因。 
⑷将得到的PCR产物连接到pEGM-Teasy(Promega,Mandison,WI,USA)载体上，经3730测序鉴定后，转化大肠杆菌TOP10中-80℃保存。 
实施例4：选择标记质粒pBIG2-ura5s的构建 
根据质粒pD4的序列信息设计引物： 
HPHF：GAGACGAATTCGCCCGTACGGCCGACTAGTTTTAGTTGATGTGAG 
HPHR：GTTCCTCGTCTAGACCTCTAAACAAGTGTACCTGTGCATTCTGGG 
用PCR的方法获得HPH表达单元。 
用限制性内切酶EcoRI和XbaI对HPH表达单元和质粒pET28a进行双酶切，试剂盒回收后，使用T4连接酶连接。连接体系为（10μL）：HPH表达单元2μL，载体1μL，10×T4连接酶buffer1μL，T4连接酶1μL，无菌水51μL，4℃过夜连接。 
连接产物转化大肠杆菌TOP10感受态。转化方法如下： 
⑴无菌状态下取100μL感受态细胞，加入2μL连接产物，混匀。 
⑵将⑴中感受态移入电转杯中，避免气泡。 
⑶将电转杯放入Bio-Rad电转仪，调到预设程序档位，电转。 
⑷电转后的感受态移至含有900μL SOC复苏培养基的离心管中，37℃，100rpm1小时。 
⑸取200μL涂布100μg/mL卡那霉素抗性YEP固体培养基平板。倒置37℃培养过夜。 
挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证，结果表明连接成功。获得质粒pET28a-HPHs。 
用限制性内切酶BspHI和BamHI，NcoI和BamHI对ura5基因片段和质粒pET28a-HPHs进行酶切，试剂盒回收后，使用T4连接酶连接，转化TOP10感受态，挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证，结果表明连接成功。获得质粒pET28a-ura5s。 
利用引物HPHF和HPHR，以质粒pET28a-ura5s为模板进行PCR反应。得到ura5s表达单元。 
用限制性内切酶SpeI和XbaI，XbaI对ura5表达单元和质粒pBIG2RHPH2进行酶切，试剂盒回收后，使用T4连接酶连接，转化TOP10感受态，挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证，结果表明连接成功。获得质粒pBIG2-ura5s。 
其中，SOC复苏培养基是以组分20g/LTryptone,5g/L酵母粉，0.5g/LNaCl,2.5mMKCl,10mMMgCl，2.20mM葡萄糖构成的；YEP固体培养基是以组分10g/L Tryptone,10g/L酵母粉，5g/LNaCl，20g/L琼脂构成的。 
实施例5：ME1表达质粒pBIG2-ura5s-malE1的构建 
用限制性内切酶BspHI和BamHI，NcoI和BamHI对malE1基因片段和质粒pET28a-HPHs进行双酶切，试剂盒回收后，使用T4连接酶连接，转化TOP10感受态，挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证，结果表明连接成功。获得质粒pET28a-malE1。 
利用引物HPHF和HPHR，以质粒pET28a-malE1为模板进行PCR反应。得到malE1表达单元。 
用限制性内切酶SpeI和XbaI，XbaI对malE1表达单元和质粒pBIG2-ura5s进行酶切，试剂盒回收后，使用T4连接酶连接，转化TOP10感受态，挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证，结果表明连接成功。获得质粒pBIG2-ura5s-malE1。 
实施例6：高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs以及ME2表达质粒pBIG2-ura5s-malE2的构建 
利用引物ITF和ITR以高山被孢霉基因组为模板进行PCR反应，获得内含子DNA片段IT。 
用限制性内切酶NcoI和BamHI分别对IT基因片段和质粒pET28a-HPHs进 行酶切，试剂盒回收后，通过连接反应将IT片段取代质粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到质粒pET28a-ITs。 
用限制性内切酶SpeI和XbaI双酶切质粒pET28a-ITs，试剂盒回收得到ITs表达单元。通过连接酶连接，将ITs表达单元插入到XbaI酶切过的质粒pBIG2-ura5s中，转化TOP10感受态，挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证，结果表明连接成功。获得高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs。 
分别用KpnI和XmaI双酶切malE2基因和pBIG2-ura5s-ITs，用连接酶进行连接，转化TOP10感受态，挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证，结果表明连接成功。得到malE2表达质粒pBIG2-ura5s-malE2。 
实施例7：根癌土壤杆菌介导转化高山被孢霉 
在已有的国内外文献有关根癌土壤杆菌转化方法报道的基础上，做了适当的优化调整，具体成功实施例如下： 
⑴取保存于-80℃的含有质粒pBIG2-ura5s或pBIG2-ura5s-malE1的根癌土壤杆菌C58C1于含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的YEP固体培养基平板划线。30℃倒置避光培养48小时。 
⑵挑取单克隆接种至20mL含有100μg/mL利福平和100μg/mL卡那霉素的液体YEP培养基中30℃，200rpm避光培养24-48小时。 
⑶4000g离心5分钟收集菌体，倒掉上清。加5mLIM培养基重悬菌体，4000g离心5分钟，倒掉上清。加2mLIM培养基重悬菌体。 
⑷用IM培养基调整菌浓度至OD600=1.0。30℃，200rpm避光培养至OD600=1.5。 
⑸收集高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株（申请号为201310347934.8的专利申请中公开的Mortierella alpina ATCC32222尿嘧啶营养缺陷型菌株）孢子，用血球计数器计数，调整孢子浓度到每100μL107个。 
⑹取100μL根癌土壤杆菌与100μL孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸IM固体培养基上。23℃避光培养48-96小时。 
⑺将玻璃纸转移到含有100μg/mL壮观霉素，100μg/mL头孢噻肟的GY平 板上。25-30℃培养至有明显生长的菌落产生。 
⑻及时挑取明显生长的菌落，转移至含有100μg/mL壮观霉素，100μg/mL头孢噻肟的SC平板上，待鉴定。 
其中，MM培养基成分是以组分1.74g/LK2HPO4，1.37g/LKH2PO4，0.146g/LNaCl，0.49g/LMgSO4·7H2，0.078g/LCaCl2，0.0025g/LFeSO4·7H2O，0.53g/L(NH4)2SO4，7.8g/LMES，1.8g/L葡萄糖，0.5%甘油构成的。IM培养基是在MM培养基的基础上添加200μM乙酰丁香酮（AS）构成的。SC培养基是以组分5g/LYest Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate，1.7g/L(NH4)2SO4，20g/L葡萄糖，20mg/L腺嘌呤，30mg/L Tyrosine络氨酸，1mg/L Methionine甲硫氨酸，2mg/LHistidine组氨酸，4mg/LLysine赖氨酸，4mg/LTryptophan色氨酸，5mg/L Threonine苏氨酸，6mg/L Isoleucine异亮氨酸，6mg/L Leucine亮氨酸，6mg/L Phenylalanine苯丙氨酸，2mg/L Arginine精氨酸为组分构成的。 
实施例8：重组菌株的筛选和鉴定 
⑴将挑取在SC平板上的菌落于25-30℃培养3-5天，至明显生长。 
⑵挑取菌落边缘的新生菌丝，接种于新鲜的含有100μg/mL壮观霉素，100μg/mL头孢噻肟的SC平板上直至产孢子。 
⑶用3mL生理盐水冲刷共培养的平皿表面，收集液体于一个无菌1.5mL离心管中。过25μm滤膜。 
⑷取200μL涂布于新鲜的含有100μg/mL壮观霉素，100μg/mL头孢噻肟的SC平板上直至产孢子。共传代3次。 
⑸将⑷中明显生长的菌落分别接种到含有1mg/mL5-FOA和不含有1mg/mL5-FOA的GY固体平板上。25℃培养2-4天。 
⑹观察高山被孢霉在两种平板上的生长情况。挑出不在1mg/mL5-FOA平板上生长的菌落，接种于GY斜面上。 
⑺提取具有尿嘧啶营养缺陷型表型高山被孢霉基因组。设计两对与启动子和终止子特异性结合的引物进行PCR验证： 
HisproF1：CACACACAAACCTCTCTCCCACT 
TrpCR1：CAAATGAACGTATCTTATCGAGATCC 
HisproF2：GTGTTCACTCGCATCCCGC 
TrpCR2：AGGCACTCTTTGCTGCTTGG 
进行PCR反应，鉴定为重组菌株（图3，4）。M为marker。A为引物HisproF1和TrpCR1的PCR产物；B为引物HisproF2和TrpCR2的PCR产物。M.alpina为野生型对照，MAU1为受体菌株对照，用两对引物进行PCR反应均无产物。图3中pBIG2-ura5s和pBIG2-ura5s-malE1是质粒为模板的阳性对照；MAUC1，MAUC2,MAUC3为pBIG2-ura5s转化的重组菌株，用引物对A和B分别可扩增出818bp和861bp的条带，与以质粒pBIG2-ura5s为模板的阳性对照一致；MA-malE1-1，MA-malE1-2，MA-malE1-3为pBIG2-ura5s-malE1转化的重组菌株，用引物对A和B分别可扩增出两条产物条带：818bp、1916bp和861bp、1959bp，与以质粒pBIG2-ura5s-malE1为模板的阳性对照一致。图4中，pBIG2-ura5s-malE2是以质粒为模板的阳性对照；MA-malE2-1，MA-malE2-2，MA-malE2-3是pBIG2-ura5s-malE2转化的重组菌株，用引物对A和B分别可扩增出两条产物条带：818bp、2021bp和861bp、2064bp，与以质粒pBIG2-ura5s-malE2为模板的阳性对照一致。 
⑻重组菌株保藏于GY斜面上。 
实施例9：阳性转化子的malE1基因和malE2基因转录水平RT-qPCR检测 
根据预测的malE1基因、malE2基因序列和内参18SrDNA序列设计引物： 
malE1RTF：GGCTGTTGCCGAAGGGACT 
malE1RTR：GGCAAAGGTGGTGCTGATTTC 
malE2RTF：CCTTGCAGGACCGTAACGAGA 
malE2RTR：CCTGGAGCGACGATAAATGGA 
18SRTF：CGTACTACCGATTGAATGGCTTAG 
18SRTR：CCTACGGAAACCTTGTTACGACT 
根据实施例2和实施例3中的描述进行操作获得重组菌株的cDNA。使用ABI-Prism 7900 sequence detection system(Applied Biosystems,CA)按照SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,CA)的说明进行RT-qPCR反应。反应体系为：10μlSYBRGreenPCRMasterMix,两种引物各0.5μl,8μl无酶水,1μl模板。PCR循环设置为50℃ 2min,95℃ 10min,40个循环。18SrRNA作为内参基因。所有样品测三个重复。结果如图5A所示。M.alpina为野生型对照；MAU1，MAU2，MAU3为受体菌株对照；MAUC1，MAUC2,MAUC3为pBIG2-ura5s重组菌株，所示malE1表达量未受ura5选择标记基因影响；MA-malE1-1，MA-malE1-2，MA-malE1-3为pBIG2-ura5s-malE1重组菌株，所示malE1基因表达量均明显高于对照菌株。如图6A所示，M.alpina为野生型对照；MAU1为受体菌株对照；MA-malE2-1，MA-malE2-2，MA-malE2-3为pBIG2-ura5s-malE2转化的重组菌株，所示malE2基因表达量均明显高于对照菌株。 
实施例10：重组菌株细胞内ME1蛋白Western Blot检测 
⑴液氮研磨菌体提取细胞总蛋白。 
⑵测定蛋白浓度后，点样量10μg每泳道于Bio-Rad电泳仪中跑SDS-PAGE电泳，至Marker完全分离。 
⑶于Bio-Rad电泳仪中将蛋白凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上。转膜条件50V，3h。 
⑷转膜完成后，将PVDF膜浸泡在5%脱脂奶粉中于水平摇床上室温孵育30-40min。 
⑸将PVDF膜浸泡在TBST缓冲液中于水平摇床上室温孵育10min。重复三次。 
⑹将具有ME1特异性的一抗（由上海生物工程有限公司根据ME1蛋白质序列制备）以1:3000的比例溶于TBST中于水平摇床上孵育PVDF膜1h。 
⑺将PVDF膜浸泡在TBST缓冲液中于水平摇床上室温孵育10min。重复三次。 
⑻将羊抗兔二抗以1:5000用5%脱脂乳稀释孵育PVDF膜1h。 
⑼将PVDF膜浸泡在TBST缓冲液中于水平摇床上室温孵育10min。重复三 次。 
⑽将PVDF膜用ECL法显影。在暗室中用胶片曝光。 
结果如图5B所示。其中M.alpina为野生型对照；MAU1，MAU2，MAU3为受体菌株对照；MAUC1，MAUC2,MAUC3为pBIG2-ura5s重组菌株；MA-malE1-1，MA-malE1-2，MA-malE1-3为pBIG2-ura5s-malE1重组菌株。由图中结果可以看出，重组菌株MA-malE1-1，MA-malE1-2，MA-malE1-3中的ME1蛋白的水平明显高于受体对照菌株和pBIG2-ura5s重组菌株。 
实施例11：重组菌株细胞内ME活性测定 
⑴液氮研磨菌体提取细胞总蛋白。 
⑵配制活性测定体系：80mMKH2PO4/KOHpH7.5，0.6mMNADP+，3mMMgCl2，粗蛋白液（蛋白约30μg）。 
⑶30℃保温2min，待数值基本稳定后，加入苹果酸（pH6.8），终浓度25mM。 
⑷于340nm处测定3min，根据单位时间内吸光值的变化计算酶活。 
测定结果如图5C。其中M.alpina为野生型对照；MAU1，MAU2，MAU3为受体菌株对照；MAUC1，MAUC2,MAUC3为pBIG2-ura5s重组菌株；MA-malE1-1，MA-malE1-2，MA-malE1-3为pBIG2-ura5s-malE1重组菌株。如图6BM.alpina为野生型对照；MAU1为受体菌株对照；MA-malE2-1，MA-malE2-2，MA-malE2-3为pBIG2-ura5s-malE2转化的重组菌株。如图5C、6B所示，所有苹果酸酶过量表达菌株中ME活性均有显著提高。 
实施例12：高山被孢霉脂肪组提取与检测 
⑴将高山被孢霉原养型菌株与重组菌株于发酵培养基中，28℃，500rpm在5L发酵罐中培养144小时。 
⑵收集菌体，冷冻干燥。 
⑶取100mg干重菌丝，加入2mL4mol/L盐酸。 
⑷80℃水浴0.5小时，-80℃15分钟。重复一次。80℃水浴0.5小时。 
⑸冷却至室温，加入1mL甲醇，混匀。 
⑹加入1mL氯仿，震荡10分钟。6000g离心3分钟。收集氯仿。 
⑺重复⑹两次。 
⑻合并氯仿，加入1mL饱和氯化钠，混匀，3000g离心3分钟。收集氯仿层于新瓶。剩余液体加入1mL氯仿，3000g离心3分钟。合并氯仿（4mL）。 
⑼氮吹干燥，加入1mL乙醚，转移至洁净的已经称重的瓶中。氮吹干燥，称重得到总脂肪重量。 
⑽GC分析脂肪组构成。分析结果见图5D、6C，灰色代表花生四烯酸，浅灰色代表其它ω6多不饱和脂肪酸，白色代表其它脂肪酸。其中M.alpina为野生型对照；MAU1，MAU2，MAU3为受体菌株对照；MAUC1，MAUC2,MAUC3为pBIG2-ura5s重组菌株；MA-malE1-1，MA-malE1-2，MA-malE1-3为pBIG2-ura5s-malE1重组菌株；MA-malE2-1，MA-malE2-2，MA-malE2-3为pBIG2-ura5s-malE2重组菌株。由图5D所示结果可以看出，重组菌株MA-malE1-1，MA-malE1-2，MA-malE1-3中总脂肪酸含量相对于对照菌株均有30%的提高；同时细胞内AA的含量也有一定增加。由图6C所示结果可以看出，重组菌株MA-malE2-1，MA-malE2-2，MA-malE2-3中总脂肪酸含量没有明显提高，但是细胞内AA含量显著增加。 
其中，发酵培养基是以组分50g/L葡萄糖,2.0g/L L-酒石酸铵,7.0g/LKH2PO4,2.0g/L Na2HPO4,1.5g/L MgSO4·7H2O，1.5g/L Yeast extract，0.1g/LCaC12·2H2O，8mg/L FeCl3·6H2O，1mg/L ZnSO4·7H2O，0.1mg/L CuSO4·5H2O，0.1mg/LCo（NO3）2·6H2O，0.1mg/L MnSO4·5H2O构成的。 
虽然本发明专利已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。 
Figure IDA0000404567790000011
Figure IDA0000404567790000021
Figure IDA0000404567790000031
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Figure IDA0000404567790000071
Figure IDA0000404567790000081
Figure IDA0000404567790000091
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Claims (10)

1.一种过量表达苹果酸酶基因的同源重组高山被孢霉菌株，其特征在于，该菌株是用含苹果酸酶基因的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。
2.根据权利要求1所述的一种过量表达苹果酸酶基因的同源重组高山被孢霉菌株，其特征在于，该菌株是用包含质粒pBIG2-ura5s-malE1或质粒pBIG2-ura5s-malE2的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的。
3.根据权利要求1或2所述的一种过量表达苹果酸酶基因的同源重组高山被孢霉菌株，其特征在于，该菌株是用重组质粒pBIG2-ura5s-malE1或pBIG2-ura5s-malE2转化根癌土壤杆菌后，进一步用经转化的含质粒pBIG2-ura5s-malE1或pBIG2-ura5s-malE2的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株构建而成的，其中的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是ura5基因中的213bp-230bp之间共18bp的序列缺失的Mortierella alpina ATCC32222菌株。
4.一种构建权利要求1或2所述的同源重组高山被孢霉菌株的方法，其具体步骤如下：
a)提取Mortierella alpina ATCC32222菌株的RNA，通过反转录获取cDNA,利用PCR扩增分别获取ura5基因、内含子DNA片段IT、苹果酸酶1基因malE1和苹果酸酶2基因malE2；
b)分别构建重组质粒pBIG2-ura5s-malE1和pBIG2-ura5s-malE2；
c)分别用构建获得的重组质粒pBIG2-ura5s-malE1或pBIG2-ura5s-malE2转化根癌土壤杆菌；
d)分别用经过转化的含质粒pBIG2-ura5s-malE1或pBIG2-ura5s-malE2的根癌土壤杆菌转化高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株；
e)筛选鉴定转化菌株，获得过量表达苹果酸酶1或2基因的同源重组高山被孢霉菌株。
5.一种根据权利要求4所述的构建同源重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于步骤c）中所使用的根癌土壤杆菌为：Agrobacterium tumefaciensC58C1。
6.一种根据权利要求5所述的构建同源重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于步骤d）中所使用的高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株是ura5基因中的213bp-230bp之间共18bp的序列缺失的Mortierella alpina ATCC32222菌株。
7.一种根据权利要求6所述的构建同源重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于构建pBIG2-ura5s-malE1时，先利用ura5基因构建转化质粒pBIG2-ura5s，再利用转化质粒pBIG2-ura5s和苹果酸酶1基因malE1进一步构建重组质粒pBIG2-ura5s-malE1；构建pBIG2-ura5s-malE2时，先利用转化质粒pBIG2-ura5s和IT基因片段构建转化质粒高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-ITs，再利用转化质粒pBIG2-ura5s-ITs和苹果酸酶2基因malE2进一步构建重组质粒pBIG2-ura5s-malE2。
8.一种根据权利要求6所述的构建同源重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于构建pBIG2-ura5s-malE1时步骤b）包括如下步骤：用PCR的方法从pD4质粒上获得HPH表达单元，将HPH表达单元用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，插入到EcoRI和XbaI酶切过的pET28a（+）的多克隆位点（MCS）中，得到质粒pET28a-HPHs；利用限制性内切酶BspHI和BamHI酶切ura5基因，将酶切过的ura5基因插入到NcoI和BamHI酶切过的质粒pET28a-HPHs中，以替换hpt基因，构建质粒pET28a-ura5s；用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切质粒pET28a-ura5s得到ura5s表达单元；将ura5s表达单元替换质粒pBIG2RHPH2中的HPH表达单元，构建转化质粒pBIG2-ura5s；用限制性内切酶BspHI和BamHI，NcoI和BamHI分别对malE1基因片段和质粒pET28a-HPHs进行酶切，并通过连接反应将malE1基因片段插入质粒pET28a-HPHs的NcoI和BamHI位点之间得到质粒pET28a-malE1；用限制性内切酶SpeI和XbaI双酶切质粒pET28a-malE1，得到malE1表达单元；将malE1表达单元插入到XbaI酶切过的质粒pBIG2-ura5s中，得到质粒pBIG2-ura5s-malE1；构建pBIG2-ura5s-malE2时步骤b）包括如下步骤：用PCR方法从高山被孢霉基因组中获得非编码的内含子DNA片段IT，用限制性内切酶NcoI和BamHI分别对IT基因片段和质粒pET28a-HPHs进行酶切，并通过连接反应将IT片段取代质粒pET28a-HPHs的hpt基因，得到质粒pET28a-Its，用限制性内切酶SpeI和XbaI双酶切质粒pET28a-ITs得到ITs表达单元，将ITs表达单元插入到XbaI酶切过的质粒pBIG2-ura5s中，高山被孢霉基因操作通用载体pBIG2-ura5s-Its，分别用KpnI和XmaI双酶切malE2基因和pBIG2-ura5s-ITs，用连接酶进行连接，得到malE2表达质粒pBIG2-ura5s-malE2。
9.一种根据权利要求5所述的构建同源重组高山被孢霉菌株的方法，其特征在于步骤a）扩增ura5基因IT，以及苹果酸酶1基因malE1和苹果酸酶2基因malE2的引物序列如下：
URA5F：ACATCATGACCATCAAGGAATACCAGCGCG
URA5R：TCGGGATCCCTAAACACCGTACTTCTCC
malE1F：CATGCGTCATGACTGTCAGCGAAAACACC
malE1R：TACGCGGATCCTTAGAGGTGAGGGGCAAAGG
malE2F：ATCGGGGTACCATGTTGAGGAATCCTGCTCTCA
malE2R：TAATTCCCCCGGGTCAGGGGTGCGATTCCAG
ITF：
GCATGCCATGGAGAAGCTTGGTACCGCTAGCTCCCAAGCGAATTTGTCATCTCG
ITR：
CGCGGATCCGAGCTCCCCGGGGGACTCGAGAGCATACGGAAGTCCATCAGTTACG。
10.权利要求1或2所述的菌株用于生产制备脂肪酸的用途。
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