CN102286385B - 一种球孢白僵菌的分阶段固体培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种球孢白僵菌的分阶段固体培养方法，其特征在于：将球孢白僵菌固体培养分为两个阶段，菌丝生长阶段和产孢阶段；在菌丝生长阶段采用密闭式发酵，液体菌种接种固体培养料于密闭容器中进行培养；产孢阶段将长满菌丝的固体培养料扣出，采用开放式发酵。本发明的白僵菌固体培养方法，工艺简单，不需要复杂设备，发酵周期由同类技术的10-14d缩短到6-7d，极大地提高了生产效率，同时对环境湿度要求不高，显著减少了杂菌污染概率，生产成本低廉，易控制，成功率高，产品质量稳定。可应用于实验室生产及作为众多中小白僵菌生产厂家技术升级的优选方案。具有显著的社会和经济效益。

Description

一种球孢白僵菌的分阶段固体培养方法

技术领域

本发明涉及一种真菌的固体培养方法，特别是涉及一种球孢白僵菌Beauveria bassiana（以下简称白僵菌）的固体培养方法，属生物发酵方法领域。

背景技术

白僵菌是一类对农林害虫寄主范围广且致病性强的昆虫病原真菌，在害虫生物防治的研究与应用中占有举足轻重的地位。由于白僵菌具有对环境和脊椎动物无害，易培养、杀虫谱广、致病力强等特点，是目前应用最为广泛的真菌杀虫剂，在多种农林害虫的生物防治中都取得了明显成效。

       目前国内外白僵菌生产主要采用液—固双相发酵工艺，即首先经过液体发酵得到白僵菌芽生孢子或菌丝体，再将其接种于固体料上继续培养，以获得分生孢子。固态发酵阶段目前在我国大多数生产厂家采用浅盘、纱窗等开放式生产模式，生产过程存在着对温、湿度要求高，发酵周期长，且容易感染杂菌，产品质量不稳定等不足，这些问题阻碍了白僵菌杀虫剂的生产应用及防治效果。

发明内容

为了解决目前白僵菌固态发酵阶段存在的问题，本发明提供了一种工艺简单，成本低，发酵周期短的白僵菌分阶段固体培养方法。

本发明的技术方案如下：

将球孢白僵菌固体培养分为两个阶段，菌丝生长阶段和产孢阶段；在菌丝生长阶段采用密闭式发酵，液体菌种接种固体培养料于密闭容器中进行培养；产孢阶段将长满菌丝的固体培养料扣出，采用开放式发酵。

所述的密闭容器为可重复使用的PP材质带盖盒子，培养前进行表面消毒。

所述菌丝生长阶段的培养周期为2-3d，培养温度设定为23±2℃。

所述产孢阶段的培养周期为3-4d，培养温度设定为26±2℃。

所述固体培养料的配方：以重量百分比为单位，甘蔗渣或谷壳8-12%，麦麸38-42%，余量为水。

在产孢阶段将固体培养料扣出后同时分割固体培养料，可增加通气量，促进白僵菌更快产孢。

本发明将白僵菌固体培养分为两个阶段，菌丝生长阶段和产孢阶段。即：在菌丝生长阶段（固体培养前期）使用密闭容器进行培养，这可有效保证在菌丝生长阶段所需求的高湿度，使菌丝迅速长满整个培养料，同时极大减少了培养过程中的污染几率；产孢阶段（固体培养后期）采用开放式发酵，可明显改善培养料的通气性能，促进分生孢子的产生。本发明发酵工艺简单，生产成本低，不需要复杂设备，发酵周期短，产品质量稳定，适合白僵菌实验室生产及中试生产，亦可作为众多中小白僵菌生产企业生产工艺改进的优选方案。本发明同时提供一种白僵菌固体培养料配方，该配方以麦麸和甘蔗渣（或谷壳）作为主要载体，原料价廉、易得，大大降低了生产成本。

本发明的积极有益效果：

本发明用于培养白僵菌的固体培养料配方简单，原料主要为农副产品，廉价易得，成本低，制作简单。不仅是农业废弃物得以有效利用，且固体培养料的间隙度、疏松度合适，培养过程中无需额外通气。

本发明的分阶段固体培养白僵菌的方法，是针对白僵菌生长的特点而设计，在菌丝生长阶段，需要较高湿度，使用密闭的培养容器，可保证培养料和培养环境的湿度始终较高，从而满足菌丝生长需要，这样克服了开放式培养中湿度无法控制的缺点。同时，因白僵菌生产中，杂菌污染多出现在早期菌丝生长的阶段，密闭式培养，可大大降低污染的概率，且即使出现污染的情况，亦不会扩散蔓延。白僵菌产孢阶段，对环境湿度要求没有菌丝生长阶段高，甚至过高的湿度，会使得孢子二次萌发，从而影响产孢的进程。故产孢阶段，采用开放式培养；且因培养料已经布满白僵菌菌丝，不会出现杂菌污染情况。所以，整个固体培养过程无需调控环境湿度。

本发明的白僵菌固体培养方法，工艺简单，不需要复杂设备，发酵周期由同类技术的10-14d缩短到6-7d，极大地提高了生产效率，同时对环境湿度要求不高，显著减少了杂菌污染概率，生产成本低廉，易控制，成功率高，产品质量稳定。可应用于实验室生产及作为众多中小白僵菌生产厂家技术升级的优选方案。具有显著的社会和经济效益。

具体实施方式

本发明的一种白僵菌分阶段固体培养方法：

1 液体菌种的培养，包括如下步骤：

1.1 菌种：白僵菌菌种，一般以斜面低温保存。

1.2 斜面菌种：预先将白僵菌菌种用试管斜面在25±1℃条件下传代培养、活化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为微生物培养中所通用的SDAY培养基。

1.3 液体培养基：为通用的SDY培养基，每个500ml三角瓶中装入200ml培养基，121℃下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。

1.4 接种：于无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培养基中。

1.5 摇床培养：25±1℃恒温振荡培养箱中振荡培养60-72h，待长成白色粘稠菌丝体后即可接入固体培养料，进行白僵菌固体培养。

2 固体培养，包括如下步骤：

2.1 固体培养料配方及制备：

白僵菌固体培养料配方：以重量份为单位，配方中含麦麸38-42%，甘蔗渣8-12%，余量为水。或，麦麸38-42%，谷壳11-14%，余量为水。

制备方法：将麦麸和甘蔗渣（或谷壳）分别称量，然后加入水后，搅拌均匀，装入塑料袋中，放入高压灭菌锅中，121℃下蒸汽高温灭菌50min，冷却后备用。

2.2 接种：在预先进行了空间灭菌的密闭房间内进行，按10-20%的接种量，将液体菌种倒入固体培养料中，搅拌均匀，装入已经过表面消毒的密闭培养容器中（料厚度3-4cm），盖上盖子，随即转入培养室培养。

2.3 菌丝生长阶段：将上述装有接种后固体培养料的密闭培养容器放入23±2℃的培养室中，培养2-3d，待固体培养料长满白色菌丝即可。该培养阶段由于使用容器密闭培养，培养料自身湿度不会散失，所以对室内湿度无特殊的要求。

2.4 产孢阶段：去掉密闭培养容器的盖子，将其反扣于培养室内铺有报纸或尼龙网的培养架上，轻拍使长满白色菌丝的固体培养料落下，铺在培养架上，并用刀片或薄塑料片将成块的固体培养料轻轻分割为边长5~7cm的小方块，然后保持培养室内温度在26±2℃，继续培养3-4天，待固体料内外长满白色（或偏乳黄色）孢子后，将固体培养物置于阴凉通风处自然晾干即成粗粉剂（或在30~35℃烘干箱中烘36h，含水率≤10%）。

步骤1.2中所述SDAY培养基是指萨氏培养基，具体配方为：含4%葡萄糖、1%蛋白胨、1% 酵母粉及2%琼脂。步骤1.3中所述SDY培养基为SDAY培养基配方中去掉琼脂，其它物质比例不变。

步骤2.1中所述的塑料袋为PP材质聚丙烯袋，该袋特点是可耐130℃以上的高温，适用于高压灭菌。

步骤2.2中所述接种量是指液体菌种体积与固体培养料重量的比（ml∶g）。

步骤2.2中所述的密闭培养容器为可以重复使用的PP材质带盖盒子，规格为26cm×17cm×9cm（长×宽×高），亦可根据情况对容器大小进行定制。培养前进行表面消毒。装入固体培养料后，需将盖子盖好，可保证固体培养料的水分不会散失，故此过程中对环境湿度无要求。培养温度设定为23±2℃，不宜过高或过低。若过高，培养料发酵过程中亦会产生热量，从而产生“烧料”现象；若温度过低，则菌丝生长缓慢。

步骤2.4中所述刀片或薄塑料片使用前需进行表面消毒。所述将成块的固体培养料分割，可改善固体培养料的通气状况，促进白僵菌产孢，从而提高产孢量。

以下为本发明的几个具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例一：

1 液体菌种的培养，包括如下步骤：

1.1 菌种：球孢白僵菌BbCeFZ01菌株（福建林业科技，2006，33(2)：129-131.），福建省林业科学研究院森林保护研究所保存，为公知菌株。

1.2 斜面菌种：预先将白僵菌菌种用试管斜面培养基在25℃条件下传代培养、活化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为SDAY培养基。

1.3 液体培养基：配制SDY培养基2L，用500ml三角瓶中装入，每个装200ml培养基，121℃下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。

1.4 接种：于无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培养基中。

1.5 摇床培养：25±1℃恒温振荡培养箱中振荡培养72h，待长成白色粘稠菌丝体后即可接入固体培养料，进行白僵菌固体培养。

2 固体培养，包括如下步骤：

2.1 固体培养料配方及制备：

白僵菌固体培养料配方：麦麸8kg，甘蔗渣2kg，水10L。

制备方法：将麦麸和甘蔗渣分别称量，加入水后搅拌均匀，装入塑料袋中，放入高压灭菌锅中，121℃下蒸汽高温灭菌50min，冷却后备用。

2.2 接种：在预先进行空间灭菌的密闭房间内进行，按10%的接种量，将液体菌种倒入固体培养料中，搅拌均匀，装入预先进行过表面消毒的PP塑料盒中（培养料厚度3-4cm），盖上盖子，随即转入培养室培养。

2.3 菌丝生长阶段：将上述装有接种后固体培养料的PP塑料盒放入23±2℃的培养室中培养，2天后待固体培养料长满白色菌丝即可。培养阶段由于培养容器密闭，培养料自身湿度不会散失，所以室内无湿度要求。

2.4  产孢阶段：去掉培养容器的盖子，将其反扣于铺有报纸或尼龙网的培养架上，轻拍使长满白色菌丝的固体培养料落下，铺在培养架上，并用刀片将成块的固体培养料轻轻分割为5~7cm左右的小方块，然后保持培养室内温度在26±3℃，继续培养，4d后，待固体料内外长满白色（或偏乳黄色）孢子即可，将固体培养物置于阴凉通风处晾干即成粗粉剂（或在30~35℃烘干箱中烘36h，含水率≤10%）。

3 培养结果：发酵周期为6d，晾干后随机称取粗粉剂5g，用0.3‰吐温-80溶液进行稀释，血球计数板计数，结果培养物含孢量为2.3×10¹⁰孢子/克粗粉剂。粗粉剂制作成粉炮用于林业害虫防治。

实施例二：

1 液体菌种的培养，包括如下步骤：

1.1 菌种：球孢白僵菌BbSMYXTR03菌株（福建林业科技，2011,38（2）：10-13），福建省林业科学研究院森林保护研究所保存，为公知菌株。

1.2 斜面菌种：同实施例一。

1.3 液体培养基：同实施例一，共配制4L。

1.4 接种：于同实施例一。

1.5 摇床培养：同实施例一，不同的是摇床培养时间为60h。

2 固体培养，包括如下步骤：

2.1 固体培养料配方及制备：

白僵菌固体培养料配方：麦麸10.7kg份，谷壳3.5kg，水12.4L。

制备方法：同实施例一。

2.2 接种：同实施例一，不同的是接种量为15%，。

2.3菌丝生长阶段：同实施例一，不同的是培养时间为3天。

2.4 产孢阶段：同实施例一。

3 培养结果：发酵周期为7天，晾干后随机称取粗粉剂5g，用0.3‰吐温-80溶液进行稀释，然后用血球计数板计数，结果培养物含孢量为2.1×10¹⁰孢子/克粗粉剂。粗粉剂直接用于防治林业害虫。

实施例三：

1 液体菌种的培养，包括如下步骤：

1.1 菌种：球孢白僵菌B08（中国森林病虫，2008，27(2)：1-3,18.）菌株，福建省林业科学研究院森林保护研究所保存，为公知菌株。

1.2 斜面菌种：同实施例一。

1.3 液体培养基：同实施例一，共配制8L。

1.4 接种：于同实施例一。

1.5 摇床培养：同实施例一，不同的是摇床培养时间为60h。

2 固体培养，包括如下步骤：

2.1 固体培养料配方及制备：

白僵菌固体培养料配方：麦麸20kg份，甘蔗渣5kg，水25L。

制备方法：同实施例一。

2.2 接种：同实施例一。

2.3 菌丝生长阶段：同实施例一。

2.4 产孢阶段：同实施例一。

3 培养结果：发酵周期为6天，晾干后随机称取粗粉剂5g，用0.3‰吐温-80溶液进行稀释，血球计数板计数，结果培养物含孢量为2.8×10¹⁰孢子/克粗粉剂。粗粉剂经过提纯制成高孢粉。

实施例四：

1 液体菌种的培养，包括如下步骤：

1.1 菌种：球孢白僵菌Bso6菌株（福建林业科技，2006，33(2)：129-131.），福建省林业科学研究院森林保护研究所保存，为公知菌株。

1.2 斜面菌种：同实施例一。

1.3 液体培养基：同实施例一，共配制4L。

1.4 接种：于同实施例一。

1.5 摇床培养：同实施例一

2 固体培养，包括如下步骤：

2.1 固体培养料配方及制备：

白僵菌固体培养料配方：麦麸16kg份，甘蔗渣4kg，水20L。

制备方法：同实施例一。

2.2 接种：同实施例一。

2.3 菌丝生长阶段：同实施例一，不同的是培养周期为3d。

2.4 产孢阶段：同实施例一。

3 培养结果：发酵周期为7d，晾干后随机称取粗粉剂5g，用0.3‰吐温-80溶液进行稀释，用血球计数板计数，结果培养物含孢量为2.6×10¹⁰孢子/ g粗粉剂。粗粉剂制作成粉炮用于林业害虫防治。

Claims (5)

1.一种球孢白僵菌的分阶段固体培养方法，其特征在于：将球孢白僵菌固体培养分为两个阶段，菌丝生长阶段和产孢阶段；在菌丝生长阶段采用密闭式发酵，液体菌种接种固体培养料于密闭容器中进行培养；产孢阶段将长满菌丝的固体培养料扣出，采用开放式发酵；所述固体培养料的配方：以重量百分比为单位，甘蔗渣或谷壳8-12%，麦麸38-42%，余量为水。

2.根据权利要求1所述的球孢白僵菌的分阶段固体培养方法，其特征在于：所述的密闭容器为可重复使用的PP材质带盖盒子，培养前进行表面消毒。

3.根据权利要求1所述的球孢白僵菌的分阶段固体培养方法，其特征在于：所述菌丝生长阶段的培养周期为2-3d，培养温度设定为23±2℃。

4.根据权利要求1所述的球孢白僵菌的分阶段固体培养方法，其特征在于：所述产孢阶段的培养周期为3-4d，培养温度设定为26±2℃。

5.根据权利要求1所述的球孢白僵菌的分阶段固体培养方法，其特征在于：在产孢阶段将固体培养料扣出后同时分割固体培养料，增加通气量。