CN1821383A - 木霉菌液体深层发酵生产厚垣孢子的方法 - Google Patents

木霉菌液体深层发酵生产厚垣孢子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种木霉菌属真菌通过液体深层通气发酵生产厚垣孢子的发酵培养基配方及发酵工艺。该发明显著地缩短了木霉菌液体深层发酵产厚垣孢子的发酵周期，大幅度地增加了产厚垣孢子发酵产率，大幅度地降低了木霉菌的发酵生产成本。同时，通过该发明生产出的厚垣孢子比用传统方法生产的分生孢子具有更强的生活力和抗逆能力，更适合于生产应用。

Description

木霉菌液体深层发酵生产厚垣孢子的方法
技术领域
本发明涉及一种木霉菌液体深层发酵生产厚垣孢子的方法。
技术背景
木霉菌(Trichoderma spp.)属半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，粘孢菌类，是一类普遍存在的腐生真菌，是真菌类中最有潜力的植物病害生物防治菌株，可用来防治多种植物真菌性病害。常见的木霉属种类有哈茨木霉(T.harzianum)、哈氏木霉(T.hamatum)、多孢木霉(T.polysorum)、康氏木霉(T.koningii)、拟康氏木霉(T.pseudokoningii)、绿色木霉(T.viride)和长枝木霉(T.longibrachiatum)等。在众多种类中，绿色木霉(T.viride)和哈茨木霉(T.harzianum)在植病防治防治效果方面表现尤为突出，是目前生产上主要应用的菌株。
木霉菌在其生长周期内可以产生三种繁殖体，包括菌丝体、厚垣孢子和分生孢子。目前生产上常用的木霉菌剂多为它的活分生孢子制剂，已有许多商品化的木霉菌分生孢子制剂问世，如以色列开发的哈茨木霉T39可湿性粉剂Trichodex，美国的Topshield(哈茨木霉T22)等。
木霉菌的分生孢子形成于瓶形小梗上，分生孢子近球形，椭圆形，或短倒卵形，壁光滑或细胞壁上明显而微小粗糙突起，浅色或无色，大小2～5×2.4～4μm。
木霉菌常常形成厚垣孢子，在基内菌丝上间生，或者在营养菌丝侧枝的尖端端生，圆形或椭圆形，无色至浅黄色或绿色，大小7～12×10～13μm，表面光滑，细胞壁有加厚现象，无性生殖产生，通常有耐不良环境条件的能力。厚垣孢子是木霉菌重要的繁殖体形式。木霉属厚垣孢子在土壤中存活能力要优于分生孢子，至少能存活20月。
自从木霉的生防效果得到广泛认同以来，许多研究者就对木霉的产孢条件进行了大量的摸索。木霉菌分生孢子的产生条件相对要求较低，在多种固体或液体培养基中都能够产生分生孢子。城市垃圾、腐败的咖啡果皮、禽类的粪便以及混以牛粪的咖啡果皮、香蕉叶、甘蔗渣和麦麸等廉价物质都可作为木霉菌的固体培养基来生产分生孢子，且孢子产量都可达109CFU/克左右。
国内外研究发现T.harzianum，T.viride和Gvirens等木霉菌株在糖蜜-玉米浆等液体培养基中进行深层发酵15天左右可产生107数量级的厚垣孢子；在麦麸等、灭菌土壤、土壤浸出液及植物碎片等固体培养基中培养20天左右也可产生厚垣孢子达106数量级。由于发酵周期太长，发酵产率低，发酵成本高，目前国内外未见厚垣孢子制剂报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种木霉菌在液体中发酵快速大量生产厚垣孢子的方法。该方法生产的木霉菌厚垣孢子能够用于农作物真菌性病害的防治，也可作为微生物肥料，具有改善植物生长状况的作用。
本发明所述的方法包括以下步骤：木霉菌在PDA斜面上培养成斜面菌种，斜面菌种接种于摇瓶培养成摇瓶种子，摇瓶种子接种于发酵种子罐培养形成发酵种子，发酵种子按5-10％(V/V)接种于发酵罐，进行控制发酵，形成厚垣孢子，用于微生物农药或微生物肥料的制剂，其工艺流程图见附图1。
本发明中的木霉菌斜面菌种、摇瓶种子及发酵种子培养所用的培养基、培养方法采用木霉菌液体种子培养通用方法。本发明的特点在于木霉菌厚垣孢子形成发酵培养基和发酵控制工艺。
木霉菌液体发酵产厚垣孢子的发酵培养基含有以下重量百分比的物质：2.0～3.5％淀粉，1.0～2.0％酵母粉，4.0～8.0％玉米浆，0.1～0.5％的CaCO3，0.01～0.02％的Zn2+、0.01～0.03％的Mg2+，余量为水。
所述的发酵培养基在木霉菌发酵生产厚垣孢子中的应用，效果优异。
在发酵罐进行控制发酵，按10％(v/v)的接种量接入发酵种子进行控制发酵。发酵控制参数为：温度控制，发酵第0-40小时，28℃，发酵40小时以后，26℃；通气量(v/v)：0～10小时：1∶0.6，10～40小时：1∶1，40小时以后：1∶0.6；搅拌速度，180rpm。
在发酵过程中进行补料。即于发酵前期(24～26小时)时补加2％(w/v)淀粉(发酵罐中所装培养基体积)，并且发酵中后期(60～63小时)补淀粉0.5％(w/v)。
以下是对技术方案和技术效果的说明：
1、本发明与国内外文献报道木霉菌液体发酵产厚垣孢子的比较
目前国内外能够查询到的有关木霉菌液体发酵产厚垣孢子的文献仅几篇，而且都很难控制发酵仅产厚垣孢子，现将本发明效果与国内外文献报道效果进行比较如下表1。
          表1 本发明与国内外报道木霉菌液体发酵产厚垣孢子情况比较
 报道人   报道期刊   报道时间   发酵周期(天)   产孢量(个/ml)   备注
 庄敬华等   中国生物防治   2005   10   1.99×108   厚垣孢子和分生孢子混合产生
 秦芸等   云南农业大学学报   2002   15   ＜107   厚垣孢子
 Papavizas等   Phytopathology   1984   15   ＜108   厚垣孢子和分生孢子混合产生，其中75％为厚垣孢子
 本发明   5   ＞108   全部为厚垣孢子
2.木霉菌厚垣孢子与分生孢子在不同储存期内存活率比较
木霉菌(如绿色木霉)厚垣孢子大小为8.4～9.4um，分生孢子大小为3.0～3.4um。厚垣孢子的体积约为分生孢子体积的27倍，其内含物量明显多于分生孢子，因此，产品在储存过程中能够较长时间保持生活力，表2是绿色木霉厚垣孢子与分生孢子在不同储存期内的存活率。
      表2  绿色木霉厚垣孢子与分生孢子在不同储存期内的存活率
                              存活率(％)
  6个月   12个月   18个月   24个月
  厚垣孢子   85.6±12.3   78±13.5   73±13.8   65±15.6
  分生孢子   50±18.5   30±12.4   1±0.5   0
3.木霉菌厚垣孢子与分生孢子不同温度条件下的萌发情况比较
不同温度下绿色木霉厚垣孢子与分生孢子萌发情况如图2和图3所示，厚垣孢子萌发的温度范围为15～40℃；分生孢子为15～35℃，两者的最适温度都为35℃。在相同温度条件下，厚垣孢子起始萌发所需时间较分生孢子短；在最适温度条件下，5h时厚垣孢子萌发率已达75％，此时分生孢子仅有个别萌发。4℃下两种孢子都不萌发；分生孢子在40℃不萌发，厚垣孢子却萌发得很好。比较两种孢子在不同的温度下萌发情况可知，厚垣孢子较分生孢子能在更为宽广的温度范围内萌发。
4.不同pH值对木霉厚垣孢子与分生孢子萌发的影响
绿色木霉对pH适应范围较广，pH3～10孢子均能萌发；厚垣孢子萌发的最佳pH为5～6，而分生孢子的为4～5。但孢子类型不同对酸碱的适应度不同，厚垣孢子能在pH3～10范围内快速萌发，没有较大的差异；分生孢子萌发却表现明显的酸性优势现象，在酸性条件下萌发大大好于中性或碱性条件。见表3。
                     表3  厚垣孢子与分生孢子在不同pH下萌发比较
  pH                                                 孢子萌发率(％)
                       厚垣孢子                     分生孢子
  6h   8H   10h   12h   6h   8h   10h   12h
  345678910   68.4865.6567.2673.5662.0563.7370.2868.91   84.1989.0987.8089.1686.3089.5984.7482.62   91.8690.1089.2293.3188.3489.8186.3682.97   95.6793.7595.6196.4296.8995.7595.3796.42   00000000   18.9825.1223.4513.9010.515.652.110   60.5367.2379.5546.3938.5113.789.971.85   93.6491.8689.4185.6774.1445.9638.3230.93
5.木霉菌厚垣孢子与分生孢子对紫外线的耐受性比较
将木霉菌厚垣孢子和分生孢子采用紫外线照射不同时间，然后培养10h时，观察孢子的萌发情况，见图4。厚垣孢子对紫外线的照射具有较强的耐受性，照射时间为180s时，孢子的萌发率仍能达到70％左右，与未照射相比仅有小幅度的下降。相对于厚垣孢子，分生孢子对紫外光耐受性则较弱，照射60s时萌发率仅为11.51％。
本发明具有如下的优点：
A.大幅度地缩短了木霉菌大量产厚垣孢子的时间。
目前所能查询到的文献报道，木霉菌液体深层发酵大量产厚垣孢子的时间都在15-20天，本发明大量产厚垣孢子时间为100～110小时。
B.产孢量大幅度提高。
目前所能查询到的文献报道，每克木霉菌菌丝产孢108-9个数量级厚垣孢子，本发明每毫升发酵液产厚垣孢子108个数量级，产孢量增加了3～4倍。
C.显著地降低了发酵成本。
由于发酵周期缩短至其它工艺的1/3～1/4倍，产孢量增加了3～4倍，发酵成本降低了9～16倍。
D.发酵生产的木霉菌厚垣孢子比分生孢子具有更强的生活力。
附图说明
图1为木霉菌液体发酵产厚垣孢子工艺流程图。
图2为厚垣孢子在不同温度下萌发情况图。
图3为分生孢子在不同温度下萌发情况图。
图4为绿色木霉的厚垣孢子与分生孢子对紫外线的耐受性图。
具体实施方式
实施例1
斜面菌种培养基的制备：取削皮后的马铃薯20g煮沸20分钟取汁，将汁与2g葡萄糖、1.5g琼脂和水配成100ml，pH6.8-7.0，装入2个茄子瓶，每个50ml，灭菌后制斜面。
药瓶培养基的制备：配制摇瓶培养基12瓶，摇瓶为500ml三角瓶，装量为100ml/瓶，每瓶培养基成分为2g淀粉、1g葡萄糖、1g酵母粉、0.3g CaCO3，加水至100ml，自然pH值，湿热灭菌。
种子罐培养基的制备：种子罐大小为1m3，培养基装量为500L。培养基各成分含量为：淀粉5kg、葡萄糖5kg、酵母粉2.5kg、CaCO31.5kg，加水至500ml，pH6.5-6.8，蒸汽灭菌。
发酵罐培养基的制备：发酵罐大小为10m3，培养基装量为6.5m3。培养基各成分含量为：淀粉195kg、酵母粉130kg、玉米浆325kg、CaCO3 19.5kg、ZnSO4 1.3kg、MgSO4 1.6kg，加水至6.5m3，pH6.5-6.8，蒸汽灭菌。
生产过程：将木霉菌接种于斜面培养基，28℃培养6天，产生大量分生孢子，作为摇瓶种子接种体；将斜面种子挖块接种于灭菌后的摇瓶培养基，28℃，摇床转速200rpm，培养24小时，作为发酵种子接种体；将培养好的摇瓶种子，接入灭菌后的种子罐培养基中，28℃，180rmp培养24-30小时，成为发酵种子；将发酵种子接入发酵罐进行控制发酵。发酵罐发酵控制参数为：温度控制，发酵第0-40小时，28℃，发酵40小时以后，26℃；通气量(v/v)：0～10小时：1∶0.6，10～40小时：1∶1，40小时以后：1∶0.6；搅拌速度，180rpm。
在发酵过程中进行补料。即于发酵前期25小时时，补加2％(w/v)淀粉(发酵罐中所装培养基体积)，发酵中后期(62小时)补淀粉0.5％(w/v)。
发酵进行至110小时左右，90％以上菌丝都形成厚垣孢子，发酵液变稀，可以放罐进行后处理和制剂。
将所得的木霉菌厚垣孢子制成生防制剂或微生物肥料，用于多种常见的真菌类病害防治或土壤改良剂，相对防治效果达75％以上。
以上对本发明所提供的木霉菌液体深层发酵生产厚垣孢子的方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (6)

1.一种发酵培养基，其特征在于，该培养基含有以下重量百分比的物质：2.0～3.5％淀粉，1.0～2.0％酵母粉，4.0～8.0％玉米浆，0.1～0.5％的CaCO3，0.01～0.02％的Zn2+、0.01～0.03％的Mg2+，余量为水。
2.权利要求1所述的发酵培养基在木霉菌发酵生产厚垣孢子中的用途。
3.一种木霉菌液体深层发酵生产厚垣孢子的方法，包括斜面菌种的制备，发酵种子的制备和产厚垣孢子发酵培养基配制及发酵控制工艺等步骤，其特征在于：在发酵罐进行控制发酵时，以权利要求1所述的发酵培养基为培养基，其发酵控制参数为：温度控制，发酵第0-40小时，28℃；发酵40小时以后，26℃；通气量(v/v)：0～10小时：1∶0.6，10～40小时：1∶1，40小时以后：1∶0.6；搅拌速度，180rpm。
4.一种权利要求3所述的发酵控制工艺，其特征在于：在发酵罐进行控制发酵时进行补料，在发酵第24～26小时，补加2％(w/v)淀粉，并且在发酵第60～63小时，补淀粉0.5％(w/v)；所述的体积v为发酵罐中所装培养基体积。
5.一种微生物农药，其特征在于：以木霉菌类厚垣孢子为有效成分。
6.一种微生物肥料，其特征在于：以木霉菌类厚垣孢子为有效成分。
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