CN102533585A

CN102533585A - 一种小麦全蚀病生防链霉菌及其发酵工艺

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Publication number: CN102533585A
Application number: CN2011103527817A
Authority: CN
Inventors: 文才艺; 王志国; 赵玉华
Original assignee: Individual
Current assignee: Anyang Quan Feng Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2011-11-10
Filing date: 2011-11-10
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2031-11-10
Also published as: CN102533585B

Abstract

本发明公布了一种小麦全蚀病生防链霉菌SCY114，该菌于2011年09月05日，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCC No.5213。本发明还公布了该微生物发酵的工艺，该微生物能产生一种广谱抗菌的代谢产物，对多种植物病原真菌具有抑制活性，可有效防治植物土传真菌病害，为符合环保的生防制剂。

Description

一种小麦全蚀病生防链霉菌及其发酵工艺

技术领域

本发明涉及一种小麦全蚀病生防链霉菌及其发酵工艺，属于农作物防病控病领域。

背景技术

抗生素是由微生物、植物、动物在其生命活动过程中产生的一类天然有机化合物，具有能在极小浓度下有选择地抑制、促进或杀灭其他微生物和生物细胞的作用。

农用抗生素和化学合成农药一样是具有特定化学结构的化合物，因此本质上也是化学农药，具有一般化学农药的通性和优缺点。除此之外，农用抗生素还具有以下特点：(1)比一般化学农药的有效成分更为繁杂的化学结构。(2)选择性。(3)与环境兼容性好。它不易污染环境，对非靶标生物影响较小，不易破坏生态平衡。(4)毒性差别很大。很多农用抗生素对高等动物和非靶标生物的毒性很低，例如，井冈霉素和春雷霉素均属于低毒级。(5)生产原料多为可再生性资源。农用抗生素发酵所用原料多为农副产品如淀粉、黄豆饼粉等由植物利用太阳能光合作用产生的再生性资源。(6)生产设备通用性强。与化学农药不同，农用抗生素所用的发酵设备具有通用性，只需变换菌种，就可以改变生产品种，一套设备在不同时期可生产多个品种，对于投资和适应市场来说非常有利。因此，农用抗生素的研究与开发将是微生物农药领域的重要方向之一。

小麦全蚀病(Take-all)是由禾顶囊壳小麦变种(Gaeumannomycesgraminis var.tritici，Ggt)侵染小麦根部引起的一种世界性病害。该病是一种典型的土传病害，病菌从小麦苗期至成株期均可危害，而且该病一旦发生，蔓延速度很快，危害严重。发病轻者可造成小麦减产10％-20％，严重时可达50％以上，甚至绝收。对于该病的防治，目前仍然以化学防治为主，缺乏有效的抗病品种和高效的生防制剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效控制小麦全蚀病害的生防链霉菌及其发酵工艺，满足无公害农产品的需求。

实现本发明目的的具体方案如下：

一种小麦全蚀病生防链霉菌SCY114，于2011年9月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，馆藏号为_ CGMCC No.5213。保藏单位的地址为“北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所”，保藏地址的邮政编码为“100101”。

本发明还提供了该小麦全蚀病生防链霉菌SCY114发酵工艺，具体包括以下步骤：

1)分离出链霉菌SCY114菌株并将其植入种子培养基中进行培养；培养时间48小时。

2)取种子培养基中种子培养液以体积比为6％的接种量接种到初始pH值为6-7的发酵培养基中；

3)取所述接种后的发酵培养基装瓶，置于温度为25摄氏度-30摄氏度，200转/分的环境中发酵培养120小时；

分离出链霉菌SCY114菌株并植入种子培养基中进行培养，培养时间为48小时。

所述发酵培养基装瓶时瓶装量为28％。

当发酵液pH为8.1～8.3时，菌体浓度和代谢产物的产量达到最大值。

所述发酵培养基包括可溶性淀粉1％-3％，黄豆饼粉4％-6％，K₂HPO₄0.05％-0.1％，MgSO4 0.025％-0.075％。

本发明的SCY114菌株具有如下特征：

(A)形态及培养特征：菌株SCY114菌落在高氏一号培养基上呈欧灰色，单菌落边缘呈放射丝状，有褐色可溶性色素。气生菌丝发达，不断裂，孢子链螺旋状或直-柔曲状，孢子表面光滑，呈圆柱形。

(B)生理生化特征：菌株SCY114能使明胶液化，淀粉水解弱，能产生H₂S和黑色素，能使牛奶凝固与胨化，硝酸盐不还原，纤维素上生长。利用棉子糖，肌醇，鼠李糖，蔗糖，葡萄糖和木糖；不利用阿拉伯糖，甘露糖和果糖。菌株SCY114耐受NaCl浓度为5％，当培养基中NaCl浓度为1％～2％时产生可溶性色素；当pH＜5或pH＞11时菌株不能生长；菌株的生长温度范围为10℃～45℃，当温度高于40℃时，其产孢受抑制。

(C)遗传性特征：菌株SCY114的16S rRNA序列大小为1523bp，该序列在Genbank数据库中登录号为GU045542。将SCY114的16S rRNA序列与NCBI数据库中相关序列进行Blast比对，选取与其同源性较高的7株模式菌株的16S rDNA序列进行系统发育分析，用MEGA4.0软件中的Neighbor-Joining法构建系统进化树，可以看出，SCY114菌株处于进化树中的独立分支，与模式菌株Streptomyces scabiei ATCC49173(AB026199)同源性达99.8％，与S.scabiei strain PK-41(AY438566)的同源性达99.7％。虽然与S.scabiei的16S rDNA序列的同源性较高，但是三者之间在形态特征和生理生化特征等方面存在着一定的差异。菌株SCY114的ISR序列大小为398bp，该序列在Genbank数据库中登录号为GU358064。将SCY114的ISR序列与NCBI数据库中相关序列进行Blast比对，选取与其同源性较高的9株模式菌株的ISR序列进行系统发育分析，用MEGA4.0软件中的Neighbor-Joining法构建系统进化树(图8)，菌株SCY114与S.scabiei ATCC 49173(AB026199)聚于同一分支，其同源性为87.8％。

菌株SCY114与S.scabiei(ATCC 49173)的培养特征和形态特征近似，孢子颜色都为灰色、光滑且孢子链都为螺旋状，二者的6S rDNA序列同源性达99.8％，应归属于疮痂链霉菌；但菌株SCY114与模式菌株在生理生化方面还有一定的差别，SCY114硝酸盐不还原，不能利用甘露糖和果糖，能利用棉子糖和鼠李糖，能在45℃培养下生长，耐盐度为4％。模式菌株可还原硝酸盐，能利用甘露糖和果糖，能利用棉子糖和鼠李糖，不能在45℃培养下生长，耐盐度为9％。菌株SCY114与模式菌株的G+C mol％存在一定的差异，两者之间的G+C mol％差值大于5，且其ISR序列同源性仅为87.8％。根据菌株SCY114的形态特征、培养特征、生理生化特征、全细胞壁氨基酸和糖类分析及分子鉴定结果，将菌株SCY114鉴定为疮痂链霉菌许昌变种(Streptomyces scabiei var.xuchangensis)。

本发明所述的小麦全蚀病生防链霉菌及其产物获得生防菌剂，相比现有技术具有如下优点：

(1)菌株SCY114是一种对小麦全蚀病菌拮抗效果良好且稳定的链霉菌，抑菌谱广，具有很强的的生防潜力。

(2)菌株SCY114代谢活性产物具有较强的酸碱、热和光的稳定性，具有作为微生物农药开发利用的价值。

(3)链霉菌SCY114可产生抗生素，经鉴定其分子量为466.3Da，分子式为C₂₇H₂₇N₆O₂。活性成分对多种植物病原真菌具有抑制活性，可有效防治植物土传真菌病害。

(4)对寄主植物的诱导抗性：该链霉菌所产生的抗生素可诱导寄主植物体内植物保卫素的积累，从而阻止病原真菌之植物体内的增殖和病害扩展。

被结合在本说明书中并且构成本说明书的一部分的附图示出本发明的几个方面，并且与其描述一起用来解释本发明的原理。

附图说明

图1为发酵培养基的组分对抗生素产量的影响；

图2为发酵时间对抗生素产量的影响；

图3为接种量对发酵液活性的影响；

图4为种龄对发酵产物产量的影响；

图5为转速对发酵产物产量的影响；

图6为瓶装量对抗生素产量的影响；

图7为发酵温度对菌株SCY114发酵效果；

图8为不同初始pH值的培养基对发酵效果的影响；

图9为发酵过程中发酵液的pH和发酵产物总量的关系；

图10为不同温度下抗生素的抗菌能力；

图11为不同pH值下抗生素的抗菌能力；

图12为菌体SCY114产生的抗生素对小麦纹枯病菌的拮抗作用示意图；

图13为菌体SCY114产生的抗生素对玉米穗腐病菌的拮抗作用示意图；

图14为菌体SCY114产生的抗生素对水稻稻曲病菌拮抗作用示意图；

图15为菌体SCY114产生的抗生素对辣椒疫霉病菌拮抗作用示意图；

图16为菌体SCY114产生的抗生素对小麦全蚀病菌拮抗作用示意图；

图17为菌体SCY114产生的抗生素对小麦赤霉病菌拮抗作用示意图；

图18为菌体SCY114产生的抗生素对玉米青枯病菌拮抗作用示意图；

图19为菌体SCY114产生的抗生素对高粱炭疽病菌拮抗作用示意图。

具体实施方式

下面阐述的实施例代表允许本领域技术人员实践本发明的必要信息，并且示出实践本发明的最佳方式。一旦根据附图阅读了以下的描述，本领域技术人员就将理解本发明的构思并且将认识到此处未特别阐明的这些构思的应用。应当理解，这些构思和应用落入本公开和所附权利要求书的范围。

参照附图1-18，采用插片法将菌株SCY114接种到高氏一号平板培养基上，同时将灭菌的盖玻片(1cm×1cm)斜插入培养基内，28℃培养7d后在光学显微镜和电子扫描显微镜下观察气生菌丝、基内菌丝、孢子丝和孢子的形态特征

菌株SCY114菌落在高氏一号培养基上呈欧灰色，单菌落边缘呈放射丝状，有褐色可溶性色素。气生菌丝发达，不断裂，孢子链螺旋状或直-柔曲状，孢子表面光滑，呈圆柱形。分离出链霉菌SCY114菌株并将其植入种子培养基中进行培养；

其发酵工艺为：(1)分离出链霉菌SCY114菌株并将其植入种子培养基中进行培养48小时；(2)按体积比为6％的比例将种子培养液接种到pH值为6-7的发酵培养基中；(3)取所述接种后的发酵培养基装瓶，置于温度为25摄氏度-30摄氏度，200转/分的环境中发酵。

种子培养：用接种针将培养好的斜面菌种挖块接种于装有150mL种子培养基的500mL三角瓶中，置摇床28℃，180r/min振荡培养48h，使菌体处于对数生长期。

发酵培养：吸取5mL液体种子液加到装液量为80mL发酵培养基的250mL三角瓶中，置摇床28℃，180r/min振荡培养120h。

目的菌株的筛选：以小麦全蚀病菌为靶标，利用传统的平板对峙法进行初筛，以杯蝶法进行复筛，筛选对小麦全蚀病菌有拮抗活性的链霉菌，记录其编号，并分别转接到高氏一号斜面培养基上保存。

配制13组发酵培养基方案如下：

A：黄豆粉20g，碳酸钙5g，葡萄糖20g，水1000mL。

B：黄豆饼粉10g，葡萄糖10g，蛋白胨3g，食盐2.5g，碳酸钙2g，水1000mL。

C：牛肉浸膏10g，蛋白胨10g，食盐5g，水1000mL。

D：蛋白胨10g，牛内浸膏10g，甘油10g，水1000mL。

E：玉米粉35g，黄豆饼粉10g，磷酸二氢钾1g，食盐3g，碳酸钙3g，硫酸铵4g，水1000mL。

F：黄豆饼粉20g，玉米粉20g，葡萄糖10g，硫酸铵4g，碳酸钙6g，水1000mL。

G：葡萄糖2g，酵母膏2g，牛肉浸膏2g，蛋白胨2g，甘油20g，黄豆饼粉20g，硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g.碳酸钙1g，水1000mL。

H：黄豆饼粉15g，可溶性淀粉10g，葡萄糖20g，食盐4g，硫酸铵2.5g，磷酸二氢钾02g，碳酸钙1g，水1000mL。

I：蛋白胨5g，磷酸氢二钾1g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，水1000mL。

J：淀粉20g，食盐0.5g，硝酸钾1g，硫酸亚铁0.01g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.005g，水1000mL。

K：黄豆饼粉20g，可溶性淀粉20g，KNO₃ 1.0g，K₂HPO₄ 0.5g，MgSO4.7H₂O0.5g，FeSO₄.7H₂O 0.01g，蒸馏水1000mL，pH7.2～7.4。

L：可溶性淀粉10g，磷酸二氢钾0.3g，氯化钠0.5g，硫酸镁1g，硝酸钾1g，水1000mL。

M：马铃薯20g，葡萄糖20g，水1000mL。

N：玉米粉50g，磷酸二氢钾0.23g，磷酸氢二钠1.15g，硫酸镁0.2g，氯化钾0.2g，水1000mL。

O：黄豆粉饼20g，玉米粉15g，葡萄糖15g，酵母粉4g，磷酸二氢钾1g，碳酸钙3g，氯化钠1g，水1000mL。

如附图1所示，横坐标为培养基序号，纵坐标为抑制带长度，试验结果用DPS软件处理，通过极差和方差分析，确定菌株的最佳发酵培养基配方。结果测得可溶性淀粉1％-3％，黄豆饼粉4％-6％，K₂HPO₄ 0.05％-0.1％，MgSO₄ 0.025％-0.075％时发酵效果最佳，为最优培养基配方。

如附图2所示，横坐标为发酵时间，纵坐标为抑制率，在其他实验条件相同的情况下，选取10组不同时间下对抗生素影响实验在相同的发酵条件下，菌株SCY114的产素量随着发酵时间的延长逐渐升高，在第5d时，抗生素产量达到高峰，此后，随着发酵时间延长，抗生素产量趋于稳定，与第5d的产素量基本维持在同一水平。由此可见，5d是其发酵的最佳时间，既保证了抗生素的产量，又节约了成本，同时也避免了发酵时间过长导致菌丝体自溶面而影响代谢活性物质的积累。

如附图3所示，横坐标为种龄，纵坐标为抑制率。随着接种量的增加发酵液抑菌活性逐渐升高，当接种量为6％时发酵效果最好，此后当接种量大于6％时，发酵液活性逐渐降低，6％的接种量为最适的接种量。

如附图4、5所示，图4横坐标为转速，纵坐标为抑制率。图5横坐标表示装液量，纵坐标表示抑制率。转速对菌株SCY114发酵效果有明显的影响，其中200r/min时产素量最高，因此发酵最佳转速为200r/min。随着瓶装量的改变，菌株SCY114产素量有明显的变化，其中250mL三角瓶装入70mL时发酵效果最佳，即28％的装液量更有利于抑菌物质的合成。

附图6所示，横坐标为温度，纵坐标为抑制率，发酵温度对菌株SCY114发酵效果有着明显的影响，在25℃～30℃范围内发酵效果较好，且28℃为最佳发酵温度。

如附图7所示，横坐标表示pH值，纵坐标表示抑制率。在不同初始pH值的培养基中，菌株SCY114的发酵效果呈现出了明显差异。当初始pH为3时，菌体不能生长且不能产生抗生素，随着pH升高，抗生素的产量逐渐上升，在pH为6～7时达到最大值，当pH大于7.0时抗生素产量开始缓慢下降。因此，适合菌株SCY114产素的最适初始pH为6～7。

如附图8所示，方形点曲线表示菌丝浓度，三角形曲线代表PH值，菌株SCY114发酵过程中，发酵液的pH变化不大，随着发酵时间的延长缓慢升高，由初始的pH6.5升到pH9.0。菌丝体在pH缓慢升高的初期逐渐积累，当pH为8.1时，菌丝体浓度最大，随后随着pH的上升逐渐下降。

如附图9所示，横坐标表示种子培养时间，纵坐标表示抑制率。菌株SCY114在种子培养基中培养48h后接种至发酵培养基时，发酵效果最好。因此，种子液的最佳培养时间为48h。

如附图10所示选取该抗生素经60摄氏度，80摄氏度，100摄氏度，120摄氏度处理后抗菌能力实验，对比组为未经处理的原液，表明该抗生素具有良好的热稳定性。完全符合微生物农药对热稳定性的要求。

如图11所示，选取该抗生素在pH值为1-10的环境中的抗菌能力，表明抗菌活性物质在酸碱环境中均较稳定。

该链霉菌可产生抗生素，经鉴定其分子量为466.3Da，分子式为C₂₇H₂₇N₆O₂。活性成分对多种植物病原真菌具有抑制活性，可有效防治植物土传真菌病害。该抗生素对寄主植物有诱导抗性，可诱导寄主植物体，植物保卫素的积累，从而阻止病原真菌之植物体内的增殖和病害扩展。如附图12-19表示生防菌对各种病菌的防治作用，该生防菌除对小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.tritici)具有良好的抗生作用外，对小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、小麦根腐病菌(Bipolaris sativus)、小麦赤霉病菌(Fusariumgraminearum)、玉米青枯病菌(Pythium aphanidermatum)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)、玉米弯胞霉叶斑病菌(Curvularia lunata)、水稻稻曲病菌(Ustilaginaoidea virens)、高粱炭疽病菌(Colletotrichum graminicola)、黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)、西瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、烟草早疫病菌(Alternaria tenuissima)等多种植物病原真菌具有良好的拮抗作用。该链霉菌所产生的抗生素可诱导寄主植物体内植物保卫素的积累，从而阻止病原真菌之植物体内的增殖和病害扩展。

Claims

1.小麦全蚀病生防链霉菌SCY114，馆藏编号为：CGMCC No.5213。

2.制备如权利要求1所述的小麦全蚀病生防链霉菌SCY114发酵工艺，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)分离出所述链霉菌SCY114菌株并将其植入种子培养基中进行培养；培养时间为48小时；

2)取种子培养基中种子培养液接种到pH值为6-7的发酵培养基中；

3)取所述接种后的发酵培养基装瓶，置于温度为25摄氏度-30摄氏度，200转/分的环境中发酵培养120小时。

3.如权利要求2所述的小麦全蚀病生防链霉菌SCY114发酵工艺，其特征在于：分离出链霉菌SCY114菌株并植入种子培养基中进行培养，培养时间为48小时。

4.如权利要求2所述的小麦全蚀病生防链霉菌SCY发酵工艺，其特征在于：种子液的接种量为6％；发酵培养基装瓶时装夜量为28％。

5.如权利要求2所述的小麦全蚀病生防链霉菌SCY发酵工艺，其特征在于：当发酵液pH为8.1～8.3时，菌体浓度和代谢产物的产量达到最大值。

6.如权利要求2-4所述的小麦全蚀病生防链霉菌SCY114发酵工艺，其特征在于：所述发酵培养基包括可溶性淀粉1％-3％，黄豆饼粉4％-6％，K₂HPO₄0.05％-0.1％，MgSO₄ 0.025％-0.075％。