CN102511504A - 一种用内生枯草芽孢杆菌生产生物农药的方法 - Google Patents
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Abstract
一种用内生枯草芽孢杆菌生产生物农药的方法，属于生物农药的制造领域，将内生芽孢杆菌菌株于含有牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％的种子培养液中，32℃、170r/min条件下振荡培养24h，作为生产菌种子；将上述种子培养液按接种量为6％的比例接种至包括有黄豆饼粉、可溶性淀粉、蛋白胨和NaCl的发酵培养基中，于发酵温度为30℃-34℃，pH值为5-9的条件下发酵培养72h；将菌体浓度大于0.5×109cfu/mL的发酵培养液喷雾干燥后，制成菌体含量大于2.0×109cfu/g的可湿性粉剂。该方法利用了内生枯草芽孢杆菌能在小麦根际和体内定殖以及该内生细菌可产生生物表面活性素(Surfactin)类抗菌物质的特性，对小麦纹枯病防治效果明显。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物农药的制造方法，特别涉及一种用内生枯草芽孢杆菌生产生物农药的方法。
背景技术
小麦纹枯病已成为我国麦区常发病害。小麦受纹枯菌侵染后，在各生育阶段出现烂芽、病苗枯死、花秆烂茎、枯株白穗等症状。烂芽芽鞘褐变，后芽枯死腐烂，不能出土；病苗枯死发生在3-4叶期，初仅第一叶鞘上现中间灰色，四周褐色的病斑，后因抽不出新叶而致病苗枯死；花秆烂茎拔节后在基部叶鞘上形成中间灰色，边缘浅褐色的云纹状病斑，病斑融合后，茎基部呈云纹花秆状；枯株白穗病斑侵入茎壁后，形成中间灰褐色，四周褐色的近圆形或椭圆形眼斑，造成茎壁失水坏死，最后病株因养分、水分供不应求而枯死，形成枯株白穗。
引起小麦纹枯病的病原主要是禾谷丝核菌，小麦纹枯病菌除对小麦表现强劲的致病能力，还侵染玉米，水稻。目前主要的防止方法为：播种前药剂拌种用种子重量0.2％的33％纹霉净(三唑酮加多菌灵)可湿性粉剂或用种子重量0.03％-0.04％的15％三唑醇(羟锈宁)粉剂、或0.03％的15％三唑酮(粉锈宁)可湿性粉剂或0.0125％的12.5％烯唑醇(速保利)可湿性粉剂拌种。播种时土壤相对含水量较低则易发生药害，如每kg种子加1.5kg种子加1.5mg赤霉素。②翌年春季冬、春小麦拔节期，667m2用5％井冈霉素水剂7.5g对水100kg或15％三唑醇粉剂8g，对水60kg或 20％三唑酮乳油8-10g，对水60kg，12.5％烯唑醇可湿性粉剂12.5g，对水100kg或50％利克菌200g，对水100kg喷雾，防效比单独拌种的提高10％-30％，增产2％-10％。此外还可选用33％纹霉净可湿性粉剂或50％甲基立枯灵(利克菌)可湿粉400倍液。
以上防治小麦纹枯病的方法会存在一些不足，上述化学农药的长期、大量施用容易产生环境污染、抗药性以及农药残留等问题，因此以植物微生态学为基础控制有害生物的生物防治技术已成为小麦纹枯病防治研究的热点。
发明内容
针对现有小麦纹枯病防治中长期、大量施用化学农药容易产生环境污染、抗药性以及农药残留等问题，本发明提供了一种用内生芽孢杆菌生产生物农药的方法。该方法利用了能防治小麦纹枯病的内生芽孢杆菌的代谢活性物与适乐时悬浮种衣剂即2.5％咯菌腈制剂复配，防治效果明显。
为达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种内生芽孢杆菌EBS，于2011年9月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，馆藏号为CGMCC No.5239。保藏单位的地址为“北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所”，保藏地址的邮政编码为“100101”，其分类命名为“枯草芽孢杆菌”，分类命名的拉丁文名称为Bacillus、subtilis。
一种用内生芽孢杆菌生产生物农药的方法，包括如下步骤：
(1)将内生芽孢杆菌菌株于含有牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％的种子培养液中，32℃、170r/min条件下振荡培养24h，备用；
(2)将上述内生细菌种子培养液，按接种量为6％的比例接种至包括有黄豆饼粉、可溶性淀粉、蛋白胨和NaCl的发酵培养基中，发酵温度为30℃-34℃，pH值为5-9的条件下发酵培养72h；
(3)当所述发酵培养液菌体浓度大于0.5×109cfu/mL后，进行喷雾 干燥，制成菌体含量大于2.0×109cfu/g的可湿性粉剂。
作为本技术方案进一步改进，将所述发酵后的发酵培养液与10％适乐时悬浮种衣剂即2.5％咯菌腈制剂复配，其复配比例为7∶3。
有益效果：内生枯草芽孢杆菌(简称EBS)能在小麦根际和体内定殖以及该内生细菌可产生表面活性素(Surfactin)类抗菌物质；活菌剂对小麦纹枯病的室内防治效果为91.2％，大田防治效果为66.3％，代谢活性物与适乐时悬浮种衣剂或咯菌腈制剂复配后EC50为81.845μg/mL，增效比值为SR＝1.23，二者对小麦纹枯病的防治具相加作用，而且防治效果稳定。大田防治效果与咯菌腈单剂相当，大大降低了化学农药的施用量和防治成本。
说明书附图
图1为EBS的菌落生长形态图；
图2为EBS的芽孢形态显微观察图；
图3为EBS生长曲线图；
图4为EBS在小麦体内定殖动态
图5为EBS粗提物对小麦纹枯病菌抑制作用实验图；
图6为EBS粗提物对黄瓜灰霉病菌抑制作用实验图；
图7为EBS粗提物小麦赤霉病菌抑制作用实验图；
图8为EBS粗提物西瓜炭疽病菌抑制作用实验图；
图9为EBS粗提物黄瓜枯萎病菌抑制作用实验图；
图10为EBS粗提物烟草赤星病菌抑制作用实验图；
图11为EBS粗提物为EBS粗提物小麦全蚀病菌抑制作用实验图；
图12为EBS粗提物高梁炭疽病菌抑制作用实验图；
图13为EBS粗提物瓜果腐霉抑制作用实验图。
表1为EBS对小麦纹枯病的盆栽防治效果
表2为EBS对小麦纹枯病的大田防治效果
具体实施方式
下面阐述的实施例代表允许本领域技术人员实践本发明的必要信息，并且示出实践本发明的最佳方式。一旦根据附图阅读了以下的描述，本领域技术人员就将理解本发明的构思并且将认识到此处未特别阐明的这些构思的应用。应当理解，这些构思和应用落入本公开和所附权利要求书的范围。
参照附图1-13
(1)从植物组织中分离出内生枯草芽孢杆菌(EBS)，该菌株于2011年09月05日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存编号为：CGMCC NO.5239。
(2)将EBS菌株于含有牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl 0.5％的种子培养液中，32℃、170r/min条件下振荡培养24h，备用；
(3)将上述内生细菌种子培养液，按接种量为6％的比例接种至包括有黄豆饼粉、可溶性淀粉、蛋白胨和NaCl的发酵培养基中，发酵温度为30℃-34℃，pH值为5-9的条件下发酵培养72h；发酵液中菌体浓度大于0.5×109cfu/mL。
(3)当所述发酵培养液菌体浓度大于0.5×109cfu/mL后，进行喷雾干燥，制成菌体含量大于2.0×109cfu/g的可湿性粉剂。
所述发酵后的发酵培养液与10％适乐时悬浮种衣剂即2.5％咯菌腈制剂复配，其复配比例为7∶3，因为代谢活性物与适乐时悬浮种衣剂或咯菌腈制剂复配后EC50为81.845μg/mL，增效比值为SR＝1.23，二者对小麦纹枯病的防治具相加作用，而且防治效果稳定。大田防治效果与咯菌腈单剂相当，大大降低了化学农药的施用量和防治成本。
EBS菌株接种于NA培养平板，28℃条件下培养1d～3d，观察其菌落形态和颜色，如附图1-2所示，EBS在NA培养基上生长良好，菌落乳白色，不产生色素，没有荧光，菌落不规则、隆起，表面形成不规则的褶皱(见图4)。培养24d后产生轻微腥臭气味。在NA培养液中生长良好，在培养液表面形成褶皱的膜层，生长物聚在膜下，液体不浑浊。菌体呈杆状，大小为2μm～8μm。革兰氏染色阳性(G+)。芽孢呈卵圆形或球形
如附图3所示，EBS产生的抗菌活性物质随菌体的生长而逐渐积累，培养72h后菌体数量达最高值，此时抑菌物质产量达最大值，72h后菌体数量迅速下降，抑菌活性也随之降低。分析活性物质活性强弱与菌体繁殖数量的关系，活性物质是在细菌生长过程中逐渐积累的，至生长后期活性物质产量减少，可能是随着菌体浓度增加，培养基中养分消耗殆尽，菌体生长活力下降，次级代谢能力随之降低。提示，在对该菌进行大规模发酵时，需要进行分批补料，以维持其活性物质的大量积累。在72h时活性物质产生最多，因此在发酵液制备时培养时间以72h为宜。
分别选取施加了该编号1、2、3农药试剂的小麦植株与分别施加等量井冈霉素、清水的小麦植株进行对比试验，接种小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)10-12天后，施加该生物农药1、2、3的小麦 植株生长良好，施加井冈霉素的效果较次，对照组出现明显的病害症状表现。
本活体内生枯草芽孢杆菌在植物根际和小麦体内具有较强的定殖能力，且能从根部向茎、叶部转移，其定殖量与菌株的接种浓度呈正相关。其定殖量在施用10-12天后达到最大值，施用该菌剂进行小麦纹枯病害防治的时，应分别于小麦纹枯病发病高峰期即冬前期和返青期的前10d左右施药可达到理想的防治效果。
该内生细菌EBS可产生脂肽类代谢活性物质，经鉴定其活性成分为β-羟基12-15碳脂肪酸肽类生物表面活性素(β-hydroxy-C12-C15-Leu7surfactin A)同系物，其分子量分别为1035.65Da，1021.64Da，1007.63Da和993.65Da，活性成分对多种植物病原真菌和烟草花叶病毒具有抑制活性，可有效防治植物土传真菌病害和病毒病害。
如附图5-13所示，其显示了EBS的抗菌谱，菌体生长正常的为对照组，菌体生长受到抑制的为加有EBS的实验组，从实验结果来看，实验组附近的菌体生长明显受到了EBS代谢产物的抑制。结果显示，该生物农药对小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)小麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、西瓜炭疽病菌(Colletetrichum orbiculare)、黄瓜灰霉病菌(Botrytis cinerea)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、高梁炭疽病菌(Colletotrichum graminicola)、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)等多种植物病原真菌具有良好的拮抗作用。
表1、表2结果显示，EBS对小麦纹枯病具有良好的防治效果，无论是盆栽试验还是大田试验，EBS的防治效果均优于对照药剂咯菌腈。除菌发酵液对小麦纹枯病的盆栽和大田防治效果分别可达88.2％和56.2％，说明EBS代谢活性物质在其生防过程中发挥重要作用。而带菌发酵液对小麦纹枯病的大田防治效果显著高于除菌发酵液和对照药剂，则说明EBS代谢活性物质在发挥生防作用的同时，菌体在小麦体内的定殖与其在田间持续发挥防治作用具有密切关系，因此，在进行菌剂开发时，无论是采用固体发酵还是液体发酵技术，直接以发酵混合物(液)为主要成分进行剂型加工是可行的。
表1EBS对小麦纹枯病的盆栽防治效果
表2EBS对小麦纹枯病的大田防治效果
Claims (2)
1.一种用内生枯草芽孢杆菌生产生物农药的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将内生枯草芽孢杆菌EBS菌株于含有牛肉膏0.3％，蛋白胨1.0％，NaCl0.5％的种子培养液中，32℃、170r/min条件下振荡培养24h，备用；
(2)将上述内生细菌种子培养液，按接种量为6％的比例接种至包括有黄豆饼粉、可溶性淀粉、蛋白胨和NaCl的发酵培养基中，发酵温度为30℃-34℃，pH值为5-9的条件下发酵培养72h；
(3)当所述发酵培养液菌体浓度大于0.5×109cfu/mL后，进行喷雾干燥，制成菌体含量大于2.0×109cfu/g的可湿性粉剂。
2.如权利要求1所述的一种用内生枯草芽孢杆菌生产生物农药的方法，其特征在于，将所述发酵后的发酵培养液与10％适乐时悬浮种衣剂即2.5％咯菌腈制剂复配，其复配比例为7∶3。
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