CN103525725A

CN103525725A - 一株丁香假单胞菌及其在番茄灰霉病防治中的应用

Info

Publication number: CN103525725A
Application number: CN201310441326.3A
Authority: CN
Inventors: 曲娟娟; 金羽; 于敏; 张春苗; 黎扣扣
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2013-09-25
Filing date: 2013-09-25
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2033-09-25
Also published as: CN103525725B

Abstract

本发明涉及一株丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae），命名为ZY-1，微生物保藏号为CGMCC No.7906，保藏日期为2013年07月10号，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。以及该菌株的代谢产物对植物的病害的治愈功能，本发明具有功效明显、治愈时间短、对环境无污染、操作简便等优点。

Description

一株丁香假单胞菌及其在番茄灰霉病防治中的应用

技术领域

本发明涉及一株丁香假单胞菌，尤其涉及该菌株在番茄灰霉病防治中的应用，属于生物技术领域。

背景技术

番茄灰霉病是一种常见且危害较重的真菌病害，除危害番茄外，还可危害茄子、辣椒、黄瓜等20多种作物。低温、连续阴雨天气多的年份危害严重，发病严重时造成茎叶枯死和大量的烂花、烂果，直接影响产量。目前常用的防治措施就是摘取老叶，加大通风，降低空气湿度。药物方面主要是利用万霉灵粉剂、百菌清烟剂熏棚或是用甲霜灵可湿性粉，但是无论用哪种方法其治愈效果都不理想。为了寻求安全有效的防治措施，人们越来越关注生物防治。生物防治是利用一种或多种生物（除人类外）或其代谢产物来降低植物病原物的数量或抑制其致病能力而减轻植物病害的一类措施。与传统的防治技术相比，生物防治技术具有不污染环境、对人和其他生物安全、防治作用持久、产品无残留、对病虫的杀伤特异性强，易于同其他植物保护措施协调配合并能节约能源等优点，必将在有害生物综合防治中发挥着越来越重要的作用。到目前为止，真菌、酵母菌、细菌、放线菌都可用于生物防治。例如：利用稻黑孢菌46和链格孢菌的代谢产物进行生物防治。利用细菌制约有害微生物是开发、利用微生物资源的重要研究领域之一，也是植物病害防治中最具有潜力、应用前景最为广阔的有效途径之一。其主要优势在于：繁殖速度快、对病原菌的作用方式较广、培养成本低廉，而且在培养时还会产生很多的抗菌物质，如细菌素、抗生素、胞外裂解酶、脂肽类等多种形式，有些细菌不仅能防治病害而且可以增加作物产量。

近年来，国内外的许多学者都在利用有益的微生物或其代谢产物来抑制病原微生物，使生物防治发展迅速，其中假单胞菌在植物病害防治中起到了非常重要的作用。非致病假单胞菌活跃于植物根际，属于植物根际促生菌一类，植物根际假单胞菌已被应用在谷物种子或土壤中以抑制谷物病原菌的生长。非致病假单胞菌生物防治作用主要通过根际营养竞争、分泌降解微生物的酶及抗生作用等实现。分离自小麦全蚀病自然衰退土壤的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)2P24能产生多种抗菌物质，可以有效防治多种植物病原真菌、细菌引起的土传病害。随着人们对环境保护意识的增强，对绿色食品需求的增加，利用微生物代谢产物替代化学药物防治农作物病虫害将是今后农业发展的重点，它必将有力地推进生防事业的发展，造福人类。

发明内容

本发明针对番茄灰霉的生物防治问题，提供了一种丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1，及利用该菌株发酵培养液防治植物灰霉病害的方法。

本发明丁香假单胞菌的分离、筛选与鉴定：

1、从黑龙江伊春五营森林公园土壤样品中分离、纯化后获得一株具有抗真菌活性的细菌；经微生物分类学鉴定为丁香假单胞菌（Pseudomonas sp.），命名为丁香假单胞菌（Pseudomonas sp.）ZY-1。所述菌株微生物保藏号为：CGMCC No.7906，保藏日期2013年07月10号，其分类命名为：假单胞菌科假单胞菌属丁香假单胞菌Pseudomonas sp.，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2、本发明所述丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的分离和纯化

（1）菌株的分离：将10g土壤样品加入到90ml无菌水中，用10倍稀释法分别配置10^-5、10^-6、10^-7g/ml的土壤悬液，分别涂布到分离培养基（分离培养基即为LB固体培养基）上，32℃培养2天，观察出现抑菌圈的菌落，测定溶真菌圈直径(D)、菌落直径(d)，根据能否产生溶菌圈与D/d值大小来初步确定菌株的抑菌能力，将D/d≥1.5的菌株在LB培养基上划线纯化、32℃培养1天；

（2）菌株的纯化：接种环挑取上述分离菌株培养物，划线接种到LB固体培养基平板上，32℃培养，待出现单菌落后，重复上述操作2-3次，直到出现单菌落。将单菌落培养物接种至无菌LB试管斜面培养基，32℃培养1天后，于4℃下保存备用。

3、本发明所述丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的分离和纯化后经鉴定，具有如下生物学特征：

（1）菌株形态特征：该菌株单菌落直径小于1mm，在固体培养基上的菌落呈白色，圆形，较小，表面光滑，不透明，易挑取，菌落不粘稠，菌体细胞在电镜下呈短杆状，有鞭毛，革兰氏阴性。在32℃条件下最适生长，通过电镜观察细菌的形态，该细菌是杆状，细菌的大小是1.3μm×3.7μm。

（2）菌株生理生化特征：革兰氏染色阴性；能够液化明胶；脂酶实验呈阴性；能利用D-葡萄糖产酸；氧化酶实验呈阴性；甲基红实验呈阴性；V-P实验结果呈阴性。

（3）菌株分子生物学特征：菌株ZY-1的16SrRNA共测出1436个碱基，在核酸数据库GenBank(NCBI，网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)登录号为KC355362，16S rRNA的序列见SEQ No.1。

4、防治番茄灰霉真菌病害的丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1菌株的代谢产物制备，包括以下步骤：

（1）菌种的活化培养：将分离保存的丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1菌株转接到LB固体培养基上，32℃±1℃条件下培养，培养24h得到活化后的菌种，用直径4mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；

（2）发酵培养：发酵培养基（g/L）为2.05%蛋白胨、1.5%甘油、0.8%MgSO₄·7H₂O、0.25%K₂HPO₄，每个250ml三角瓶装发酵培养液100ml；配置后在121℃灭菌30min，冷却至35℃时，无菌条件下接种该细菌，在32℃±1℃条件下，摇床转速110r/min，发酵培养24h。发酵液经过旋转蒸发仪60℃浓缩2h后4℃冰箱保存备用，用于后续的抗性检测。

本发明的有益效果：

（1）本发明是从土壤中分离筛选出代谢产物对部分植物真菌病害尤其是番茄灰霉病害具有较强的抑制效果的丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1，为生物防治提供了一种微生物菌株；

（2）本发明是利用丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1液体发酵培养后获得的发酵液，该发酵液经浓缩后应用于植物真菌病害的生物防治，为微生物应用于生物防治的开发提供了新的途径。

附图说明

图1为丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1的电镜图；

图2为丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1的生长曲线图；

图3为丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1的抗番茄灰霉图，其中A为实验组，B为对照组；

图4为丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1的盆栽实验图，其中，A为空白对照组，B为未处理组，C为处理组；

图5为丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1盆栽实验叶片图，其中，A为空白对照组，B为未处理组，C为处理组。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

种子培养基（g/L）：蛋白胨2.4%、甘油1.6%、MgSO₄·7H₂O0.8%、K₂HPO₄0.25%；

发酵培养基（g/L）：蛋白胨2.05%、甘油1.5%、MgSO₄·7H₂O0.8%、K₂HPO₄0.25%。

实施例1丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1菌株生长曲线测定

将丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1菌株按质量分数为5%的量接入种子培养基32℃±1℃，110r/min条件下培养，以未接种的培养基作参比，用紫外分光光度计测定不同时间的OD₆₀₀值，以OD₆₀₀值为纵坐标，培养时间为横坐标绘制菌株生长曲线。可见，在0-5h时该菌株处于生长的延滞期生长缓慢；5-10h属于对数期，菌体呈指数生长，生长较快；11-15h属于稳定期，活菌量稳定且有最大值；16h之后属于衰亡期，活菌量迅速下降，实验结果见图1。

实施例2：丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1菌株发酵液的制备

（1）菌种的活化培养：将分离保存的丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae） ZY-1菌株转接到LB固体培养基上，32℃±1℃条件下培养，培养24h得到活化后的菌种，用直径4mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用；

（2）发酵培养：每个250ml三角瓶装发酵培养液100ml；配置后在121℃灭菌30min，冷却至35℃时，无菌条件下接种该细菌，在32℃±1℃条件下，摇床转速110r/min，培养24h。得到的发酵液经过旋转蒸发仪60℃浓缩2h后4℃冰箱保存备用。

试验例1：丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1菌株发酵液对番茄灰霉的抗性检测

取经0.22μm膜过滤实施例2获得的发酵液1ml于无菌培养皿内，与9ml冷却至45℃的PDA培养基迅速混匀，冷却后在每个培养皿平面分别放1个直径为4mm的番茄灰霉（Botrytis cinerea）菌饼接于培养皿中央（培养皿直径为9cm），置培养箱28℃培养72h，以无菌水处理作为对照，重复3次；采用十字交叉法测定菌落直径，测定结果为：对照组为90mm，处理组为5.09mm三组。

菌丝生长抑制率的公式如下：

测定结果表明：丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1代谢产物对番茄灰霉病菌的抑制率为98.73%。

试验例2丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1菌株代谢产物对番茄植株的生防作用）

（1）菌种的活化培养：将分离保存的丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）ZY-1菌株转接到LB固体培养基上，32℃±1℃条件下培养，培养24h得到活化后的菌种，用直径4mm打孔器打孔获得菌饼，供接种用。

（2）丁香假单胞菌的发酵液对番茄灰霉盆钵试

选择25钵生长健壮的番茄苗，分组处理，每处理5次重复，共3个处理。处理组9钵和未处理组5钵都接种2ml番茄灰霉病菌孢子液（孢子液浓度为10⁷/ml），24h后处理组喷施发酵液（4.5ml/株），用喷雾器喷洒在番茄植株叶片正反两面和枝条上，同时设立空白对照组5钵。于15:00-16:00喷洒发酵液，接种后套袋保湿24h，正常培养条件，每隔2天喷洒发酵液一次，共喷洒3次，喷洒量为4.5ml。7天后观察实验并记录番茄枝叶的病情指数，未处理组番茄苗发病严重，在叶片表面可看到有清晰的白色菌丝生长，植株开始发黄枯萎；处理组番茄苗发病较轻，仅有少数叶片出现枯萎现象，看不到菌丝生长现象；空白对照组番茄苗生长良好，不发病。

（3）试验结果：

病情指数=（病叶数×相对级数）×100／（调查总叶数×9）

防治效果（%）=（未处理病指-处理病指）×100／未处理病指

病情指数分析：0级为无病斑；1级为病斑面积占整个叶片面积的5%以下；3级为病斑面积占整个叶面积6-10%；5级病斑面积占整个叶面积的11-25%；7级病斑面积占整个叶片面积的26-50%；9级病斑面积占整个叶面积的50%以上。

说明丁香假单胞菌菌株的发酵液里的活性物质能抑制番茄灰霉孢子的生长，因此能保护番茄苗免受番茄灰霉病的侵害，也能有效预防番茄灰霉病菌的侵入和扩展，对番茄灰霉病有一定的防治作用。

Claims

1.一株丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae），命名为ZY-1，微生物保藏号为CGMCC No.7906，保藏日期为2013年07月10号，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.权利要求1所述的丁香假单胞菌ZY-1菌株在制备防治番茄灰霉病药物中的应用。

3.权利要求1所述的丁香假单胞菌ZY-1菌株的代谢产物在制备防治番茄灰霉病药物中的应用。