CN102870822B - 木霉菌厚垣孢子生物农药水分散粒剂及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及以木霉菌厚垣孢子为主要成分的微生物活体生物农药水分散粒剂及其制备方法，属于生物农药和生物化学技术领域领域。通过在高效组合成分的培养基以液体发酵培养获得高浓度木霉菌厚垣孢子，以木霉菌厚垣孢子作为有效成分与微生物菌体保护剂、崩解剂和粘接剂组合，通过造粒、干燥制成生物农药水分散粒剂。该制剂木霉菌厚垣孢子含量高，具有较高的耐贮性和抗紫外线能力，溶于水后快速崩解分散，在使用过程中避免了粉尘飞扬，兼有可湿性粉剂和水悬浮剂的优点，显著提高了微生物农药制剂对植物病害防治的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于生物农药和生物化学技术领域。
背景技术
随着经济发展和环境可持续发展的要求，寻找新的、符合农业可持续发展的农业病害防治措施成为当前农业生产研究的热点。由于生物防治无污染、无残留的优点引起人们的关注。目前生防菌株以及活性抗菌成份的研究和开发成为新型生物农药竞争的焦点。
木霉菌是一类重要的生防真菌，目前市场上的木霉制剂均是分生孢子制剂和菌丝型制剂，多是由固体发酵而来，如以色列的Makhteshim Agan公司的Trichodex，可用于防治灰霉病。我国也有类似的产品登记，如特立克和灭菌灵。但是其生产量不大，在市场上的占用率很低。虽然固体发酵产物可以直接施用，后处理简单，成本低，但是将其大规模用于植物病害的防治还存在着一些问题。以分生孢子为活性成分的制剂，保质期一般只有3个月左右，从而导致田间防效稳定性得不到保证，在植物病害防治中尚不能完全发挥作用。可见，木霉生物农药制剂的货架期短，是目前生物农药生产和应用的瓶颈。常见的木霉分生孢子制剂主要为可湿性粉剂，在使用过程中，存在粉尘飞扬的缺点。厚垣孢子是木霉菌抵抗不良环境而产生的一种休眠结构，具有耐干燥、耐低温、对土壤抑菌作用不敏感及存活期长等优点，因此，厚垣孢子的研究必将丰富木霉菌的研究领域，使木霉菌的研究与应用更深入更广泛，木霉厚垣孢子制剂的商品化开发已成为木霉菌研究的一个趋势。尽管如此，先前的研究尚未突破制备高浓度厚垣孢子的培养方法，尤其是液体发酵方法，寻找适宜的发酵培养条件以求得到高生物量的厚垣孢子，制备厚垣孢子水分散粒剂等可以延长菌剂的保存时间，增加木霉菌的利用价值，是目前亟待解决的问题。
水分散粒剂(Water Dispersible Granules)是在20世纪80年代研制而成的化学农药新剂型，是通过向可湿性粉剂中加入粘结剂和崩解剂后制成的。它有溶于水后快速崩解分散，兼有可湿性粉剂和水悬浮剂的优点，同时克服了可湿性粉剂的粉尘污染和悬浮剂的物化性质不稳定等缺点。水分散粒剂由活性成分、湿润剂、分散剂、崩解剂、稳定剂、粘结剂及载体等组成，粒径200～5000um，入水后能迅速崩解、分散，形成高悬浮分散体系。一般化学农药对水分散粒剂的相关载体和助剂要求不高，但生物制剂由于是以活菌体为活性成分，所以在载体和助剂的筛选过程中要充分考虑载体和助剂的生物相容性和储存稳定性。
助剂在水分散粒剂的形成和使用性能上有决定性作用。水分散粒剂由活性成分、助剂、载体等经过混合，粉碎后造粒而成。在造粒过程中，需要粘结剂的粘合作用，放入水中时需要润湿剂的润湿和崩解剂的快速崩解，以及通过分散剂形成高悬浮的分散体系。对于制备生物农药水分散粒剂，不仅要筛选高性能的专用助剂并使其有很好的配伍性，而且还要有良好的生物相容性，以防出现生物降解、储藏稳定性降低等问题。目前，生物农药助剂的筛选主要为各种改善制剂物理化学性能、提高生物防治效果以及保护生防因子的各种添加剂，如润湿剂、分散剂、保护剂、粘结剂、崩解剂、增效剂等。
发明内容
选用的木霉菌菌种为绿色木霉(Trichoderma viride)，哈茨木霉(Trichoderma haziamum)，康氏木霉(Trichoderma konigii)和黄绿木霉(Trichoderma auxeoviride)。这些木霉菌菌种一些已经登记进入市场，均可以从市场或有关单位买到。
将分离纯化的木霉菌菌种在PDA培养基上28℃下培养6天，产生大量绿色分生孢子。用接种环将木霉菌分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝后，将孢子浓度调节至107cfu/mL，按照1％的接种量接种到液体培养基中，液体培养基由可溶性淀粉，碳酸钙，麦麸，硫酸铵和磷酸二氢钾以及大豆油等按比例组合制成，接种后在28℃发酵培养7天，获取制备大量木霉菌厚垣孢子，而后将木霉菌发酵液通过吸附剂吸附后制成水分散粒剂。
本发明的核心技术是通过液体培养基发酵生产大量木霉菌厚垣孢子，将发酵培养液用吸附剂吸附形成母液，加入活体微生物保护剂、崩解剂和粘接剂混合均匀，然后通过挤压造粒制得水分散粒剂。
上述所用的培养基和分散粒剂成分的材料均可以从市场上购买。
采用木霉菌厚垣孢子加工成的水分散粒剂，由于木霉菌厚垣孢子在贮藏期间处于休眠状态，受外界不良条件干扰少，制成的水分散粒剂贮藏性能得到了提高，可以在常温下长时间贮藏。
本发明解决的技术问题是木霉菌生物农药的稳定性，使木霉菌生物农药可以长期贮藏，稳定发挥功效。
具体实施方案
本发明根据下述实例做进一步的描述，本领域技术人员知道，下述实施例对本发明仅仅起到说明的作用。在不背离本发明精神的前提下，对本发明所做的任意改进和替代均在本发明保护的范围内。
实施方案一
取木霉菌孢子在PDA培养基上培养。木霉菌菌种为绿色木霉(Trichodermaviride)，哈茨木霉(Trichoderma haziamum)，康氏木霉(Trichoderma konigii)和黄绿木霉(Trichoderma auxeoviride)。
将木霉菌菌种在培养基上培养菌种：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂18-20g，水1000mL，pH自然，121℃灭菌20min后，接种，在28℃下培养6天，产生大量绿色分生孢子。
液体发酵培养：以可溶性淀粉，碳酸钙，麦麸，硫酸铵和磷酸二氢钾按表一配制比例组合，另加大豆油4.0mL，pH自然，水1000mL制成液体培养基，121℃灭菌20min。用接种环将木霉菌分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝后，将孢子浓度调节至107cfu/mL，按照1％的接种量接种到液体发酵培养基中，在28℃、150r/min培养7天。
表一：不同营养组合对木霉菌厚垣孢子数量的影响
利用Minitab软件对不同营养成分的影响重要性进行回归分析，结果见表二。
表二：营养成分对木霉菌厚垣孢子数量的影响重要性分析
利用Minitab软件对表中试验数据进行回归分析，对厚垣孢子数量影响较明显的因素(Pr＜0.48)有麦麸、可溶性淀粉和CaCO3。进一步采用最陡爬坡实验对不同营养组合的影响重要性进行分析，得到表三。
表三：不同营养成分对木霉菌厚垣孢子数量的影响最陡爬坡实验分析
通过表三分析得到的组合在可溶性淀粉为20g/L，CaCO3为1.5g/L，麦麸为5.5g/L时，组合的液体培养基生产的厚垣孢子数量最多。据此制定的木霉菌厚垣孢子液体培养基配方特征优选的组合为：可溶性淀粉20g/L，碳酸钙1.5g/L，麦麸5.5g/L，硫酸铵为3g/L，磷酸二氢钾为2g/L，大豆油4.0mL，发酵培养120小时获得的发酵液厚垣孢子含量达到3.1×107cfu/mL。
实施方案二：水分散粒剂的制备
将实施案例一培养制备的木霉发酵液(含厚垣孢子数量3.27×107cfu/mL)与白炭黑按照10∶1的比例混合制成母液，在37℃下干燥制成母粉，向母粉中按表四组合比例加入活体微生物保护剂、崩解剂和粘接剂混合均匀，然后通过挤压造粒制得水分散粒剂。
表四水分散粒剂组合成分优化结果表
虽然制剂的有效成分是处于休眠状态的厚垣孢子，其对环境条件有较强抗性，但其存活率仍然会受环境中的紫外线和温度的影响。加工的水分散粒剂中需要加入粘结剂提高成粒率，粘结剂的作用是增加颗粒的强度，同时降低颗粒的脆性，使得制剂在包装、运输等过程中不易破碎。但颗粒的强度与崩解性成反比。因此，需要在配方中加入的粘结剂的种类和用量要有一个平衡点，在满足制剂崩解性的同时，尽可能使颗粒有较大的强度。崩解剂的作用是加快水分散粒剂在水中的崩解，衡量崩解剂崩解性能的指标是崩解时间，时间越短，性能越好。
所以在确定载体、润湿分散剂、粘结剂和崩解剂的基础上，采用正交试验设计法来优化分散剂、粘结剂、崩解剂的用量，以崩解时间和悬浮率为评价指标优选水分散粒剂的成分组合。根据本发明的试验结果，优选羧甲基纤维素含量0.8％，羧甲基纤维素钠含量5％，淀粉6％和可溶性淀粉5％制成的木霉菌水分散粒剂的颗粒强度高，崩解时间短，抗紫外和高温的能力强。
实施方案三
将分离纯化的哈茨木霉菌孢子，在PDA培养基上28℃下培养6天，产生大量绿色分生孢子。
以可溶性淀粉20g，碳酸钙1.5g，麦麸5.5g，硫酸铵3.0g和磷酸二氢钾2.0g的比例组合，另加大豆油4.0mL，pH自然，水1000mL制成液体培养基，121℃灭菌20min。用接种环将木霉菌分生孢子转移到含无菌水的试管中，搅拌使分生孢子从菌丝上分散下来，用无菌纱布过滤除去菌丝后，将孢子浓度调节至107cfu/mL，按照1％的接种量接种到液体发酵培养基中，在28℃培养6天。
将生产获得的含木霉菌厚垣孢子8.5×107cfu/mL发酵液与10％白炭黑混合吸附后，在37℃下干燥制成母粉，向母粉中按比例加入羧甲基纤维素0.8％，羧甲基纤维素钠5％，淀粉6％和可溶性淀粉5％，混合均匀，然后通过挤压造粒制得水分散粒剂。
按照《中华人民共和国国家标准》对木霉菌厚垣孢子水分散粒剂进行测定，pH测定GB/T 1603-1993，润湿时间测定GB/T 5451-2001，悬浮率测定GB/T14825-2006，分散性、崩解时间和含水率测定GB/T1600-2001，加速贮存试验GB/T 19136/2003。
结果显示制备的木霉菌厚垣孢子水分散粒剂含厚垣孢子量为1.5×108cfu/mL，pH6.50，含水率4.1％，悬浮率43.8％，崩解时间51秒，颗粒强度强。
实施方案四
取实施方案三生产的哈茨木霉菌厚垣孢子水分散粒剂(含厚垣孢子量1.5×108cfu/mL)用于防治草莓灰霉病试验。以草莓章姬作供试品种。草莓苗种于大棚温室中，以灰霉病菌孢子悬浮液接种草莓果实，调查初期发病率后，以木霉菌厚垣孢子水分散粒剂按三个浓度稀释作为处理，化学农药凯润处理和清水对照，每处理50株，重复4次。试验共设为5个处理：处理1：木霉菌厚垣孢子水分散粒剂稀释300倍药液；处理2：木霉菌厚垣孢子水分散粒剂稀释500倍药液；处理3：木霉菌厚垣孢子水分散粒剂稀释800倍药液；处理4：25％凯润稀释1500倍；处理5：清水对照。间隔5天喷药一次，使用三次后调查发病率。结果如表五，对照果实发病严重，化学农药可以有效抑制灰霉病侵染，木霉菌厚垣孢子水分散粒剂稀释500倍即可有效控制病菌危害，稀释300倍的防治效果比化学农药更好。
表五木霉菌厚垣孢子水分散粒剂防治草莓灰霉病的效果
| 处理 | 发病率％ |
| 处理1水分散粒剂800倍 | 27.00b1 |
| 处理2水分散粒剂500倍 | 10.00a |
| 处理3水分散粒剂300倍 | 7.50a |
| 处理425％凯润1500倍 | 9.00a |
| 处理5清水对照 | 79.00c |
注1：试验按随机取组设计，4次重复，每重复50株，表中各列数据跟随的不同字母表示处理间在5％水平上的显著差异。
Claims (2)
1.木霉菌厚垣孢子生物农药水分散粒剂，其特征在于：以液体培养基发酵培养的木霉菌厚垣孢子作为有效成分，加入吸附剂为载体，与微生物菌体保护剂、粘结剂和崩解助剂组合制成的生物农药水分散粒剂；
其中，所述水分散粒剂的组合为：木霉菌厚垣孢子的含量为108cfu/ml，白炭黑的含量为5-70％，羧甲基纤维素的含量为0.1-10％，羧甲基纤维素钠的含量为0.1-10％，淀粉的含量为1-30％，可溶性淀粉的含量为1-50％；
其中，所述木霉菌厚垣孢子液体培养基配方为：可溶性淀粉20g/L，碳酸钙1.5g/L，麦麸5.5g/L，大豆油4.0mL/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾2g/L。
2.根据权利要求1所述的木霉菌厚垣孢子生物农药水分散粒剂，其特征在于：所述水分散粒剂pH为3.5-7.5，含水率1.5-5.1％，悬浮率35-50％，崩解时间30-60秒。
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