CN102144642B

CN102144642B - 一种木霉滴丸剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN102144642B
Application number: CN 201010599527
Authority: CN
Inventors: 方羽生; 张颂声; 周俐; 钟平生; 詹玉海; 李小妮; 高永峰; 陈树华; 蒋刚彪; 李静美
Original assignee: GUANGDONG VEGETATION PROTECTION CENTRAL STATION; Huizhou Nantian Biological Science and Technology Co Ltd; South China Agricultural University
Current assignee: GUANGDONG VEGETATION PROTECTION CENTRAL STATION; Huizhou Nantian Biological Science and Technology Co Ltd; South China Agricultural University
Priority date: 2010-12-20
Filing date: 2010-12-20
Publication date: 2013-02-20
Anticipated expiration: 2030-12-20
Also published as: CN102144642A

Abstract

本发明属于微生物活性农药技术领域。本发明木霉滴丸剂包含木霉孢子悬浮液和滴丸基质，其中，木霉T1菌株孢子悬浮液是由棘孢木霉菌株T1(Trichoderma asperellum T₁，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：3531，保藏日期为2009年12月17日)的孢子粉配制，其rDNA ITS区片段序列如SEQ ID NO：1所示；本发明还含有浓度为0.5～1.5g/L孢子悬浮液的防腐剂。滴丸基质为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000和聚乙二醇4000中的一种或二种或三种的混合物。本发明木霉滴丸剂具备含药量大、生物活性高、成型效果好、能在最短时间内溶散、便于贮藏、运输和使用。

Description

一种木霉滴丸剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于微生物活性农药技术领域，具体涉及一种木霉滴丸剂及其制备方法和应用。

背景技术

木霉菌隶属于半知菌亚门，丛梗目，从梗孢科，是一类具有重要经济意义的生防益菌。木霉菌对环境的适应性强、生长速度远比病原真菌快、是土壤中植物病原真菌生存空间和营养源的有力竞争者。木霉菌能有效地利用植物表面或植物病原真菌侵入点附近低浓度营养物质迅速占领空间吸收营养使植物病原真菌无法入侵。近年来人为向土壤中引入木霉菌防治植物病害的研究较为活跃，例如用哈茨木霉、哈氏木霉和绿色木霉防治洋葱白腐病、棉花和黄瓜黄萎病、人参根腐病、茉莉白绢病、西洋参立枯病及多种作物的猝倒病和疫病，均取得较为理想的防治效果。不同种类木霉菌有不同的植物病害防治功效，但目前尚未有将木霉菌滴丸剂用于防治香蕉枯萎病的技术记载。

木霉菌分生孢子的产生对条件要求不严格，便于开发生防制剂，并且木霉对病原菌的拮抗作用以分生孢子产生的抑菌物质最为明显。木霉菌经固体发酵后可产生大量的分生孢子，目前常用的木霉分生孢子制剂有粉剂、颗粒剂等，但是这些制剂田间施用时缓释作用比较差，不能在相对长的一段时间内发挥其生防活性，且易受到环境的影响。

滴丸剂是固体分散体的成熟剂型之一，采用滴制法将固体或液体药物与基质加热熔化制备成液体分散体后，滴入到与基质不相溶的冷凝液中收缩冷凝成丸剂。滴丸剂制备工艺具有生物利用度高、能延缓释药、增加药物稳定性和掩盖药物的不良气味及刺激性、生产设备及操作简便等特点。滴丸剂主要应用于医药工业，在微生物农药领域的应用未见报道。

鉴于滴丸技术的诸多优点，将滴丸技术应用到微生物活性农药制备领域，借以解决微生物制剂在复杂的田间难以保持生物活性以及缓慢释放的难题。但滴丸制剂的载药量与滴丸成型密切相关，加工温度也必须严格控制，以防高温条件下微生物容易失去活性。到目前为止滴丸技术在微生物活性农药制备领域尚未被合理应用。

发明内容

本发明目的在于根据医药制剂加工领域比较成型的滴丸制备技术，结合微生物活体木霉分生孢子在其制备方法中存在的需要注意的问题，将滴丸技术合理用于微生物活性农药制备，提供一种易加工保存，缓释效果好的木霉滴丸剂。

本发明另一目的在于提供上述木霉滴丸剂的制备方法。

本发明还有一个目的在于提供上述木霉滴丸剂的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

一种木霉滴丸剂，包含木霉孢子悬浮液和滴丸基质，其中，木霉孢子悬浮液是棘孢木霉菌株T₁(Trichoderma asperellum，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC NO：3531，保藏日期为2009年12月17日)固体培养之后无菌水洗脱下来的孢子悬浮液，其rDNA ITS区片段序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明木霉滴丸剂是具有萌发活性的分生孢子制剂，其rDNA ITS区片段序列可以通过PCR扩增得到，扩增引物序列如SEQ ID NO：2～3所示，PCR反应体系为ddH₂O 14.8μL，10×PCR buffer(with Mg²⁺)2.5μL，dNTPs(10mM each)0.5μL上游引物(5μM)3.0μL，下游引物(5μM)3.0μL，模板DNA 1.0μL，Taq酶0.2μL。PCR反应条件为：(1)94℃，5min，热变性；(2)94℃，45s，热变性；(3)55℃，45s，退火；(4)72℃，45s，延伸；(5)72℃，10min，延伸；其中(2)、(3)、(4)是循环。

扩增出的序列如SEQ ID NO：1所示。

上述木霉滴丸剂中还含有防腐剂，防腐剂可选择水杨酸、山梨酸钾和苯甲酸钠中的一种或多种的混合，防腐剂的浓度为0.5～1.5g/升孢子悬浮液。

所述的滴丸基质为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000和聚乙二醇4000中的一种或二种或三种的混合。

所述木霉孢子悬浮液与基质的体积比为1∶10～3∶10。

本发明木霉孢子滴丸剂的制备方法包括如下步骤：

(1)将棘孢木霉菌株T₁植于PDA培养基上使其复苏，再采用酵母膏蔗糖培养基进行菌种继代培养，待长出直径为5～7mm的深绿色菌落后，将菌落接种，在酵母膏蔗糖培养基和麸皮木屑培养物中进行扩大培养，直至长出白色菌丝或绿色孢子；

(2)将白色菌丝或绿色孢子制成孢子悬浮液，过滤沉淀为浓缩孢子液；

(3)向浓缩孢子悬浮液中添加防腐剂，溶解搅拌均匀，即得木霉滴丸剂原药；

(4)将滴丸基质预热至熔化状态；注入冷凝剂至滴丸机中并设置温度进行预冷；

(5)将木霉滴丸原药迅速加入预热的滴丸基质中，然后将混合液加入滴丸机的储液罐中，打开搅拌器，待储液罐的油浴温度稳定后，调整滴距打开滴头开始滴丸，即得木霉滴丸剂。

上述制备方法中，所述酵母膏蔗糖培养基为高温灭菌过的培养基，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min，酵母膏蔗糖培养基的配方为：酵母膏15g，蔗糖20g，KH₂PO₄1g，麦芽膏15g，硫酸钠2g，氯化钾0.5g，维生素B 0.5mg，维生素C 0.5mg，七水合硫酸镁0.05g，硫酸铁0.01g，琼脂20g，水1L。

步骤(1)中所述菌种继代培养的温度为30℃，湿度为70～85％，培养时间为48～72h；所述扩大培养的温度为30℃，湿度为70～85％，培养时间为5～7d。

所述麸皮木屑培养物是麸皮、木屑、蔗糖、维生素B和水的混合物，其中，麸皮、木屑、蔗糖三者的质量比为2∶1∶0.02；维生素B用量为每千克麸皮木屑培养物中加入0.5mg，每瓶装瓶量为15g；每瓶加水量5ml；防腐剂为水杨酸、山梨酸钾和苯甲酸钠中的一种或多种的混合，用量为0.5～1.5g/L孢子悬浮液；用于酵母膏蔗糖培养基和麸皮木屑培养物灭菌的温度为121℃，灭菌时间为30min。

步骤(4)所述木霉滴丸的基质为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000和聚乙二醇4000中的一种或二种或三种的混合；原药与熔化的基质按照体积质量比1∶10～3∶10混合；冷凝剂可选择液体石蜡或二甲基硅油或植物油，冷凝温度为0℃；步骤(5)中药液的油浴温度为53～57℃，搅拌速度为20～300转/分钟，滴距为24cm。

上述木霉滴丸剂用于防治香蕉枯萎病。

木霉菌对环境的适应性强且生长速度远比病原真菌快，能对病原真菌产生营养或空间的竞争，能有效利用植物表面的病原真菌侵入点附近的低浓度营养物质迅速生长占领空间消耗掉营养物质，从而抑制了病原真菌的生长和对寄主植物的入侵，达到对植物病害的防治效果。

本发明木霉滴丸剂作为微生物活性农药，不仅能有效防治香蕉枯萎病，还因为棘孢木霉菌株T₁具有广谱性拮抗能力，因此本发明木霉滴丸剂能拮抗多种病原真菌，防治其他多种植物病害。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用棘孢木霉菌株T₁作为生产菌株，其孢子粉生存能力强，适应性广，具有广谱性拮抗能力，除了能对香蕉枯萎病起到有效防治，还能够拮抗多种病原真菌，尤其对土传真菌有显著的拮抗效果。

(2)本发明将滴丸技术合理用于微生物活性农药木霉滴丸剂的制备中，解决了田间复杂条件下难以保持微生物活性以及缓释性的技术难题，使得微生物滴丸剂可以在保持高活性的前提下缓慢释放，逐步发挥其生防效果，制备工艺简单易行，采用的设备简单，易于推广。

(3)本发明木霉滴丸剂木霉孢子成型效果好，生物活性高，易于贮藏，便于施用。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

实施例1

一种木霉滴丸剂，含有木霉孢子悬浮液、防腐剂和滴丸基质，其中，木霉孢子悬浮液是由棘孢木霉菌株T₁(Trichoderma asperellum T₁，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：3531)的孢子粉制备，其rDNA ITS区片段序列如SEQ ID NO：1所示；防腐剂为水杨酸，浓度为1g/L孢子悬浮液；基质选择质量比为1∶1的PET2000 和PET4000的混合物，原药(即木霉孢子悬浮液和水杨酸)与基质的质量比1∶10。

本实施例木霉滴丸剂的制备方法如下：

1.菌株的复苏和扩大培养

(1)将冷藏的棘孢木霉菌株T₁(Trichoderma asperellum T₁)植于PDA培养基上使其复苏；

(2)采用酵母膏蔗糖培养基，并设定培养温度为30℃、湿度为80％，对经过步骤(1)复苏后的菌株采用平板进行菌种继代培养48h，直至长出直径约为5mm的深绿色菌落；

(3)将由步骤(2)平板继代培养成的菌落用无菌水洗下，接种于装有经高温灭菌的由麸皮、木屑、蔗糖、维生素B和水组成的培养料的茄形瓶中进行孢子扩大培养，设定培养温度为30℃、湿度为70％，培养时间为5d，每天翻动拍打茄形瓶，至培养物上长出白色菌丝并在其上长出绿色孢子。

2.原药制备

用无菌水将茄形瓶中的菌丝和孢子洗下制成孢子悬浮液，再将孢子悬浮液经过滤处理后沉淀为浓缩孢子液，添加浓度为1g/L孢子悬浮液的水杨酸，制成木霉滴丸剂原药。

3.滴丸剂制备

将木霉滴丸原药，迅速加入预热的滴丸基质中。然后将混合液加入滴丸机的储液罐中。打开搅拌器，待储液罐的油浴温度稳定后，调整滴距打开滴头，开始滴丸。基质选择质量比为1∶1的聚乙二醇(PET)2000和聚乙二醇(PET)4000的混合物，原药与熔化的基质按照体积质量比1∶10混合。冷凝剂为液体石蜡，冷凝温度为0℃。药液的油浴温度为55℃，搅拌速度为100转/分钟，滴距为24cm。

其中酵母膏蔗糖培养基的主要配方：酵母膏15g，蔗糖20g，KH₂PO₄1g，麦芽膏15g，硫酸钠2g，氯化钾0.5g，维生素B0.5mg，维生素C0.5mg，七水合硫酸镁0.05g，硫酸铁0.01g，琼脂20g，水1000ml。麸皮木屑培养料的每瓶装瓶量为15g，每瓶加水量5ml，其中麸皮、木屑、蔗糖干重比为2∶1∶0.02，维生素B用量为每千克麸皮木屑培养物中含0.5mg。防腐剂为水杨酸，含量为1g/L孢子悬浮液。用于酵母膏蔗糖培养基和麸皮木屑培养物灭菌的温度为121℃，灭菌时间为30min。

实施例2

以下进一步说明基质、药液含量、药液温度等参数的变化对木霉滴丸剂制备的影响。

以滴制的难易、成丸效果为指标对滴丸的基质的选择和药液含量做单因素分析，制备过程中变化药液温度、药液含量、基质测得不同药液温度、药液含量、基质对所制备滴丸的影响，从而对比并选择利于保证滴丸成型良好、具有一定生防活性的基质和药液含量。

从水溶性滴丸基质聚乙烯二醇中选择熔点低成丸效果好的基质，设定1∶10、2∶10、3∶10、 4∶10等四个药液基质配比，测定各比例所制备的滴丸难易和成丸情况。测得结果如表1、表2：

表1木霉滴丸基质的选择

(--很软 -软 +稍硬 ++硬)

结果发现聚乙二醇1000熔点低，虽然在滴制过程中对木霉孢子的高温损伤低，但是其硬度小、不耐高温，不宜贮存。聚乙二醇2000、聚乙二醇4000熔点虽然都超过了50℃，但成丸效果好。

为降低基质熔点的同时提高成丸效果，采用混合基质。结果显示聚乙二醇1000+聚乙二醇2000(1∶3)耐热性差，高温天气容易黏粘，不易贮存。而聚乙二醇1000+聚乙二醇4000(1∶1)、聚乙二醇2000+聚乙二醇4000(1∶1)效果较好。

表2不同基质与药液比对滴制和成丸的影响

(注：-滴制难，难以成丸；+刚可滴制，能成丸；++能滴制，

成丸效果一般；+++易滴制，成丸饱满。)

结果显示，药液比例越小，滴制就越容易，滴丸的成丸效果越好。反之，药液含量大，会降低基质的内聚力，滴制就越困难，成丸效果就越差。滴丸制剂在加工中的成型性与载药量相矛盾，因此需要多因素综合研究找到一个平衡点来优化加工工艺。

在滴制过程中，药液与基质含量在3∶10时，虽然可以成型，但丸剂易粘结在一起，很容易堵塞滴丸机。而药液与基质含量达到4∶10时，液滴直接融入冷凝液中，无法成丸。因此药液与基质含量要低于3∶10。

实施例3

以基质(A)、原药与基质配比(B)、药液温度(C)为三个影响因素设计L9(3³)正交试验，以滴丸成型率、生物活性作为考察指标，选择合适的制备工艺。如表3、表4所示：

表3木霉滴丸剂配方优化正交试验因素水平表

根据正交试验设计，设定滴丸机工作参数，以液体石蜡作为冷凝剂进行实验，采用热熔法将不同基质熔融后与木霉孢子液混合均匀，加入滴丸机进行滴制，得到9种制备工艺的木霉滴丸，分别进行各个指标的检测和评分。其中重量差异检测、溶散时限检查按照《中国药典》方法进行，有效成分、孢子存活率检测采用稀释平板法。根据木霉滴丸制剂销售和使用的不同需求，将上述指标分为两类：一类是成丸效果，包括包括丸重、丸重差异、圆整度差异3个指标，将权重系数定为4∶3∶3，得到成型效果综合评分。另一类指标是生物活性指标，即滴丸的有效成分含量、有效成分在滴制过程中的损失率以及与施药时的溶散时限，其中包括药剂的木霉孢子含量、滴制前后木霉孢子的存活率、溶散时限3个指标，将权重系数定为4∶5∶1，得到生物活性综合得分。结果见表4。

表4木霉滴丸制备工艺正交试验各检测指标检测值及其得分情况

以各指标的分类和权重系数，计算出9种木霉滴丸制备工艺的成型效果和生物活性综合得分。通过直观分析结果见表5。正交试验中基质配比(A)、药液与基质配比(B)、滴制温度(C)的三个因素，对滴丸制剂的成型效果和生物活性的影响有所不同。

表5木霉滴丸制备工艺各组合正交试验综合评分结果

所测试的三个因素对木霉滴丸制剂的成型效果的影响大小为B＞A＞C。在试验范围内，最佳的成型效果组合是A3B2C2，即木霉原药与聚乙二醇2000+聚乙二醇4000(1∶1)体积质量比为2∶10，药液温度为55℃时，制得的木霉滴丸在丸重最大、丸重差异最小、圆整度最好。

这三个因素对木霉滴丸制剂的生物活性影响大小为B＞C＞A。最佳生物活性效果组合是A3B1C2，即木霉原药与聚乙二醇2000+聚乙二醇4000(1∶1)体积质量比为1∶10，药液温度为55℃时，制得的木霉滴丸含药量大、存活率高，在最短时间内溶散。

上述仅为本发明优选实施例，这些实施例仅仅用于解释本发明而不能理解为对本发明的限制，在不背离本发明权利要求中所请求保护的范围的情况下，可以对上述实施方案进行各种改进和变化。

Claims

1.一种木霉滴丸剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将棘孢木霉菌株T₁植于PDA培养基上使其复苏，再采用酵母膏蔗糖培养基进行菌种继代培养，待长出直径为5~7mm的深绿色菌落后，将菌落接种，在酵母膏蔗糖培养基和麸皮木屑培养物中进行扩大培养，直至长出白色菌丝或绿色孢子；

（2）将白色菌丝或绿色孢子制成孢子悬浮液，过滤沉淀为浓缩孢子液；

（3）向浓缩孢子悬浮液中添加防腐剂，溶解搅拌均匀，即得木霉滴丸剂原药；

（4）将滴丸基质预热至熔化状态；注入冷凝剂至滴丸机中并设置温度进行预冷；

（5）将木霉滴丸原药加入预热的滴丸基质中，用滴丸机进行滴丸，即得木霉滴丸剂；

所述木霉孢子悬浮液是由棘孢木霉菌株T₁（Trichoderma asperellum T₁，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO:3531，保藏日期为2009年12月17日）的孢子粉制备，其rDNA ITS区片段序列如SEQ ID NO:1所示。

2. 根据权利要求1所述一种木霉滴丸剂的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述酵母膏蔗糖培养基为高温灭菌过的培养基，灭菌温度为121℃，灭菌时间为30min，酵母膏蔗糖培养基的配方为：酵母膏15g，蔗糖20g，KH₂PO₄1g，麦芽膏15g，硫酸钠2g，氯化钾0.5g，维生素B 0.5mg，维生素C 0.5mg，七水合硫酸镁0.05g，硫酸铁0.01g，琼脂20g，水1L。

3. 根据权利要求2所述一种木霉滴丸剂的制备方法，其特征在于步骤（1）中所述菌种继代培养的温度为30℃，湿度为70~85%，培养时间为48~72h；所述扩大培养的温度为30℃，湿度为70~85%，培养时间为5~7d。

4. 根据权利要求3所述一种木霉滴丸剂的制备方法，其特征在于：所述麸皮木屑培养物是麸皮、木屑、蔗糖、维生素B和水的混合物，其中，麸皮、木屑、蔗糖三者的质量比为2：1：0.02；维生素B用量为每千克麸皮木屑培养物中加入0.5mg，每瓶装瓶量为15g；每瓶加水量5ml；防腐剂为水杨酸、山梨酸钾和苯甲酸钠中的一种或多种的混合，用量为0.5~1.5g/L孢子悬浮液；用于酵母膏蔗糖培养基和麸皮木屑培养物灭菌的温度为121℃，灭菌时间为30min。

5. 根据权利要求4所述一种木霉滴丸剂的制备方法，其特征在于：步骤（4）所述木霉滴丸的基质为聚乙二醇1000、聚乙二醇2000和聚乙二醇4000中的一种或多种的混合；原药与熔化的基质按照体积质量比1：10～3：10混合；冷凝剂可选择液体石蜡或二甲基硅油或植物油；冷凝温度为0℃；步骤（5）中药液的油浴温度为55℃，搅拌速度为20~300转/分钟，滴距为24cm。