CN104130957B

CN104130957B - 一种分散泛菌及其应用

Info

Publication number: CN104130957B
Application number: CN201410326808.9A
Authority: CN
Inventors: 陈晏; 樊剑波; 孙波; 何园球; 陈葵
Original assignee: Institute of Soil Science of CAS
Current assignee: Institute of Soil Science of CAS
Priority date: 2014-07-04
Filing date: 2014-07-09
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-07-09
Also published as: CN104130957A

Abstract

一种分散泛菌及其应用，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年06月18日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 9359。本发明采用灭菌秸秆或其他适合作为碳源和氮源的农业废弃物，通过固体发酵得到固体剂型的微生物菌剂，可直接施入土壤。实验结果表明，该菌剂在红壤地可显著提高花生、木薯等作物对磷素的吸收，改善植物生长状况，增加产量。

Description

一种分散泛菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物及其应用，具体涉及一种分散泛菌及其应用。

背景技术

我国红壤主要分布在热带和亚热带地区，总面积达218万km²，占全国土地面积的21.8％，耕地面积约占全国总面积的28％。然而由于该地区土壤肥力特别是磷退化严重，导致作物生长缓慢，生产力下降。尽管红壤中总磷含量丰富，但因其易被金属盐固定及淋溶，导致可被作物吸收的有效磷含量处于极低水平(<0.1)。因此，磷素的匮乏成为限制红壤地区作物生长的关键因素之一。尽管过去化学磷肥的施用在一定程度上提高了该地区土壤有效磷的含量。然而，化学磷肥施入土壤后当季作物一般只能利用15％左右，85％左右的磷肥被固定在土壤中并逐步老化而失去有效性，即便是下季作物也很难利用。另一方面，基于其实际利用率低，对水体环境也存在污染风险，不利于农业的可持续发展。因此，发明一种针对红壤磷素组分特征，可高效溶解红壤难溶磷的微生物菌剂，提高土壤有效磷含量，是优化我国红壤磷素和磷肥管理的重要途径。

过去的研究表明，部分分离自土壤中的溶磷菌在盐碱地条件下具有溶磷的潜力。其主要作用方式有两种：1)溶解无机磷:通过菌体的代谢活动产生多种有机酸(如柠檬酸、琥珀酸、草酸等)，伴随着pH的降低，有机酸通过螯合作用，置换释放出活性磷，从而将土壤中固定的磷转变为活性无机磷；2)溶解有机磷：通过微生物分泌磷酸酶将土壤中对植物无效的有机磷分解成能被植物吸收的无机磷。然而，目前这类微生物的筛选主要集中于盐碱地区域，所获得的菌株往往在当地施用良好，但一旦实践施加入酸性红壤中，其效果明显降低。其主要原因是土壤pH、化学特性等环境因子的改变限制了这类微生物功能的发挥。

近年来，研究发现植物内生菌作为一种新型微生物资源，其生态功能多样且具有巨大的应用潜力。有报道表明，以植物内生菌拟茎点霉等菌株制成的微生物菌剂，具有高效分解有机质，并克服药用植物种植过程中土传病害的能力。然而，有关将特殊植物中分离出具有在红壤条件下溶解磷素的内生菌，并制成菌剂的研究目前国内尚未有报道。

发明内容

解决的技术问题：中国南方红壤因土壤活性磷被长期结合无法释放，而导致磷素的极度匮乏影响该地区作物的生长。本发明提供一种分散泛菌及其应用，从而缓解红壤地区因磷素缺乏的短板效应，促进当地作物的生长。目前主要采用的施加化学磷肥的方法，尽管在短期内使红壤磷素供应有所提高，然而基于其实际利用率低，土壤淋溶流失率高，不利于环境的发展。本产品的发明将极大改善以上问题。本产品相比较其他同类产品，其制备工艺简单，可大量生产。其易储存，易运输，易施用等特点，可大大降低红壤作物磷肥施用成本。同时本产品可消化大量秸秆，减少秸秆焚烧带来的空气污染，增加农民秸秆销售的收入。

技术方案：一种分散泛菌(Pantoea dispersa)，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年06月18日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.9359。

上述分散泛菌(Pantoea dispersa)在溶解红壤中难溶性磷中的应用。

红壤溶磷菌剂，有效成分为分散泛菌(Pantoea dispersa)CGMCC No.9359。

红壤溶磷菌剂的生产方法，步骤为：1)将分散泛菌(Pantoea dispersa)CGMCCNo.9359接种于LB固体斜面培养基，30℃静置培养2天，进行活化；2)培养好的活化菌株，在无菌操作条件下，将所得的斜面培养基上倒上无菌水，震荡30s，将悬液转移至改良的NBRIP液体培养基：10g/L葡萄糖，2.5g/L Ca₃(PO₄)₂，1g/L AlPO₄，1.5g/L FePO₄，5g/L MgCl₂，0.25g/L MgSO₄·7H₂O，0.2g/L KCl，1g/L(NH₄)₂SO₄；pH6.8-8.0，30℃，160rpm摇床培养3天，进一步扩繁；3)在无菌环境下，将所得的扩繁菌液与灭菌黄豆粉和花生秸秆混合物按1:20质量比例搅拌混合填罐，罐高20-30cm，白天30℃，晚上20℃变温好氧固体发酵5天；其中黄豆粉与花生秸秆的质量比为1:10；4)灭菌的花生秸秆1吨，加5kg改良的NBRIP液体培养基，与20kg发酵产物混匀，加入上述混合物30wt.％-40wt.％的水分，分装入袋，白天30℃，晚上20℃变温好氧固体发酵5天；5)成品菌剂中有效菌株的含量不低于10⁸个/kg。

上述菌种pH生长范围6.5～8.0，培养温度范围20～35℃。

有益效果：实验表明，该菌株在代谢生长过程中不仅产生柠檬酸，琥珀酸，草酸，并可分泌出水杨酸，苯乙酸等特殊有机酸，可有效地与磷酸铝，磷酸铁等红壤典型难溶磷组分结合，而释放出活性磷。申请人将菌株制成液体菌剂形式，施加入长期不施磷肥的红壤中，发现红壤中活性磷在25天，增至1.35mg kg^-1干土，含量是不施菌剂对照的土壤的4.2倍。随即，在确定该菌株高效溶磷机理之后，申请人确定菌剂剂型为固体，将其施用于红壤花生，木薯等实验地使用，证明其溶磷效果及对作物增产事实。实验证明该菌株对红壤农田溶磷效果显著，对花生，木薯等作物无害，并能提高花生，木薯等作物产量。

本发明针对酸性红壤地区土壤总磷储备量高，但活性磷匮乏导致地区作物生长缓慢的问题，采用灭菌秸秆(或其他适合作为碳源和氮源的农业废弃物)，通过固体发酵得到固体剂型的微生物菌剂，可直接施入土壤。我们的实验结果表明，该菌剂在红壤地可显著提高花生、木薯等作物对磷素的吸收，改善植物生长状况，增加产量。

本菌剂的生产不受环境的影响，原料来源丰富，原料成本很低，生产工艺简便，生产周期短，前期资产投入少，生产过程中耗电耗水极少，因此产品价位低而针对性强，企业每生产1吨含解磷细菌的微生物菌剂，其所有成本不超过600元，而象这种特效专用的微生物菌剂市场价格较高，一般在1000元/吨左右，而且目前市场上非常紧缺，因此本产品具有强大的社会、环境和经济生命力。农民施用该微生物有机肥料的投入成本为100元，而施用上述化学肥料的投入成本为120元。不仅如此，通过施用本发明的微生物产品后，所生产的农产品品质和风味有较大提高，生态环境和土壤质量有很大改善。

附图说明

图1为分散泛菌(Pantoea dispersa)cav.cy1在固体培养条件下的生长特征图(a：菌株cav.cy1在LB固体培养基上菌落特征图；b：菌株在NBRIP固体培养基上菌落特征图；c：菌株经革兰氏染色后显微状态图)；菌株cav.cy1在LB培养基上生长良好，36℃培养24h后，即可形成明显菌落，菌落直径约2.6mm。菌落呈圆形，不透明，边缘整齐，表面光滑湿润，长时间培养可产生黄色素。在NBRIP固体培养基上，菌株cav.cy1同样生长良好，36℃培养24h后，可形成平均直径为2.8mm的菌落，且在菌落周围可清晰看到平均宽度为1.6mm的溶磷圈。菌株经过革兰氏染色后在10*100倍放大的显微镜下观察细胞成椭圆状，革兰氏阴性细菌，无芽孢。

图2为分散泛菌(Pantoea dispersa)cav.cy1分子系统发生树的构建图；通过16SrRNA分子鉴定，采用Mega5的Neighbor-joining方法建立cav.cy1菌株的系统发生树。该菌株隶属于泛菌属的分散泛菌。这类菌广泛与植物共生，黄静等(2010)在油菜、玉米等植物中分离出与之同属的相似微生物。然而有关泛菌属类菌在土壤中的溶磷生态功能，目前国内外还尚未有相关报道。

图3为分散泛菌(Pantoea dispersa)cav.cy1在纯培养条件下对不同难溶磷的溶解动态图；Ca-P、Al-P和Fe-P培养基中可溶性磷的含量从培养的第一天起逐步提高，且溶解量顺序依次为Ca-P＞Fe-P＞Al-P。在Fe-P处理中，菌株cav.cy1在培养的第2天，培养基中可溶性磷含量达到最大为41.42mg L^-1；而在Ca-P处理中，菌株培养至第3天，培养基中可溶性磷含量达到峰值55.75mg L^-1，高出对照5.31倍。在Al-P处理中，培养基中可溶性磷则在培养1天后便趋于稳定，维持在41.42mg L^-1数值间波动。

图4为分散泛菌(Pantoea dispersa)cav.cy1对不同难溶性磷溶解过程中pH值的动态变化示意图；伴随着菌株cav.cy1对难溶性磷源的矿化，液体培养基中pH值有明显降低的趋势(图4)。在所有无机难溶磷液体培养基中，菌株cav.cy1在培养5天后，培养基的pH值由最初的7.0降低至4.50以下，说明所有基质被酸化。特别是在Al-P培养处理中，其pH在5天后低于3.77。

图5为分散泛菌(Pantoea dispersa)cav.cy1施加于红壤中对土壤磷素的溶解变化示意图；将菌株cav.cy1作为菌剂施加入灭菌和未灭菌红壤中，土壤可溶性磷含量变化如图5所示。在灭菌土壤处理中添加菌剂，使土壤中可溶性磷在整个培养阶段都高于对照和未灭菌土壤处理。在培养5天后，与对照相比较，未灭菌土壤中施加菌剂可将土壤可溶性磷提高至0.98mg kg^-1，高于对照处理中可溶性磷含量的2.1倍。尽管在培养5天以后，未灭菌土壤处理中可溶性磷含量有所下降至0.62-0.66mg kg^-1之间，但仍高于对照处理含量的95.82％。

具体实施方式

在本发明中所适用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并按照数据进一步详细地描述本发明。应理解这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何形式限制本发明的范围。

改良的NBRIP液体培养基为：10g/L葡萄糖，2.5g/L Ca₃(PO₄)₂，1g/L AlPO₄，1.5g/LFePO₄，5g/L MgCl₂，0.25g/L MgSO₄·7H₂O，0.2g/L KCl，1g/L(NH₄)₂SO₄。

实施例1：

分散泛菌(Pantoea dispersa)cav.cy1CGMCC No.9359分离自种植于红壤生态实验站的木薯(Manihot esculenta Crantz)根部组织。具体方法为：随机选取木薯根部，用去离子水冲洗干净表面。将组织切成10mm×5mm小块。在无菌操作环境下，将组织小块浸于75vt.％的乙醇中浸泡1分钟，随即小块转移至5wt.％次氯酸钠溶液中浸泡10分钟使组织表面灭菌彻底。取出灭菌后的小块，用无菌水冲洗8遍。为确认组织表面灭菌是否彻底，将组织小块的每一面都在灭菌的LB固体培养基平板上碰靠两次后，再转移至改良的NBRIP固体培养基中，37℃静置培养5天。待培养基上出现菌斑时，用灭菌的牙签小心挑取菌斑，并在改良的(Ca-P、Al-P、Fe-P)NBRIP固体培养基上划线静置培养5天。在单一添加Ca-P、Al-P、Fe-P的NBRIP培养基均能生长出来的菌落，采用细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA，使用27F和1492R通用引物进行PCR扩增。扩增体系为50μL反应体系，包含5μL10×PCR buffer(无Mg²⁺)，3μL25mM的MgCl₂，1μL10mM的dNTPs，各1μL50mM的上下游引物27F(5’-AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG-3’)和1492R(5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’)，1μL细菌DNA模版(10–15ng)，以及0.5μL Taq聚合酶(5UμL^-1).PCR扩增条件为94℃预变性4min。之后进入30个循环，每个循环包含94℃变性40s，59℃退火40s，72℃延伸50s。30个循环后，PCR在72℃延伸10min完成反应后，10℃保温。PCR产物经过1.0％(w:v，g/mL)琼脂糖电泳确认后，送至英骏生物公司(Carlsbad,CA,USA)进行测序。测序获得的序列长度为970bp，通过GeneBank中BLAST比对后，通过建立系统发生树，鉴定出菌株属于泛菌属分散泛菌(图2)。分离的菌株被转移至LB斜面培养基中，4℃保存备用。

将接种于LB斜面培养基的菌株接种于以5g L^-1Ca₃(PO₄)₂(Ca-P)、3.93g L^-1AlPO₄(Al-P)和4.86g L^-1FePO₄(Fe-P)为磷源的NBRIP固体培养基36℃静置培养5天，同时将菌株接种于同浓度Ca-P、Al-P和Fe-P为磷源的NBRIP液体培养基36℃，160rpm振荡培养5天。检测菌株在固体培养基中的菌落生长直径及在液体培养基中对难溶性磷的溶解能力，如表2。

表2:分散泛菌cav.cy1溶磷特性分析

分散泛菌(Pantoea dispersa)cav.cy1CGMCC No.9359在三种不同难溶性磷培养基上均能良好生长。在固体培养基上，菌落直径大小依次为Ca-P＞Al-P＞Fe-P，然而在液体培养基中，由于菌体与养分接触更为充分，菌体对磷素的溶解量大小顺序为Ca-P＞Fe-P＞Al-P。与过去的研究相比，尽管黄静等(2010)及Anzuay等(2013)筛选出了Pseudomonasspp.,Bacillus spp.,Burkholderia spp.等细菌菌株对Ca-P类难溶磷有较高的溶解能力，但有关菌株同时对除Ca-P以外的其他难溶性无机磷，特别是红壤区土壤所富含的Fe-P和Al-P的溶解能力，目前尚未有发现。

参考文献：

1.黄静，盛下放，何琳燕(2010)具溶磷能力的植物内生促生细菌的分离筛选及其生物多样性。微生物学报，50(6)：710-716。

2.Anzuay,M.S,Frola,O.,Angelini,J.G.,Luduena,L.M.,Fabra,A.,Taurian,T.(2013)Genetic diversity of phosphate-solubilizing peanut(Arachis hypogaea L.)associated bacteria and mechanisms involved in this ability.Symbiosis60,143-154.

实施例2：

将分散泛菌(Pantoea dispersa)cav.cy1CGMCC No.9359的菌种从4℃冰箱取出，接种于LB固体斜面培养基，36℃培养2天，进行活化。无菌条件下，倒入无菌水，震荡30s后，将菌悬液转移至改良的NBRIP液体培养基中，pH6.8-8.0，30℃，160rpm摇床培养扩繁3天。发酵好的菌剂通过盆栽实验，以每10kg红壤施加400mL稀释的菌剂(10⁷CFUs mL^-1)培养25天，添加菌剂组红壤中可溶性磷含量是对照处理组的2.1倍(图3)。用高压锅对黄豆粉和花生秸秆(质量比1:10)混合物进行高温灭菌，在无菌环境下填罐。将扩繁好的菌剂其菌液量按填罐量质量的5％比例接种，搅拌混匀后，白天30℃，夜间25℃变温好氧发酵5天。再用大型灭菌锅灭菌秸秆1吨，加入5kg改良的NBRIP液体培养基，加固体发酵物20kg，混匀后加30-40wt.％的双蒸水搅拌，用大型固体发酵罐或分装入透气袋，白天30℃，夜间25℃变温好氧发酵5天。成品有效菌株含量为10⁸个/kg，施入标准为100kg/亩，施入时间为6-7月，适用于红壤区大规模作物种植，结果如图5所示。

序列表

<110> 中国科学院南京土壤研究所

<120> 一种分散泛菌及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tacggctacc ttgttacgac t 21

Claims

1.一种分散泛菌(Pantoea dispersa)，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年06月18日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No. 9359。

2.权利要求1所述分散泛菌(Pantoea dispersa)在溶解红壤中磷酸铝和/或磷酸铁中的应用。

3.红壤溶磷菌剂，其特征在于有效成分为分散泛菌(Pantoea dispersa) CGMCC No.9359。

4.红壤溶磷菌剂的生产方法，其特征在于步骤为：

1)将分散泛菌(Pantoea dispersa) CGMCC No. 9359接种于LB固体斜面培养基，30℃静置培养2天，进行活化；

2）培养好的活化菌株，在无菌操作条件下，将所得的斜面培养基上倒上无菌水，震荡30s，将悬液转移至改良的NBRIP液体培养基：10 g/L葡萄糖，2.5 g/L Ca₃(PO₄)₂，1 g/LAlPO₄，1.5 g/L FePO₄，5 g/L MgCl₂，0.25 g/L MgSO₄·7H₂O，0.2 g/L KCl，1 g/L (NH₄)₂SO₄；pH 6.8-8.0，30℃，160rpm摇床培养3天，进一步扩繁；

3）在无菌环境下，将所得的扩繁菌液与灭菌黄豆粉和花生秸秆的混合物按1:20质量比例搅拌混合填罐，罐高20-30cm，白天30℃，晚上20℃ 变温好氧固体发酵5天；其中黄豆粉与花生秸秆的质量比为1:10；

4）灭菌的花生秸秆1吨，加5 kg 改良的NBRIP液体培养基，与20 kg发酵产物混匀，加入上述混匀物30wt.%-40wt.%的水分，分装入袋，白天30℃，晚上20℃ 变温好氧固体发酵5天；

5）成品菌剂中有效菌株的含量不低于10⁸个/kg。

5.权利要求4所述红壤溶磷菌剂生产方法，其特征在于菌种pH生长范围6.5～8.0，培养温度范围20～35℃。