CN111484374B - 一种减少作物真菌病害与毒素污染的木霉源纳米硒叶面肥 - Google Patents

一种减少作物真菌病害与毒素污染的木霉源纳米硒叶面肥 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种减少作物真菌病害与毒素污染的木霉源纳米硒叶面肥。首次揭示一种新型的可应用于农业的组合物，其主要通过将哈茨木霉(Trichoderma harzianum)培养物与亚硒酸盐进行混合后获得，其具有良好的抑制真菌的作用。本发明人还筛选获得了一株效果非常优异的哈茨菌株，其发酵培养物与亚硒酸盐混合及后期处理后，获得的产物对于抵抗有害真菌以及提高植物抗病能力效果显著。

Description

一种减少作物真菌病害与毒素污染的木霉源纳米硒叶面肥
技术领域
本发明涉及农业肥料技术领域；更具体地，本发明涉及一种减少作物真菌病害与毒素污染的木霉源纳米硒叶面肥。
背景技术
硒是一种人体不可缺少的微量矿物质，在人体内发挥着十分重要的生物学功能和免疫功能。我国采用在农作物上喷硒提高主粮硒水平的方法，对克山病和大骨节病等缺硒症进行预防，取得了一定的效果。植物硒比动物硒产品的生物利用率高，且其中的有机硒比无机硒更安全有效。植物硒的生物利用率不因其硒来自自然的高硒区还是来自施加的硒肥而不同，在缺硒地区，给土壤或作物施硒肥提高主粮中的硒含量，是改善人体硒营养缺乏的根本措施之一。
真菌病害严重威胁作物的产量和品质，其中粮食作物受镰刀菌侵染后导致的赤霉病及茎腐病尤为严重，经济作物受链格孢菌侵染后容易导致黑斑病及黑腐病，两类真菌性疾病给国内作物经济带来重大损失，动摇国民之本。
而在真菌病害过程中，伴随着菌类生长分泌的次级代谢产物，真菌毒素，更是给人类健康带来诸多隐患。串珠镰刀菌产生的伏马毒素是一类2B级致癌物，在哺乳动物实验中，FB1可导致各种具有特异性的毒理作用，一系列的流行病学研究表明，FB1与人类食管癌的发生有关。链格孢毒素是一类相互间具有协同毒性的小分子，TeA能络合蛋白质活性中心的金属离子，AOH 影响DNA拓扑异构酶活性，二者共同作用极易引起哺乳动物急性中毒。
目前，市面上的富硒叶面肥虽很多，但大部分硒肥是通过在普通肥料中添加化学硒盐或锡矿石得到，这些硒盐或富硒矿石虽然便于获得，但是具有毒性，存在很大的安全隐患。而且目前此类的肥料难以被植物吸收，容易被雨水冲刷进入土壤造成二次污。同时，亚硒酸盐作为生产硒肥的原料，其本身是有毒性的，也需要良好的反应条件来使其完全消除毒性。
因此在不破坏环境的前提下，要减少作物真菌病害，提升作物品质，研制新型多功能肥料显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种减少作物真菌病害与毒素污染的木霉源纳米硒叶面肥。
在本发明的第一方面，提供一种用于农业的组合物，其通过包括以下步骤的方法来制备：将哈茨木霉(Trichoderma harzianum)培养物与亚硒酸盐进行混合。
在本发明的另一方面，提供一种制备用于农业的组合物的方法，包括：(1)发酵培养哈茨木霉，获得哈茨木霉培养物；(2)将亚硒酸盐与(1)的哈茨木霉培养物混合。
在一个优选例中，所述的哈茨木霉为：在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M 2019066的菌株。
在另一优选例中，所述的亚硒酸盐包括(但不限于)：亚硒酸钠，亚硒酸钾，亚硒酸锌。
在另一优选例中，所述的哈茨木霉培养物为：哈茨木霉经发酵培养后，从培养物中分离获取的木霉代谢产物；较佳地，为哈茨木霉经发酵培养后，从培养物中分离获取的培养上清。
在另一优选例中，发酵培养的培养基含有土豆粉和葡萄糖；较佳地，所述的培养基包括：土豆粉10-22重量份，葡萄糖1-2.2重量份，亚硒酸盐 0.0015-0.004，抗坏血酸0.004-0.015重量份，哈茨木霉菌种0.0001重量份，以及余量的水；较佳地，水(优选纯净水)为75-85重量份。
在另一优选例中，土豆粉12-20重量份，葡萄糖1.2-2重量份，亚硒酸盐 0.002-0.003，抗坏血酸0.006-0.01重量份，哈茨木霉菌种0.0001重量份，以及余量的水。
在另一优选例中，发酵培养包括：
(a)将土豆粉溶解于水中，加热煮沸，过滤获取滤液；
(b)将葡萄糖溶解步骤(a)的滤液中，混匀，灭菌，获得培养液；
(c)在(b)的培养液中接种入哈茨木霉菌种，室温(较佳地25±2℃；更佳地25±1℃)下震荡培养5±3天(较佳地5±2天；更佳地5±1天)，获得培养液；
(d)对(c)的培养液进行过滤除、离心，获取上清液。
在另一优选例中，菌株接种量为0.05～0.15％；较佳地为0.08～0.12％。
在另一优选例中，在将哈茨木霉培养物与亚硒酸盐进行混合后，还包括：在该混合产物中加入还原剂，进行反应；离心，获取沉淀。
在另一优选例中，所述还原剂包括：抗坏血酸或柠檬酸钠。
在另一优选例中，所述的组合物是农药组合物；较佳地，其是以哈茨木霉培养物、亚硒酸盐反应产物为主要活性组分的农药组合物；更佳地，其是以哈茨木霉培养物、亚硒酸盐反应产物合还原剂(化学还原剂)为主要活性组分的农药组合物。
在本发明的另一方面，提供所述的组合物的用途，用于制备肥料，所述肥料减少作物真菌病害与毒素污染。
在本发明的另一方面，提供一种木霉源纳米硒叶面肥，其包含所述的组合物，以及农业学(包括肥料领域或农药学领域)上可接受的载体。
在本发明的另一方面，提供一种木霉菌株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M 2019066。
在本发明的另一方面，提供一种木霉菌株培养物，其由在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M 2019066的菌株产生。
在本发明的另一方面，提供所述的木霉菌株或其培养物的用途，用于制备制备肥料，所述肥料减少作物真菌病害与毒素污染。
在本发明的另一方面，提供一种用于农业的试剂盒，其包含：前面任一所述的组合物，或所述的木霉源纳米硒叶面肥，或所述的木霉菌株，或所述的木霉菌株培养物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、木霉源纳米硒(TSNP)对菌丝的抑制作用优于传统化学法纳米硒(SNP)；
(a)对照组，PDA培养基；
(b)PDA培养基中添加200μg/ml SNP；
(c)PDA培养基中添加200μg/ml TSNP；
(d)三株菌的菌丝体生长速率；
(e)培养10天后正常菌丝的扫描电镜图；
(f)TSNP处理，培养10天后正常菌丝发生扭曲变形的扫描电镜图。
图2、TSNP处理后，真菌毒素生物合成因子表达下调；以CK组的表达为1，其它组与之比较获得相对值(纵坐标)；
(a)伏马毒素的骨架合成基因FUM1表达下调；
(b)LC-MS/MS检测结果表明伏马毒素产量明显减少；
(c)链格孢毒素骨架合成基因PA表达量明显下调；
(d)LC-MS/MS检测结果表明两种链格孢毒素产量明显减少。
图3、TSNP对接种了病原菌的玉米和梨的发病情况具有较好的改善作用；
(a)玉米籽粒在含有串珠镰刀菌的培养液中浸泡，经过不同处理，25℃条件下培养5天。将菌液改用无菌水浸泡(i)，浸泡前不做处理(ii)，浸泡前用传统化学纳米硒涂抹处理(iii)，浸泡前用TSNP涂抹处理(iv)；
(b)链格孢菌穿刺接种在梨的切片表面，经过不同处理，25℃培养5天，无菌水浸泡(i)，不做处理(ii)、传统化学纳米硒(iii)、TSNP(iv)。
图4、不同木霉菌株合成的木霉源硒肥的抗菌能力比较。
图5、硒叶面肥的分子大小测定。
图6、不同木霉菌株的对峙实验测定JF309菌株抑制致病菌的能力。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示一种新型的可应用于农业的组合物，其主要通过将哈兹木霉(Trichoderma harzianum)培养物与亚硒酸盐进行混合后获得，其具有良好的抑制真菌的作用。本发明人还筛选获得了一株效果非常优异的菌株，其发酵培养物与亚硒酸盐混合及后期处理后，获得的产物对于抵抗有害真菌以及提高植物抗病能力效果显著。
基于本发明的新发现，提供一种制备用于农业的组合物的方法，包括：(1)发酵培养木霉，获得木霉培养物；(2)将亚硒酸盐与(1)的哈兹木霉培养物混合；在本发明的优选方式中，进一步地，还在混合体系中加入还原剂，从而促进亚硒酸盐的更为完全的转化。
木霉是丝状真菌中的一类相对而言环境友好的菌株，和其他丝状真菌相比，木霉不具有致病型，不会产生真菌毒素，仅仅是寄生在腐烂死亡的朽木或者散布于空气中。针对一部分木霉的研究显示，其具有拮抗功能，有些木霉和致病性真菌对峙共培养时，有一定的抑制致病菌生长的作用。但是，其抑制病菌生长的能力是有限的，稳定性也不理想，用其开发具应用价值的产品也较为困难。
本发明的技术方案中，将木霉作为拮抗真菌，其在培养基中的代谢物能够防控病原真菌，帮助农作物有效地避免真菌侵害，同时纳米硒本身作为一种真菌拮抗剂，协同木霉代谢物，帮助植物抵抗有害真菌病害。另外，硒元素作为各种酶活反应中关键酶的活性中心，纳米级硒元素能够有效地进入植物体内，被吸收的硒元素参与合成植物体各种生理生化反应，激活作物自身的生长潜能和抗病性能。
本发明确定了一种理想的哈兹木霉菌株，因此作为本发明的优选方式，所述的木霉为在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M 2019066 的菌株。该菌株的培养产物与亚硒酸盐进行混合后获得，具有良好的抑制真菌的作用，并且稳定性理想。
作为本发明的优选方式，所述的亚硒酸盐包括但不限于：亚硒酸钠，亚硒酸钾，亚硒酸锌。优选地为亚硒酸钠。
作为本发明的优选方式，所述的木霉培养物为：木霉经发酵培养后，从培养物中分离获取的木霉代谢产物；较佳地，为木霉经发酵培养后，从培养物中分离获取的培养上清。本发明人发现，该培养上清与亚硒酸盐进行反应，能够使得亚硒酸盐还原为木霉源有机质修饰的单质硒，从而有利于将其转化为植物易于吸收的有机硒，而有机硒比无机硒容易吸收。
作为本发明的优选方式，发酵培养的培养基含有土豆粉和葡萄糖；较佳地，所述的培养基包括：土豆粉10-22重量份，葡萄糖1-2.2重量份，亚硒酸盐0.0015-0.004，抗坏血酸0.004-0.015重量份，木霉菌种0.0001重量份，以及余量的水；较佳地，水为75-85重量份。优选地，采用纯净水。在优选的方式中，本发明的木霉菌株在培养液中的接种量为0.05～0.15％；较佳地为 0.08～0.12％。
作为本发明的优选方式，在将木霉培养物与亚硒酸盐进行混合后，还包括：在该混合产物中加入还原剂，进行反应；离心，获取沉淀。所述还原剂与木霉菌培养物一起，有利于将亚硒酸盐转化为植物易于吸收的有机硒。亚硒酸盐作为生产硒肥的原料，其本身是有毒性的，本发明建立的这一反应条件，可使其基本完全地消除其毒性。
所述还原剂可以包括：抗坏血酸，柠檬酸钠等。此外，其它一些能够促进亚硒酸盐发生还原反应的试剂也可被应用于本发明中。优选的还原剂为抗坏血酸。
前述的组合物可以作为木霉源纳米硒叶面肥；或者，其可进一步地与农业上可接受的载体或赋形剂等混合，制备木霉源纳米硒叶面肥。所述肥料减少作物真菌病害与毒素污染。
因此，本发明还提供一种木霉源纳米硒叶面肥，其包含有效量的前面所述的组合物，以及农业学(包括肥料领域或农药学领域)上可接受的载体。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本发明中，“农业学上可接受的”的成分是适用于农业用途而对人或其它动物、植物没有过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，“农业学上可接受的载体”是用于将本发明的组合物或叶面肥传送给植物的可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂等。载体可以是液体或固体。
所述组合物的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：冻干剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物，水溶液，乳液，可喷洒溶液，油性或水性分散系，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，或微胶囊。应理解，只要能够将本发明所述的组合物或叶面肥在保持全部或部分活性的前提递送到植物植株(如叶片，茎)或种子上的剂型都是可取的。优选那些易于递送的剂型，如溶液、液体喷洒剂、或喷雾剂。
在本发明中，所述的农业学上可接受的载体还可包括辅剂。所述的辅剂是一种辅助成分，在组合物中起辅助调节功能，比如其可以是一种表面活性剂、附着助剂或其它类型助剂。
浓缩型的组合物中活性成分的含量较高，如20-90wt％，而稀释型组合物和实际使用的组合物中活性成分含量较低，通常为0.00005-0.5wt％。此外，还可以包含其他合适的化学剂、增效剂、微量元素、稳定剂、粘合剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、溶剂、充填剂等常用组分。本发明组合物中还可以含有其它活性成分，如杀虫剂或其它肥料。
各种制剂的原理都是已知的，并在例如以下文献中有所描述： Winnacker-Kuchler，“Chemische Technologie”化学技术，Vol.7，C.Hauser Verlag Munich，第4版，1986；van Valkenburg，“农药剂型”，Marcel Dekker N.Y.,第2版，1972-73；K.Martens，“喷雾干燥手册”，第3版，G.Goodwin Ltd.London。
用于本发明组合物的所需的配制辅剂，(例如惰性物质，表面活性剂，溶剂和其他添加剂)，也是已知的，其描述例如：Watkins“杀虫粉剂稀释剂和载体手册”第2版，DarlandBooks,Caldwell N.J.；H.v.Olphen，“粘土胶体化学导引”第2版，J.Wiley&Sons,N.Y.,Marsden,“溶剂指南”第2版， Interscience,N.Y.1950；McCutcheon’s，“除垢剂和乳化剂年刊”，MC Publ. Corp.，Ridgewood N.J.；Sisley和Wood，“表面活性剂百科全书”，Chem.Publ. Co.Inc.，N.Y.1964；Schonfelt，“Grenzflachenaktive Athylenoxidaddukte”表面活性环氧乙烷加成产物，Wiss.Verlagsgesell.，Stuttgart 1976； Winnacker-Kuchler，“Chemische Technologie"化学技术，Vol.7，C.Hauser Verlag Munich，第4版，1986。
本发明肥料在使用时可以在作物开花、结果期间使用；也可以作为基肥使用，在开花结果期再次追肥。
本发明的木霉菌株命名为JF301，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCNO:M 2019066。本发明人从多类植物中分离感兴趣的菌株并研究其效果，最终从一株香菇等腐殖质样本中分离获得该木霉菌株。该木霉菌株或其培养物，也可以被包含在一种试剂盒，以应用于生产本发明的叶面肥。
本发明所述的组合物、含有该组合物以及农业学上可接受的载体的木霉源纳米硒叶面肥，也可以被包含在一种试剂盒，以应用于生产或农业施用。
本发明的有益效果是：本发明选择拮抗菌株木霉的代谢物作为合成纳米硒的稳定剂和修饰物，一方面不需要额外加分散稳定剂减少了成本，直接将无机硒修饰转化为植物容易吸收的有机硒，另一方面作为防控拮抗菌，木霉的代谢物有效的抑制了致病性丝状真菌的生长，减少作物病害，降低了食品中较高的真菌毒素风险。与此同时，纳米级叶面肥增强了植物吸收，避免了硒元素流入土壤造成二次污染，硒酸盐的转化也减少了土壤板结土质降低的风险。
下面将对本发明的技术方案进行详细，完整地描述，下述说明仅仅是示例性的，并不对实施对象做出限制。基于本发明中的示例，本领域其他技术人员在没有做出创造性成果的前提下，基于本发明所得其他实例，均属于本发明保护范围。
下述实施例中，如无特别说明，各原料用量均为重量份，各原料含量均为重量百分含量。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
实施例1、JF309菌株
1、菌株的鉴定
在食用香菇种植基地里，统计了那些长势良好的香菇种植区域，等待收获完成时，从这些特定区域内的香菇根系周边取少许土壤样本，带回实验室进行真菌分离。向真菌培养基中加入氨苄抗生素，将稀释1000倍(体积/质量)的土壤悬液均匀涂布在培养基表面。待4天后，经过肉眼统计鉴定，找出该土壤菌群中丰富度最高的一类真菌，用枪头挑取转入平皿中进行单独培养。
该类菌培养前期2～3天产生大量白色透明菌丝，迅速铺满平皿，菌落中心呈淡绿色，培养后期1周左右，菌落中心绿色加深，出现斑点白，边缘菌丝泛绿，平皿内分泌有大量的的绿色粉状物，产生独特的挥发香味。扣取边缘菌丝，进行真菌ITS PCR菌种鉴定，测序后进行比对，结果显示，该菌属于哈茨木霉这一类。
2、JF309菌株抑制致病菌的能力
本实施例中，本发明人在固体平板上进行两类菌体对峙实验，两类菌株分别为木霉和链格孢菌。黑色菌体为两株链格孢菌(上为细极链格孢，下为链格孢)，绿色菌体为8株不同种属的木霉，其中E7，F7为哈茨木霉JF309对峙两株链格孢。
培养条件为26℃，黑暗培养一周。从活化的新鲜菌株平板上扣取直径1cm 菌块，接种到新鲜的空白培养基中。两种菌同时扣取，菌面朝下倒扣接种，两菌块相距5cm居中放置。
结果见图6，可见，本发明的菌株JF309，相比于其他木霉菌株，抑制链格孢生长的效果更加明显，原本黑色的致病菌体，受到木霉的影响，菌丝体泛白，生长停滞。
3、制备JF309菌株液体代谢物
(1)将土豆粉溶解于纯净水中，加热至煮沸状态，三层纱布过滤，留下滤液备用；
(2)将葡萄糖溶解于(1)中的滤液中，充分搅拌溶解，将培养基高温灭菌处理，无菌放置备用；
(3)将木霉菌种在无菌环境中按照0.1％的接种量接种于(2)中的培养基，无菌环境下25℃，150rpm震荡培养5天，取出培养液备用；
(4)将培养液先过滤，去除菌丝等可见性杂质，接着5000rpm常温离心 5min，留取上清液备用。
实施例2、木霉源纳米硒叶面肥1的制备
本实施例中，制备木霉源生物纳米硒叶面肥1。
1、制备JF309菌株液体代谢物
(1)将土豆粉溶解于纯净水中，加热至煮沸状态，三层纱布过滤，留下滤液备用；
(2)将葡萄糖溶解于(1)中的滤液中，充分搅拌溶解，将培养基高温灭菌处理，无菌放置备用；
(3)将木霉菌种在无菌环境中接种于(2)中的培养基，无菌环境下25℃， 150rpm震荡培养5天，取出培养液备用；
(4)将培养液先过滤，去除菌丝等可见性杂质，接着5000rpm常温离心 5min，留取上清液备用。
2、制备木霉源生物纳米硒叶面肥
(1)将前述获得的上清液分装，每份1L，加入200mg亚硒酸钠粉末，25℃， 100rpm震荡30min，得到稳定均一的亚硒酸钠溶液；
(2)将(1)中溶液缓慢搅拌，加入950mg抗坏血酸，25℃，50rpm搅拌1h，得到稳定均一的硒溶液；
(3)将硒溶液10000rpm，4℃离心1h，上清液回收用来配制培养基，红色沉淀收取备用；
(4)将(3)中沉淀冷冻干燥过夜，得到干粉状木霉源纳米硒肥料；
(5)加水复溶，按照10g/L的浓度分装，得到木霉源纳米硒叶面肥母液。
以上获得的木霉源纳米硒叶面肥母液，换算为重量份为单位，其原料为：亚硒酸钠(NaSeO3)1份，抗坏血酸4.75份，JF309菌株液体代谢物5000份。
3、叶面肥的分子大小测定
获取前述制备的冷冻干燥处里后的干粉状木霉源纳米硒肥料，取0.01g 溶于1ml双蒸水中，进行染色。取200ul，用2％的醋酸双氧铀水溶液室温染色15min，再加入柠檬酸铅染色10min，最后吸取少量样本至于铜网准备上样，得到五个视野中该硒肥颗粒的透射电镜图。通过软件测算，统计粒径分布，求取平均值，测定得到该硒肥颗粒的粒径大小。
结果如图5，上面两图显示分别为该硒肥颗粒的颗粒形态(左)以及颗粒之间的聚集形式(右)，下图是对该硒肥的粒径分布统计图。可以得到其粒径集中分布在50-65nm之间，说明该木霉源硒肥颗粒为纳米级。
4、叶面肥中存在的化合物的研究
本发明人对前述制备的叶面肥进行质谱分析，测定本发明的叶面肥中化合物情况。结果见附表1。
表1
Figure RE-GDA0002050917560000111
根据表1，本发明制备的叶面肥中存在较多的抗菌性化合物以及有利于植物生长的物质。
实施例3、木霉源纳米硒叶面肥1的抑制作用
本实施例中，将果蔬黑斑病致病菌链格菌(Alternaria alternata，来自栆黑斑病的病果)，玉米等经济作物致病菌串珠镰刀菌(Fusarium verticillioide，来自玉米穗腐病的籽粒)，小麦麦腐病病原菌禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum，来自小麦麦腐病的穗头)分别在添加不同添加物的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上培养，25℃培养7天和10天，分别观测它们的生长情况。所述添加物分别是200μg/ml传统化学法纳米硒(SNP)，200μg/ml本发明实施例1制备的木霉源纳米硒叶面肥1(称为TSNP)。
上述的SNP制备方法为：将亚硒酸钠粉末稳定在阿拉伯胶稳定溶液中，半小时后加入过量的还原剂如抗坏血酸等，10000rpm高速离心一小时后，得到干重的纳米硒材料，按照需求稀释得到相应浓度的SNP(Synthesis and antioxidant properties of gum arabic-stabilized selenium nanoparticles.，Int J Biol Macromol.2014Apr；65:155-62)。
培养7天后，果蔬黑斑病致病菌链格菌(左)，玉米等经济作物致病菌串珠镰刀菌(中)和小麦麦腐病病原菌和谷镰刀菌(右)生长情况如图1a～c所示，其中a为对照组，仅以PDA培养基培养；b为PDA培养基中添加200μg/ml SNP培养；c为PDA培养基中添加200μg/mlTSNP培养。可见，与对照组相比，添加本发明的叶面肥后，真菌的生长状态呈现极为显著的抑制；而添加SNP则存在部分抑制，但抑制效果尚不够理想。
3种培养方式的菌株培养10天后，进行菌丝的扫描电镜检测。对照组培养10天后菌丝的扫描电镜图如图1e，菌丝呈现正常状态；而TSNP培养组培养10天后，则正常菌丝发生扭曲变形，如图1f。
因此，本发明的木霉源纳米硒(TSNP)对菌丝的抑制作用显著地优于传统化学法纳米硒。
实施例4、木霉源纳米硒叶面肥1对真菌毒素生物合成因子及毒性产生的影响
本实施例中，培养链格菌(Alternaria alternata)和串珠镰刀菌(Fusariumverticillioide)，提取其核酸，检测本发明的叶面肥对于真菌毒素生物合成因子的影响作用。设置三个组：CK组(空白对照组，液体PDB培养基)，SNP 组(PDB培养基添加传统SNP培养)，TSNP组(PDB培养基添加TSNP培养)。
所检测的生物合成因子包括伏马毒素的骨架合成基因FUM1、链格孢毒素骨架合成基因PA，采取定量PCR方法进行基因表达的检测。
测定FUM1的引物为：GAGTGTATGCAGTCATCAGG和 GCCCGAGTCGTATAAGTC(SEQ ID NO:1)；
测定PA的引物为：GTGACCTACGCCGATAACT和 AAGCATTGACGATGAAACC(SEQ ID NO:2)；
测定FUM19的引物为：ATCAGCATCGGTAACGCTTATGA和 CGCTTGAAGAGCTCCTGGAT(SEQID NO:3)；
测定EPG的引物为：TGCCTGCGAACAAGATGC和 CCGTTCTGGAAAGTAATGCC(SEQ ID NO:4)。
基因测定结果如图2a和2c，可见在TSNP组中，伏马毒素的骨架合成基因FUM1表达下调，链格孢毒素骨架合成基因PA表达量明显下调。
本发明人还利用LC-MS/MS检测毒素情况，结果如图2b和2d，表明伏马毒素(FB)产量明显减少，两种链格孢毒素(AOH和TeA)产量明显减少。
实施例5、木霉源纳米硒叶面肥1对植物抗病能力的改善作用
本实施例中，考察木霉源纳米硒叶面肥1对植物抗病能力的改善作用。
1、以玉米籽粒为研究对象
获取玉米籽粒，进行不同处理，在含有串珠镰刀菌(0.1％的孢子液)的培养液(PDB液体培养基)中浸泡，25℃条件下浸泡5天。所述的不同处理包括：不用菌液而以无菌水浸泡(i)，菌液浸泡前不做处理(ii)，菌液浸泡前用传统化学纳米硒SNP涂抹处理(iii)，菌液浸泡前用TSNP涂抹处理(iv)。
结果如图3a，可见，菌液浸泡前用TSNP涂抹处理可以显著地改善玉米籽粒的抗病菌能力，籽粒状态接近于未以菌液浸泡的第(i)组，而以SNP处理组(iii)或不处理组(ii)，则籽粒表面真菌生长较多(红色箭头指示了一些代表性的真菌富集区域)。
2、以梨为研究对象
获取梨的切片，进行不同处理，在其上穿刺接种链格孢菌，25℃浸泡5 天。所述的不同处理包括：不用菌液而以无菌水浸泡(i)，菌液浸泡前不做处理(ii)，菌液浸泡前用传统化学纳米硒SNP涂抹处理(iii)，菌液浸泡前用TSNP 涂抹处理(iv)。
结果如图3b，可见，菌液浸泡前用TSNP涂抹处理可以显著地改善梨果肉切片的抗病菌能力，菌液浸泡后真菌生长显著地少于以SNP处理组(iii)或不处理组(ii)(红色箭头指示了一些代表性的真菌富集区域)。
综上，TSNP对接种了病原菌的玉米和梨的发病情况具有较好的改善作用。
3、不同木霉菌株的抗菌能力比较
本发明人用不同种木霉菌种(图4)取代JF309，进行发酵，获取发酵上清液后，如前实施例2的制备方法合成了相应的木霉源纳米硒叶面肥。测试不同木霉菌种的代谢产物当用于制备叶面肥时的效果。
在PDA上培养病原菌串珠镰刀菌Fusarium verticillioide(上)和链格孢菌Alternaria alternata(下)，将病原菌活化后，分别接种到含有前述合成的木霉源纳米硒叶面肥的PDA平板中，观测其抑制病原菌的效果，如果病原菌菌圈显著缩小，则表明抑菌效果理想。
结果如图4，基于JF309代谢物制备的木霉源纳米硒叶面肥显然抑制效果最为理想。
实施例6、木霉源纳米硒叶面肥2和3的制备
本实施例中，制备木霉源生物纳米硒叶面肥2。
1、制备JF309菌株液体代谢物
(1)将土豆粉溶解于纯净水中，加热至煮沸状态，三层纱布过滤，留下滤液备用；
(2)将葡萄糖溶解于(1)中的滤液中，充分搅拌溶解，将培养基高温灭菌处理，无菌放置备用；
(3)将木霉菌种在无菌环境中接种于(2)中的培养基，无菌环境下25.5℃， 140rpm震荡培养6天，取出培养液备用；
(4)将培养液先过滤，去除菌丝等可见性杂质，接着5000rpm常温离心 5min，留取上清液备用。该上清液的主要活性物质为菌株代谢产物。
2、制备木霉源生物纳米硒叶面肥2
(1)将前述“1”获得的上清液分装，每份1L，加入280mg亚硒酸钠粉末，25.5℃，95rpm震荡25min，得到稳定均一的亚硒酸钠溶液；
(2)将(1)中溶液缓慢搅拌，加入700mg柠檬酸钠，25℃，50rpm搅拌1h，得到稳定均一的硒溶液；
(3)将硒溶液10000rpm，4℃离心1h，上清液回收用来配制培养基，红色沉淀收取备用；
(4)将(3)中沉淀冷冻干燥过夜，得到干粉状木霉源纳米硒肥料；
(5)加水复溶，按照10g/L的浓度分装，得到木霉源纳米硒叶面肥母液。
以上获得的木霉源纳米硒叶面肥母液，换算为重量份为单位，其原料为：亚硒酸钠(NaSeO3)1.4份，抗坏血酸3.5份，JF309菌株液体代谢物5000份。
3、制备木霉源生物纳米硒叶面肥3
(1)将前述“1”获得的上清液分装，每份1L，加入240mg亚硒酸钠粉末，25℃，105rpm震荡25min，得到稳定均一的亚硒酸钠溶液；
(2)将(1)中溶液缓慢搅拌，加入800mg抗坏血酸，25℃，50rpm搅拌1h，得到稳定均一的硒溶液；
(3)将硒溶液10000rpm，4℃离心1h，上清液回收用来配制培养基，红色沉淀收取备用；
(4)将(3)中沉淀冷冻干燥过夜，得到干粉状木霉源纳米硒肥料；
(5)加水复溶，按照10g/L的浓度分装，得到木霉源纳米硒叶面肥母液。
以上获得的木霉源纳米硒叶面肥母液，换算为重量份为单位，其原料为：亚硒酸钠(NaSeO3)1.2份，抗坏血酸4份，JF309菌株液体代谢物5000份。
在实验室条件下，进行木霉源生物纳米硒叶面肥2和木霉源生物纳米硒叶面肥3的测试，实验方法同实施例5。结果发现，纳米硒叶面肥2和木霉源生物纳米硒叶面肥3对接种了病原菌的玉米和梨的发病情况具有显著且良好的改善作用。
生物材料保藏
本发明提供的JF309菌株(Trichoderma sp.)保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学)，保藏号为CCTCC NO:M 2019066，保藏日为2019年1月21日。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术手段下所完成的同等产物或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 一种减少作物真菌病害与毒素污染的木霉源纳米硒叶面肥
<130> 190096
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 1
gagtgtatgc agtcatcagg 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 2
gcccgagtcg tataagtc 18
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 3
gtgacctacg ccgataact 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 4
aagcattgac gatgaaacc 19
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 5
atcagcatcg gtaacgctta tga 23
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 6
cgcttgaaga gctcctggat 20
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 7
tgcctgcgaa caagatgc 18
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物(Primer)
<400> 8
ccgttctgga aagtaatgcc 20

Claims (27)

1.一种用于农业的组合物，其通过包括以下步骤的方法来制备：将哈茨木霉(Trichoderma harzianum)培养液与亚硒酸盐进行混合，在该混合产物中加入还原剂进行反应，离心获取沉淀；所述还原剂是促进亚硒酸盐发生还原反应的试剂；所述的哈茨木霉为在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M 2019066的菌株。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的亚硒酸盐包括：亚硒酸钠，亚硒酸钾，亚硒酸锌。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的哈茨木霉培养液为：哈茨木霉经发酵培养后，从培养液中分离获取的木霉代谢产物。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的哈茨木霉培养物为哈茨木霉经发酵培养后，从培养液中分离获取的培养上清。
5.如权利要求4所述的组合物，其特征在于，发酵培养的培养基含有土豆粉和葡萄糖。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述的培养基包括：土豆粉10-22重量份，葡萄糖1-2.2重量份，亚硒酸盐0.0015-0.004，抗坏血酸0.004-0.015重量份，哈茨木霉菌种0.0001重量份，以及余量的水。
7.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述的培养基包括：土豆粉12-20重量份，葡萄糖1.2-2重量份，亚硒酸盐0.002-0.003，抗坏血酸0.006-0.01重量份，哈茨木霉菌种0.0001重量份，以及余量的水。
8.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，发酵培养包括：
(a)将土豆粉溶解于水中，加热煮沸，过滤获取滤液；
(b)将葡萄糖溶解步骤(a)的滤液中，混匀，灭菌，获得培养液；
(c)在(b)的培养液中接种入哈茨木霉菌种，室温下震荡培养5±3天，获得培养液；
(d)对(c)的培养液进行过滤除、离心，获取上清液。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述还原剂包括：抗坏血酸或柠檬酸钠。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是农药组合物。
11.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是以哈茨木霉培养液、亚硒酸盐反应产物为主要活性组分的农药组合物。
12.权利要求1～11任一所述的组合物的用途，用于制备肥料，所述肥料减少作物真菌病害与毒素污染。
13.一种制备用于农业的组合物的方法，包括：
(1)发酵培养哈茨木霉，获得哈茨木霉培养液；所述的哈茨木霉为在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M 2019066的菌株；
(2)将亚硒酸盐与(1)的哈茨木霉培养液混合，在该混合产物中加入还原剂进行反应，离心获取沉淀；所述还原剂是促进亚硒酸盐发生还原反应的试剂。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的亚硒酸盐包括：亚硒酸钠，亚硒酸钾，亚硒酸锌。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的哈茨木霉培养液为：哈茨木霉经发酵培养后，从培养液中分离获取的木霉代谢产物。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的哈茨木霉培养液为：哈茨木霉经发酵培养后，从培养液中分离获取的培养上清。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，发酵培养的培养基含有土豆粉和葡萄糖。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述的培养基包括：土豆粉10-22重量份，葡萄糖1-2.2重量份，亚硒酸盐0.0015-0.004，抗坏血酸0.004-0.015重量份，哈茨木霉菌种0.0001重量份，以及余量的水。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的培养基包括：土豆粉12-20重量份，葡萄糖1.2-2重量份，亚硒酸盐0.002-0.003，抗坏血酸0.006-0.01重量份，哈茨木霉菌种0.0001重量份，以及余量的水。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，发酵培养包括：
(a)将土豆粉溶解于水中，加热煮沸，过滤获取滤液；
(b)将葡萄糖溶解步骤(a)的滤液中，混匀，灭菌，获得培养液；
(c)在(b)的培养液中接种入哈茨木霉菌种，室温下震荡培养5±3天，获得培养液；
(d)对(c)的培养液进行过滤除、离心，获取上清液。
21.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述还原剂包括：抗坏血酸或柠檬酸钠。
22.一种木霉源纳米硒叶面肥，其包含权利要求1～11任一所述的组合物，以及农业学上可接受的载体。
23.一种木霉菌株，其在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M 2019066。
24.权利要求23所述的木霉菌株的用途，用于制备肥料，所述肥料减少作物真菌病害与毒素污染。
25.一种木霉菌株培养物，其由在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M2019066的菌株产生。
26.权利要求25所述的木霉菌株培养物的用途，用于制备肥料，所述肥料减少作物真菌病害与毒素污染。
27.一种用于农业的试剂盒，其包含：
权利要求1～11任一所述的组合物，或
权利要求22所述的木霉源纳米硒叶面肥，或
权利要求23所述的木霉菌株，或
权利要求25所述的木霉菌株培养物。
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