CN114058535B - 一种脱氮副球菌及其制备纳米硒的方法 - Google Patents

一种脱氮副球菌及其制备纳米硒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种脱氮副球菌及其制备纳米硒的方法，属于微生物技术领域。本发明从富硒泥土样品筛选分离出一株脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)，其对高浓度的亚硒酸盐具有较好的耐受能力，且可以将SeO3 2‑还原成单质硒。脱氮副球菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22537。脱氮副球菌菌株在浓度为1～80mM亚硒酸盐条件下具有较好的还原亚硒酸盐的能力，当亚硒酸盐浓度达到20mM和50mM时，亚硒酸盐还原率仍超过60％。同时该菌株合成的纳米硒具有较低的毒性和良好的生物相容性。

Description

一种脱氮副球菌及其制备纳米硒的方法
技术领域
本发明涉及一种脱氮副球菌及其制备纳米硒的方法，属于微生物技术领域。
背景技术
硒是一种非金属元素，可以用作光敏材料、电解锰行业催化剂，是动物体内必需的营养元素，对动植物生长起着重要作用。硒对于动植物、微生物的新陈代谢和生长发育以及人体健康都有重要的影响。纳米颗粒具有独特的物理、化学和光电特性，这使得它们不同于相同组成的块状材料。硒纳米颗粒作为新一代光电子、电子化学和生物化学传感器的组成部分，在生物、医学和环境修复等领域都有广泛的应用。但由于硒具有生物蓄积性，因此其对自然生态系统来说仍是一种具有潜在毒性的元素。天然环境中硒通常以各种氧化态形式存在于矿物中，例如硒酸盐(SeO4 2-，Se(VI))，亚硒酸盐(SeO3 2-，Se(IV))，硒化物(Se2-)等。研究发现，硒酸盐和亚硒酸盐通常存在于水环境中，亚硒酸盐毒性比硒酸盐毒性更强。
尽管硒天然存在于地壳中，特别是在碳酸盐岩、火山和沉积土壤中，但向大气和水生环境排放的硒中约有40％是由各种工业活动(如与采矿有关的作业)引起的。近些年来，水质和污染监测的结果表明，硒是一种潜在的环境污染物。目前，含硒废水的处理方法主要有物理、化学和生物法。物理法通常利用反渗透、离子交换、纳滤技术对含硒废水进行处理，化学法主要是使用还原剂还原硒酸盐或亚硒酸盐生成单质硒，然后使用吸附剂将沉淀的纳米硒彻底吸附去除。物理法和化学法处理含硒废水价格较高、设备复杂，同时化学法处理含硒废水需要投加大量的化学试剂，容易造成二次污染。相较于物理处理和化学处理法，利用生物法处理含硒废水是一种更经济、绿色的处理方法，微生物合成纳米颗粒属于“绿色化学”，这是化学中的一个特殊领域，旨在将化学合成对环境的负面影响降到最低。因此，生物合成以获得各种元素的纳米颗粒是一种生态无害的替代化学合成的生物技术方法，目前正在积极开发。同时生物法处理可以合成单质硒纳米球，单质硒纳米球对于各种工业应用，例如生物医学，电学和生物传感器等过程，其显示出独特的光学和光谱特性，具有较好的应用潜力。此外，元素硒的纳米结构在生物技术和医学应用方面显示出了巨大的潜力。
自然界中普遍存在由微生物合成的各种纳米材料，由于硒纳米颗粒在纳米生物技术中的广泛应用，以及与“绿色合成”相关的硒纳米颗粒其合成方法和机制的特殊性，使得微生物合成硒纳米颗粒在近些年受到越来越多的研究者的关注。除了由于通过“绿色合成”形成纳米颗粒的方法和机制的特殊性使得这些纳米颗粒在纳米技术中的广泛应用之外，还考虑到生物源性纳米颗粒与化学获得的纳米材料一些不同的特殊性。此外，对硒生物矿化相关微生物驱动过程的详细了解，可以为开发清除根际、土壤或海洋硒污染或土壤含水层的生物修复策略提供生物技术基础。微生物合成的硒纳米颗粒表面会被多种生物大分子所包裹，从而使微生物法合成的纳米硒颗粒的稳定性和耐高温性大大提升。因此，微生物还原硒的方法已经成为研究热点。目前已有越来越多的研究表明许多微生物都具有将硒酸盐和亚硒酸盐还原成纳米硒的性能。Sarathchandra等在研究过程中就发现了大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)可以合成红色的纳米硒。乳酸菌(Lactobacillus)、假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila)等细菌及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、黑曲霉(Aspergillus niger)等真菌都已被报道具有将硒酸盐和亚硒酸盐还原成纳米硒的性能。然而能够在高浓度下还原亚硒酸盐的菌株相关研究目前报道较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一株脱氮副球菌及其制备纳米硒的方法，该菌株可在高SeO3 2-浓度下将其还原为纳米硒，合成的纳米硒具有较好的生物相容性。
一株副球菌SSJ(分类命名：脱氮副球菌Paracoccus denitrificans)，筛选分离于贵州省开阳县一茶厂的富硒泥土样品，该脱氮副球菌对高浓度的亚硒酸盐具有较好的耐受能力，且可以将SeO3 2-还原成单质硒。该脱氮副球菌属于革兰氏阴性菌，菌体为球状，该菌株16S rRNA基因序列的Genbank登录号为MZ220484。
该脱氮副球菌菌株SSJ保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22537，保藏日期为2021年5月17日。
一种根据权利要求1所述脱氮副球菌制备纳米硒的方法，包括步骤：用磷酸盐缓冲溶液将培养基的pH分别调至5.0～8.0，所述培养基经115℃，0.15MPa高温高压灭菌15min后加入终浓度为1～80mmol/L的亚硒酸钠，接入2％(V/V)脱氮副球菌菌液；在29.5～30.5℃，145～155r/min条件下培养3～5天。
优选的是，所述培养基的组成为：葡萄糖4g/L、(NH4)2SO4 1g/L、K2HPO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、NaCl 15g/L、去离子水。
优选的是，制备脱氮副球菌菌液的方法包括经过稀释涂布平板法，将所述脱氮副球菌均匀涂布在固体培养基上，于30℃条件下培养；最终选取一个长势较好的单菌落转移至液体培养基中进行培养，在29.5～30.5℃，145～155r/min条件下培养获得所述菌液；所述固体培养基配方：葡萄糖4g/L、(NH4)2SO4 1g/L、K2HPO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、NaCl15g/L、琼脂20g/L；所述液体培养基的配方：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、去离子水。
优选的是，所述脱氮副球菌制备纳米硒的方法还包括分离纳米硒的步骤：
将培养后获得的溶液于9500～10500r/min，9～11min条件下离心，离心后沉淀加入少量去离子水重悬后超声破碎30min，破碎后得到的溶液于1500～2500r/min，4～6min条件下离心，取上清液于9500～10500r/min，9～11min条件下离心，经离心后将沉淀干燥后制成纳米硒粉末。
本发明的有益效果如下：
本发明提供了一株可以还原较高浓度亚硒酸盐的脱氮副球菌，该菌株可在在1～80mM的亚硒酸盐浓度下还原亚硝酸盐，并生产纳米硒；该菌株在较高的亚硒酸盐浓度(亚硒酸盐具体浓度为20～80mM)条件下依旧具有较好的还原亚硒酸盐的能力，当亚硒酸盐浓度达到20mM和50mM时，亚硒酸盐还原率仍超过60％。该菌株合成的SeNPs具有较低的毒性和良好的生物相容性。
附图说明
图1是菌株SSJ的SEM图；
图2是菌株SSJ的系统发育树；
图3是菌株SSJ的生长曲线；
图4是菌株SSJ在不同亚硒酸盐浓度条件下对亚硒酸盐的还原率；
图5是菌株SSJ在不同pH条件下对亚硒酸盐的还原率；
图6是菌株SSJ合成纳米硒的SEM图；
图7是菌株SSJ合成纳米硒的抗菌性。
具体实施方式
下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。
实施例所用培养基的配方：葡萄糖4g/L、(NH4)2SO4 1g/L、K2HPO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、NaCl 15g/L、去离子水，pH 7.0。
实施例所用固体培养基配方：葡萄糖4g/L、(NH4)2SO4 1g/L、K2HPO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、NaCl 15g/L、琼脂20g/L。
实施例所用液体培养基的配方：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、去离子水。
实施例1：脱氮副球菌菌株的筛选
本发明使用的一株脱氮副球菌SSJ选自贵州省开阳县一茶厂的富硒泥土样品，经过6次稀释涂布平板法，将样品均匀涂布在固体培养基上，于30℃条件下培养。最终选取一个长势较好的单菌落转移至液体培养基中进行培养，于30℃，150r/min条件下培养获得菌液。菌株SSJ的细胞形态为球形，直径为0.7-0.9μm，扫描电镜照片如图1。菌株SSJ 16S rRNA基因序列的Genbank登录号为MZ220484。
该菌株于2021年5月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCCNo.22537。
实施例2：菌株16S rRNA基因分子鉴定
提取脱氮副球菌SSJ的基因组DNA，通过PCR扩增16S rRNA基因序列，利用BLAST程序对序列进行同源性对比，得到与其最相近的菌属为脱氮副球菌，菌株SSJ与脱氮副球菌16S rRNA基因序列相似性为100％，因此判定SSJ为脱氮副球菌。图2为菌株SSJ 16S rRNA基因的系统发育树。
实施例3：菌株SSJ的生长曲线
将实施例1中的菌液加入115℃，15min高压灭菌过的培养基，于30℃，150r/min下培养，接菌量为2％(V/V)。菌株SSJ的生长情况如图3，菌株生长6～16h时为对数生长期，19～21h时进入稳定期。
实施例4：菌株SSJ在不同亚硒酸盐浓度条件下对亚硒酸盐的还原率
向115℃，15min高压灭菌后的培养基中加入终浓度分别为1、20、50、80mmol/L的亚硒酸钠，接入2％(V/V)菌液。培养5天后，将所得菌液分别在8000±50r/min，5±1min条件下离心，取1mL离心后上清液来测定反应体系中未被还原的亚硒酸盐浓度。利用盐酸和抗坏血酸测定亚硒酸盐浓度，在强酸性条件下，抗坏血酸可将亚硒酸盐还原成单质硒，溶液呈现橙红色，溶液颜色与亚硒酸盐浓度呈线性关系。在本实验中，向上述得到的1mL上清液中依次加入4mol/L盐酸0.5mL、1mol/L抗坏血酸1mL，待10min后，于500nm波长下测定吸光度值，根据标准曲线(y＝0.0042x-0.0529，R2＝0.9978)计算样品中剩余亚硒酸盐的浓度，并计算其还原率。如图4所示，当亚硒酸钠浓度较高，达到20mmol/L时，该脱氮副球菌对亚硒酸盐的还原率为65.44％，还原率最高，随着亚硒酸盐浓度增加到50mmol/L时，菌株对亚硒酸盐的还原率虽有所下降但下降幅度较小，亚硒酸盐的还原率为62.84％。当亚硒酸钠浓度增加到80mmol/L时，本菌株仍然可以还原部分亚硒酸盐，还原率为6.33％。可见，菌株SSJ可以耐受高浓度亚硒酸盐，同时在20～80mmol/L浓度的亚硒酸盐条件下具有较好的还原亚硒酸盐的能力。
实施例5：菌株SSJ在不同pH条件下对亚硒酸盐的还原率
利用磷酸盐缓冲溶液将液体培养基的pH分别调至5.0、6.0、7.0及8.0，并在115℃条件下高压灭菌15min，向灭菌后的液体培养基中加入亚硒酸盐使体系中亚硒酸盐终浓度为50mmol/L，接菌量为2％(V/V)，培养5天。将培养后溶液在8000±500r/min条件下离心5±1min，取1mL离心后上清液来测定反应体系中未被还原的亚硒酸盐浓度。与实施例4相同，利用盐酸和抗坏血酸测定反映后体系剩余SeO3 2-含量。如图5所示，培养基pH为7.0时亚硒酸盐的还原率最高，当培养基pH低于7.0及高于7.0时SeO3 2-的还原率均低于pH为7.0时亚硒酸盐的还原率，由此说明pH 7.0是菌株SSJ合成纳米硒的最佳pH条件；当pH过高或过低时，菌株对亚硒酸盐的还原率相对较低，并不利于纳米硒的合成。
实施例6：菌株SSJ合成纳米硒的SEM图。
将培养基在115℃条件下高压灭菌15min，向液体培养基中加入亚硒酸钠使其终浓度为50mmol/L，接入2％(V/V)菌液培养。取2mL对数生长期末期菌液在8000±500r/min条件下离心5±1min，离心后的沉淀用PBS清洗2遍，将清洗后离心得到的沉淀先后用30％、50％、70％、90％乙醇进行重悬、离心(8000r/min，5min)，最后得到的沉淀用100％乙醇溶液重悬。将处理好的样品进行扫描电镜(Scanning Electron Microscope，SEM)表征，图6为该菌株合成的纳米硒形貌。该菌株合成的硒纳米颗粒为球形，具有较好的分散性，平均粒径为332.3nm，粒径最大为164nm，最小为615nm。
实施例7：菌株SSJ合成纳米硒的抗菌性
选取Staphylococcus aureus(革兰氏阳性菌)和Escherichia coli(革兰氏阴性菌)，对菌株SSJ合成的纳米硒的生物毒性进行研究。利用纸片分散法评价该菌株合成的硒纳米颗粒的抑菌活性，具体方法如下。
将培养基在115℃条件下高压灭菌15min，向培养基中加入亚硒酸钠使其终浓度为50mmol/L，接入2％(V/V)菌液培养3天。将培养后溶液于10000r/min，10min条件下离心，离心后沉淀加入少量去离子水重悬后超声破碎30min，破碎后得到的溶液于2000r/min，5min条件下离心，取上清液于10000r/min，10min条件下离心，经离心后沉淀干燥制成粉末后加少量去离子水溶解得高浓度纳米硒溶液。分别将上述革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌培养加入于121℃条件下高温灭菌20min后的液体培养基中培养至稳定期，各取100μL菌液均匀涂布在琼脂培养基上。随后，分别将滴有等量去离子水、5mg/L四环素、1mol/L亚硒酸钠溶液和1mol/L制得的纳米硒溶液的纸片放置在琼脂平板上，于30℃条件下培养24h后观察是否出现抑菌圈，通过抑菌圈大小判断纳米硒抗菌能力。
图7(a)琼脂培养基上涂布金色葡萄球菌，图7(b)琼脂培养基上涂布大肠杆菌。如图7(a)、(b)所示，以滴加水的纸片为空白对照组，滴加纳米硒的纸片周围未观察到明显的抑菌圈，而亚硒酸钠和四环素周围则出现了明显的抑菌圈。菌株SSJ合成的SeNPs在两组实验中均没有显示出明显的抗菌性，证明生物合成的SeNPs具有较低的毒性和良好的生物相容性。
以上所述仅为本发明较佳的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 大连理工大学
<120> 一种脱氮副球菌及其制备纳米硒的方法
<130> LQ211Gbw034
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1402
<212> DNA
<213> 脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)
<400> 1
tggctcagaa cgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca agtcgagcga acccttcggg 60
gttagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaatatgccc tttgctacgg aatagccccg 120
ggaaactggg agtaataccg tatacgccct ttgggggaaa gatttatcgg caaaggatta 180
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acacctaacg gattaagcat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa aactcaaagg 840
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accttaccaa cccttgacat cgcaggaccg ctccagagat ggagttttct cgtaagagac 960
ctgtggacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttc ggttaagtcc 1020
ggcaacgagc gcaacccaca ctcttagttg ccagcatttg gttgggcact ctaagagaac 1080
tgccgatgat aagtcggagg aaggtgtgga tgacgtcaag tcctcatggc ccttacgggt 1140
tgggctacac acgtgctaca atggtggtga cagtgggtta atccccaaaa gccatctcag 1200
ttcggattgg ggtctgcaac tcgaccccat gaagttggaa tcgctagtaa tcgcggaaca 1260
gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgggagt 1320
tgggtctacc cgacggccgt gcgctaacca gcaatggagg cagcggacca cggtaggctc 1380
agcgactggg gtgaagtcgt aa 1402

Claims (6)

1.一株脱氮副球菌，其特征在于，所述脱氮副球菌为Paracoccus sp.SSJ，所述脱氮副球菌菌株保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.22537，保藏日期为2021年5月17日。
2.一种根据权利要求1所述的脱氮副球菌制备纳米硒的方法，其特征在于，用磷酸盐缓冲溶液将培养基的pH分别调至5.0～8.0，所述培养基经115℃，0.15MPa灭菌后加入终浓度为1～80mmol/L的亚硒酸钠，接入2～3％(V/V)脱氮副球菌菌液，在29.5～30.5℃，145～155r/min条件下培养3～5天。
3.根据权利要求2所述的脱氮副球菌制备纳米硒的方法，其特征在于，用磷酸盐缓冲溶液将培养基的pH分别调至5.0～8.0，所述培养基经115℃，0.15MPa灭菌后加入终浓度为20～80mmol/L的亚硒酸钠，接入2～3％(V/V)所述脱氮副球菌菌液，在29.5～30.5℃，145～155r/min条件下培养3～5天。
4.根据权利要求2～3中任一项所述的脱氮副球菌制备纳米硒的方法，其特征在于，所述培养基的组成为：葡萄糖4g/L、(NH4)2SO4 1g/L、K2HPO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、NaCl15g/L、去离子水。
5.根据权利要求2～3中任一项所述的脱氮副球菌制备纳米硒的方法，其特征在于，所述脱氮副球菌菌液的制备方法包括：经过稀释涂布平板法，将所述脱氮副球菌均匀涂布在固体培养基上，于29.5～30.5℃条件下培养；选取一个长势较好的单菌落转移至液体培养基中进行培养，在29.5～30.5℃，145～155r/min条件下培养获得所述脱氮副球菌菌液；所述固体培养基包括：葡萄糖4g/L、(NH4)2SO4 1g/L、K2HPO4 1g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、NaCl15g/L、琼脂20g/L；所述液体培养基包括：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、去离子水。
6.根据权利要求2～3中任一项所述的脱氮副球菌制备纳米硒的方法，其特征在于，还包括分离纳米硒的步骤，具体如下：
将培养获得的溶液于9500～10500r/min条件下离心9～11min，离心后取沉淀加入去离子水重悬后破碎，破碎后得到的溶液于1500～2500r/min，4～6min条件下离心，取上清液于9500～10500r/min，9～11min条件下离心，再取沉淀干燥后制成纳米硒粉末。
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