CN113174358A - 一种生物纳米碲及其利用恶臭假单胞菌的生物合成方法与应用 - Google Patents

一种生物纳米碲及其利用恶臭假单胞菌的生物合成方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物纳米碲及其利用恶臭假单胞菌的生物合成方法与应用，制备方法包括首先将恶臭假单胞菌接种于培养基中，并进行培养，得到菌浊液；之后将菌浊液与亚碲酸盐混合并继续培养，所得发酵产物经分离纯化，即得到生物纳米碲。与现有技术相比，本发明利用微生物合成纳米碲颗粒，具有效率高、操作简单、成本低廉、环境友好、应用广泛等优势；相较物理与化学合成方法，可有效避免二次污染和能耗高等问题，其产物可应用于环境修复、医学诊治、工业制造等诸多领域，同时也为亚碲酸盐环境污染修复提供了新思路。

Description

一种生物纳米碲及其利用恶臭假单胞菌的生物合成方法与 应用
技术领域
本发明属于生物纳米材料技术领域，涉及一种生物纳米碲及其利用恶臭假单胞菌的生物合成方法与应用。
背景技术
碲(Tellurium，Te)为元素周期表中第52号元素，属于一种非金属元素。最早于1782年在含金矿石中被发现，并且由于在地壳中的平均丰度值很低，碲也被称为“分散元素”。自然界中，碲矿物的存在形式主要是以碲化合物的形式存在。单质碲的应用场景十分广泛，在冶金工业中向合金中添加工业纯的碲，可改变钢的机械加工性能，延长寿命；向铅(锡或铝)合金中添加碲可以增加抗腐蚀性能、硬度及弹性。在化学工业中，碲被用作石油裂解催化剂的添加剂、橡胶与乙醇生产的二次催化剂等。半导体碲化铋可用于温差电器件，具有高电导率和高有效质量，具备良好的制冷性能，可作为氟利昂的代替品。此外，碲的化合物还可用于其它领域，如生产玻璃着色剂、陶瓷、塑料、印染、油漆、护肤药品、医药(抑菌剂)等。近年来，碲在生物医药方面的应用逐渐增加，如碲化物被大量用于病理快速检测，碲纳米颗粒也作为抗癌剂，用于癌症治疗。
随着人类对碲的应用增加，环境中碲污染也日益严重；其4价状态的亚碲酸盐具有剧毒，对环境中微生物及动植物的危害严重。利用微生物转化合成纳米碲的工艺可利用环境中的废弃碲资源，将其转化为可广泛应用的高附加值的纳米碲颗粒。相比于化学法合成纳米碲颗粒的方法，生物合成生产的纳米碲与化学合成纳米碲的性质类似，但结构更稳定，生物活性高，合成过程更环保，可同时实现含碲污水的有效处理，具有较高的开发利用价值。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种生物纳米碲及其利用恶臭假单胞菌的生物合成方法与应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种利用恶臭假单胞菌生物合成纳米碲的方法，包括以下步骤：
1)菌种活化：将恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440接种于培养基中，并进行培养，得到菌浊液；
2)纳米碲的生物合成：将菌浊液与亚碲酸盐混合并继续培养，所得发酵产物经分离纯化，即得到生物纳米碲。
进一步地，步骤1)包括以下步骤：
1-1)将恶臭假单胞菌的单菌落接种于种子培养基，并摇床培养12-48h，得到种子液；
1-2)将种子液以0.5-2.0vol％的接种量接种于生长培养基中，并摇床培养至菌液OD600＝1.0-4.0(培养时间为4-8h)，即得到菌浊液。
进一步地，步骤2)中，混合过程包括：将菌浊液以0.5-2.0vol％的接种量接种于含有亚碲酸盐的培养基中，并摇床培养至菌液OD600＝1.0-4.0；或者，将菌浊液与亚碲酸盐溶液混合。
进一步地，所用培养基均包括LB培养基与M9培养基，所述的LB培养基包括5-15g/LNaCl，5-15g/L胰蛋白胨，2-8g/L酵母提取物；
所述的M9培养基包括0.5-1.5g/L NH4Cl，5-10g/L Na2HPO4，1-5g/L KH2PO4；制备方法包括：将含0.5-1.5g/L NH4Cl，5-10g/L Na2HPO4，1-5g/L KH2PO4的水溶液(pH 7.4)，在110-130℃下高压灭菌10-30min，之后分别加入终浓度为1-3mM MgSO4，0.1-0.4wt％葡萄糖，以及0.5-2.0mM CaCl2混合均匀，即得到所述的M9培养基。
进一步地，步骤1)中，所述的摇床培养中，培养温度均为25-35℃，摇床转速均为200-250rpm；
步骤2)中，培养条件包括培养温度为30℃，摇床转速为220rpm，培养时间为12-48h。恶臭假单胞菌的最适生长温度为25℃-30℃，作为需氧菌30℃，220rpm的摇床转速可以促进培养液中氧气含量的提升，进而可以提高菌株的代谢能力，促进亚碲酸盐的快速还原。
进一步地，步骤2)中，所述的亚碲酸盐加入后，所得发酵培养基中，亚碲酸盐的浓度为50-300mg/L。所述的亚碲酸盐包括亚碲酸钾或亚碲酸钠等可溶性亚碲酸盐。亚碲酸盐浓度过低，纳米颗粒的产量较低，合成的纳米棒长度较短；亚碲酸盐浓度过高，会抑制菌株对亚碲酸盐的还原率，成本增加，纳米棒长度均一性下降，长度间的极差加大。
进一步地，步骤2)中，所述的发酵产物的分离纯化过程包括：
2-1)将发酵产物于室温下离心分离，并去除上清液，之后加入生理盐水重悬沉淀，并超声破碎细胞；
2-2)离心取上清液，并萃取，之后再进行离心，去除上清液，并采用水重悬洗涤；
2-3)加入洗涤液并依次经过煮沸、离心后，去除上清液，之后采用乙醇重悬洗涤沉淀，干燥后即得到所述的生物纳米碲。
更进一步地，步骤2-1)中，所述的离心分离中，离心转速为3000-4000rpm，离心时间为10-30min；所述的超声破碎细胞中，超声功率为150-300W，破碎时间为10-30min；
步骤2-2)中，第一次离心过程中，离心转速为3000-4500rpm，离心时间为10-30min；萃取过程中，萃取剂包括正辛醇，萃取剂用量为上清液体积的2-4倍，萃取温度为1-6℃，萃取时间为12-20h；第二次离心过程中，离心转速为12000-20000rpm，离心时间为10-30min；
步骤2-3)中，所述的洗涤液中，包括含100-300mM Tris-HCl与2-6wt％十二烷基硫酸钠(SDS)，pH为6-8，用量为80-150μL/40mg固体沉淀；煮沸过程中，煮沸时间为3-10min；离心过程中，离心转速为10000-15000rpm，离心时间为10-30min；干燥过程中，干燥温度为60℃。
一种生物纳米碲，采用如上所述的方法制备而成。
一种生物纳米碲的应用，包括将所述的生物纳米碲应用于生物传感器、抑菌试剂、抗肿瘤药物、肿瘤检测试剂或半导体材料中。
本发明还涉及上述方法所制备的生物纳米碲的性质分析：所制备出的生物合成纳米碲具有优良的性状，扫描电镜下观察，所得纳米碲呈柱状，长度为200-1000nm。圆柱状纳米碲颗粒可在近红外区域表现出很强的光吸收，拥有着更优良的光热转换效率，更有利于癌症的光热辅助治疗。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1)本发明利用微生物合成纳米碲颗粒，具有效率高、操作简单、成本低廉、环境友好、应用广泛等优势；相较物理与化学合成方法，可有效避免二次污染和能耗高等问题，其产物可应用于环境修复、医学诊治、工业制造等诸多领域，同时也为亚碲酸盐环境污染修复提供了新思路；
2)相较于重金属结合蛋白制备纳米颗粒的方法中，所采用的含有外源基因的基因工程菌株，本发明可采用野生型的假单胞菌KT2440菌株直接制备纳米碲材料，所用菌株源于自然环境，未经基因改造，环境生态占位小，环境友好，可有效避免潜在的生物安全威胁，并且在常见亚碲酸盐污染浓度下，还可实现90％以上的还原效率，因而具有较高的发展潜力；
3)本发明利用恶臭假单胞菌KT2440生物合成纳米碲颗粒，该菌株具备还原亚碲酸盐效能高、周期短、稳定性好的特点，同时具有生物安全、环境友好等优势，使得本发明在环境修复、高附加值产品生产等方面具有较好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中菌株KT2440添加不同浓度的亚碲酸盐时，菌株对亚碲酸盐的转化率对比图；
图2为实施例2中菌株KT2440添加100mg/L亚碲酸盐时，菌株的透射电子显微镜图像；
图3为实施例3中菌株KT2440添加不同浓度的亚碲酸盐时，扫描电镜拍摄合成纳米碲的形态特征；
图4为实施例4中菌株KT2440添加300mg/L亚碲酸盐时，菌株合成的纳米碲的能谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
一种利用恶臭假单胞菌生物合成纳米碲的方法，包括以下步骤：
S1：将恶臭假单胞菌KT2440的单菌落接种于种子培养基，并在25-35℃，200-250rpm的条件下摇床培养12-48h(优选OD600＝4.0)，得到种子液；
S2：将种子液以0.5-2.0vol％的接种比例接种于生长培养基中，并在25-35℃，200-250rpm的条件下摇床培养至菌液OD600＝1.0-4.0(优选OD600＝4.0)，得到菌浊液；
S3：向菌浊液中加入亚碲酸钾、亚碲酸钠等可溶性亚碲酸盐，并使其浓度为50-300mg/L，之后继续在25-35℃，200-250rpm的条件下培养12-48h，得到发酵产物；
其中，种子培养基及生长培养基均为LB培养基或M9培养基，LB培养基包括5-15g/LNaCl，5-15g/L胰蛋白胨，2-8g/L酵母提取物，溶剂为去离子水，使用前于121℃下高压灭菌20min；
M9培养基的制备方法包括：将含0.5-1.5g/L NH4Cl，5-10g/L Na2HPO4，1-5g/LKH2PO4的水溶液(pH 7.4)，在110-130℃下高压灭菌10-30min，之后分别加入终浓度为1-3mMMgSO4，0.1-0.4wt％葡萄糖，以及0.5-2.0mM CaCl2混合均匀，即得到M9培养基；
S4：将发酵产物于室温下以3000-4000rpm的转速离心分离10-30min，并去除上清液，之后加入生理盐水重悬沉淀，并以150-300W的超声功率超声破碎细胞10-30min；
S5：以3000-4500rpm的转速离心处理10-30min，取上清液，并在1-6℃下采用2-4倍体积的正辛醇萃取12-20h，之后再以12000-20000rpm的转速离心处理10-30min，去除上清液，并采用水重悬洗涤；
S6：加入洗涤液并煮沸3-10min，之后以10000-15000rpm的转速离心分离10-30min，去除上清液，之后采用乙醇重悬洗涤沉淀，再在60℃干燥后即得到生物纳米碲；
其中，洗涤液中含100-300mM Tris-HCl与2-6wt％十二烷基硫酸钠且pH为6-8，用量为80-150μL/40mg固体沉淀。
此外，步骤S1-S3中，发酵产物的制备方法还可采用以下步骤：
A1：将恶臭假单胞菌的单菌落接种于培养基，并摇床培养12-48h(优选OD600＝4.0)，得到菌浊液；
A2：将菌浊液以0.5-2.0vol％的接种量接种于含有亚碲酸盐的培养基中，并摇床培养至菌液OD600＝1.0-4.0(优选OD600＝4.0)。
以下实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：恶臭假单胞菌KT2440对不同浓度亚碲酸盐的还原率
一种利用恶臭假单胞菌生物合成纳米碲的方法，包括以下步骤：
S1：将恶臭假单胞菌KT2440菌株挑取单菌落接种于5mL种子培养基，并在30℃，220rpm的条件下摇床培养12h，得到5mL种子液；
S2：将种子液以1％(v/v)的比例接种于300mL生长培养基中，并在30℃，220rpm的条件下摇床培养，得到不同菌液OD600的菌浊液(菌液OD600＝0.3，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，5.0)；
其中，种子培养基及生长培养基均为LB培养基，具体包括10g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，溶剂为去离子水，使用前于121℃下高压灭菌20min；
S3：将菌浊液离心后，用等体积新鲜LB培养基重悬细胞沉淀，之后向菌浊液中加入过滤灭菌后的1％的亚碲酸钾水溶液，使其终浓度分别为50，100，150，200，300mg/L，再继续在30℃，220rpm的条件下培养24h，得到发酵产物；
S4：将发酵产物于室温下以3700rpm的转速离心分离20min，并去除上清液，之后采用生理盐水反复重悬沉淀并离心5次，再采用超声破碎仪以200W的超声功率超声破碎细胞20min；
S5：室温下，以3700rpm的转速离心处理20min，取上清液，并在4℃下采用4倍体积的正辛醇萃取16h，之后再以16000rpm的转速离心处理15min，去除上清液，并采用去离子水重悬洗涤；
S6：加入洗涤液并煮沸5min，之后以12000rpm的转速离心分离20min，去除上清液，之后采用无水乙醇重悬洗涤沉淀，再在60℃烘箱内干燥后即得到高纯度、分散性好、易检测的生物纳米碲；
其中，洗涤液中含200mM Tris-HCl与4wt％十二烷基硫酸钠且pH为7，用量为100μL/40mg固体沉淀。
本实施例还包括根据亚碲酸盐残留量计算恶臭假单胞菌KT2440转化亚碲酸盐为纳米碲的转化效率，具体包括以下步骤：
1)取3份步骤S3中的发酵产物，并以12000rpm的转速离心处理3min，收集上清液，记为发酵上清液；
2)取50μL发酵上清液，加入150μL 0.5M Tris-HCl(pH 7.0)溶液与50μL 10mMDDTC(二乙基二硫代氨基甲酸钠三水)溶液，混合均匀后于室温下搅拌反应30min，之后利用酶标仪测定其在340nm的吸光度，根据亚碲酸盐浓度与吸光值的标准曲线，即计算得到发酵产物的亚碲酸盐含量。
结果如图1所示，从图中可以看出，菌株KT2440对亚碲酸盐的转化效率随细胞的OD值增加而增高。在高OD600情况下(OD600≧3.0)，菌株在24小时内可还原87.5％以上的150mg/L亚碲酸盐，生成纳米碲约62.1mg/L；对100mg/L亚碲酸盐的还原率超过92.7％，生成纳米碲约43.8mg/L。尽管菌株对极高浓度的亚碲酸盐(300mg/L)的转化效率仅75.1％，但纳米碲颗粒的产量可高达106.5mg/L。因此，恶臭假单胞菌T2440可有效还原与转化不同浓度的亚碲酸盐，24小时内其纳米碲的合成量较高；高OD600水平有助于菌株对亚碲酸盐的还原与纳米碲颗粒的合成。
实施例2：恶臭假单胞菌KT2440生物合成纳米碲的分布
实验过程包括以下步骤：
S1：配制900mL M9培养基(含1.0g/L NH4Cl，6.0g/L Na2HPO4，3.0g/L KH2PO4，pH＝7.4)，并在121℃下高压灭菌20min，之后分别加入终浓度为2mM的MgSO4，0.2wt％葡萄糖，以及1mM CaCl2混合均匀；
S2：挑取恶臭假单胞菌KT2440单菌落，接种于3mL M9培养基中，并于30℃，200rpm下摇床培养12h(菌液OD600＝4.0)，得到种子液；将种子液按接种比例1％(v/v)转接到含有100mg/L亚碲酸盐的300mL M9培养基中，摇床培养至OD600＝4.0；取10mL发酵产物，以8000rpm离心10分钟，之后用纯水重悬细胞；
S3：将重悬后的细胞放置于铜网上，使用透射电子显微镜(FEI Talos F200X)观察。结果如图2所示，恶臭假单胞菌合成的纳米碲颗粒呈柱状，直径为30-80nm，长度为200-1000nm。
实施例3：恶臭假单胞菌KT2440纳米碲的产物提取与扫描电镜拍摄
一种利用恶臭假单胞菌生物合成纳米碲的方法，包括以下步骤：
S1：配制同实施例2中步骤S1得到的混合M9培养基，挑取恶臭假单胞菌KT2440单菌落，接种于5mL M9培养基中，并于30℃，200rpm下摇床培养12h，得到5mL种子液；将种子液再按1％(v/v)接种比例分别转接到含有0.1mM，0.3mM，0.5mM，1.0mM亚碲酸盐的四组100mL M9培养基中，摇床培养至OD600＝4.0，得到发酵产物；
S2：将发酵产物于室温下以3700rpm的转速离心分离20min，并去除上清液，之后采用生理盐水反复重悬沉淀并离心3次，之后采用1.5mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)重悬细胞，再采用超声破碎仪以200W的超声功率超声破碎细胞20min；
S3：室温下，以3700rpm的转速离心处理20min，取上清液，并在4℃下采用4倍体积的正辛醇萃取16h，之后再以12000rpm的转速离心处理15min，去除上清液，并采用去离子水重悬洗涤3次；
S4：加入洗涤液并煮沸5min，之后以12000rpm的转速离心分离20min，去除上清液，之后采用无水乙醇重悬洗涤沉淀，再在60℃烘箱内干燥后即得到高纯度、分散性好、易检测的生物纳米碲；
其中，洗涤液中含200mM Tris-HCl与4wt％十二烷基硫酸钠且pH为7，用量为100μL/40mg固体沉淀。
本实施例还包括将所得纳米碲单质用无水乙醇重悬后，吸取悬液至硅片上并均匀涂抹，之后置于烘箱烘干，再使用扫描电镜(RISE-MAGNA)观察。如图3所示，恶臭单胞菌还原不同浓度的亚碲酸盐所生成的碲纳米颗粒表面结构一致。
实施例4：恶臭假单胞菌KT2440合成纳米碲的材料特征鉴定
本实施例采用研磨皿将实施例3所制备的碲纳米颗粒研磨至小尺度；研磨后制成均一悬液并加入离心管内，室温下以12000rpm离心10分钟；去除上清液后，置于烘箱中烘干，即获得大小均一的碲纳米颗粒。
如图4所示为上述碲纳米颗粒的XPS检测图(AXIS UltraDLD)，价态分析结果显示恶臭假单胞菌KT2440还原亚碲酸盐的产物为纳米碲颗粒。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用恶臭假单胞菌生物合成纳米碲的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1)将恶臭假单胞菌接种于培养基中，并进行培养，得到菌浊液；
2)将菌浊液与亚碲酸盐混合并继续培养，所得发酵产物经分离纯化，即得到生物纳米碲。
2.根据权利要求1所述的一种利用恶臭假单胞菌生物合成纳米碲的方法，其特征在于，步骤1)包括以下步骤：
1-1)将恶臭假单胞菌的单菌落接种于种子培养基，并摇床培养12-48h，得到种子液；
1-2)将种子液以0.5-2.0vol％的接种量接种于生长培养基中，并摇床培养至菌液OD600＝1.0-4.0，即得到菌浊液。
3.根据权利要求1所述的一种利用恶臭假单胞菌生物合成纳米碲的方法，其特征在于，步骤2)中，混合过程包括：将菌浊液以0.5-2.0vol％的接种量接种于含有亚碲酸盐的培养基中，并摇床培养至菌液OD600＝1.0-4.0；或者，
将菌浊液与亚碲酸盐溶液混合。
4.根据权利要求1至3任一项所述的一种利用恶臭假单胞菌生物合成纳米碲的方法，其特征在于，所用培养基均包括LB培养基与M9培养基，所述的LB培养基包括5-15g/L NaCl，5-15g/L胰蛋白胨，2-8g/L酵母提取物；所述的M9培养基包括0.5-1.5g/L NH4Cl，5-10g/LNa2HPO4，1-5g/L KH2PO4。
5.根据权利要求1所述的一种利用恶臭假单胞菌生物合成纳米碲的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的摇床培养中，培养温度均为25-35℃，摇床转速均为200-250rpm；
步骤2)中，培养条件包括培养温度为30℃，摇床转速为220rpm，培养时间为12-48h。
6.根据权利要求1所述的一种利用恶臭假单胞菌生物合成纳米碲的方法，其特征在于，步骤2)中，在混合后得到的发酵培养基中，所述的亚碲酸盐的浓度为50-300mg/L。
7.根据权利要求1所述的一种利用恶臭假单胞菌生物合成纳米碲的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的发酵产物的分离纯化过程包括：
2-1)将发酵产物于室温下离心分离，并去除上清液，之后加入生理盐水重悬沉淀，并超声破碎细胞；
2-2)离心取上清液，并萃取，之后再进行离心，去除上清液，并采用水重悬洗涤；
2-3)加入洗涤液并依次经过煮沸、离心后，去除上清液，之后采用乙醇重悬洗涤沉淀，干燥后即得到所述的生物纳米碲。
8.根据权利要求7所述的一种利用恶臭假单胞菌生物合成纳米碲的方法，其特征在于，步骤2-1)中，所述的离心分离中，离心转速为3000-4000rpm，离心时间为10-30min；所述的超声破碎细胞中，超声功率为150-300W，破碎时间为10-30min；
步骤2-2)中，第一次离心过程中，离心转速为3000-4500rpm，离心时间为10-30min；萃取过程中，萃取剂包括正辛醇，萃取剂用量为上清液体积的2-4倍，萃取温度为1-6℃，萃取时间为12-20h；第二次离心过程中，离心转速为12000-20000rpm，离心时间为10-30min；
步骤2-3)中，所述的洗涤液中，包括100-300mM Tris-HCl与2-6wt％十二烷基硫酸钠，pH为6-8，用量为80-150μL/40mg固体沉淀；煮沸过程中，煮沸时间为3-10min；离心过程中，离心转速为10000-15000rpm，离心时间为10-30min；干燥过程中，干燥温度为60℃。
9.一种生物纳米碲，其特征在于，其采用如权利要求1至8任一项所述的方法制备而成。
10.一种如权利要求9所述的生物纳米碲的应用，其特征在于，所述的生物纳米碲在生物传感器、抑菌试剂、抗肿瘤药物、肿瘤检测试剂或半导体材料中的应用。
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