CN116333938A - 海洋细菌及其在生物纳米硒制备中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物与新医药技术领域，具体为海洋细菌及其在生物纳米硒制备中的应用，海洋细菌为Shewanellasp.FDL‑2，以保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学，保藏时间为2020年12月16日，菌种保藏号：CCTCCM2020910。该海洋细菌及其在生物纳米硒制备中的应用，其获得的纳米硒是通过微生物方法获得，本方法绿色高效且环境友好，得到的生物纳米硒尺寸均匀且产出稳定，具有潜在的规模化前景，与此同时，本发明获得微生物与陆源微生物相比，海洋微生物能够适应高盐、低温和寡营养的恶劣条件，抗逆性较强，更具实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物与新医药技术领域，具体为海洋细菌Shewanella sp.FDL-2在生物纳米硒制备中的应用。
背景技术
硒是人体所必须的微量元素之一，具有非常重要的生理作用。硒不仅可以作为人体内各种硒蛋白催化活性位点的辅助因子，还可以为细胞和组织提供保护以减轻其氧化还原压力；此外，硒可以调节体内碘和自由基的水平，从而增强生物体的抵抗力。硒元素的缺失可能会导致人体心脏、骨骼、肌肉和免疫相关的紊乱，适量摄入硒补充剂可以大幅度降低这些疾病发生的概率。因此，硒材料的开发在生物医学领域引起了越来越多的重视。在众多硒补充剂中，纳米硒材料比其他硒类化合物有明显的优势。硒纳米材料具有与亚硒酸钠相似的生物利用度但其毒性更低。此外，硒纳米材料的多价表面使得它们可以通过共价键和非共价键与各种化合物进行相互作用，从而达到更好的应用效果。
生物纳米硒是通过细菌等微生物合成获得的一种纳米级单质硒，与无机和有机纳米硒相比，生物纳米硒具有颗粒小、状态稳定、容易被作物吸收、生物转化效率高及活性强等特点，具有更加广阔的应用前景。目前已报道的生物纳米硒制备细菌多为陆生细菌，目前仅有少数海洋细菌用于硒还原的报道。与陆地相比，海洋环境具有高盐、高压、低温和寡营养的特征。与陆源微生物相比，海洋微生物长期适应复杂的海洋环境而生存，有其独具的特性，能够更好的实现产业化和规模化，更具有实用价值。因此，开发基于海洋细菌的生物纳米硒制备技术意义深远。
发明内容
本发明的目的在于提供本发明目的在于保护海洋细菌Shewanella sp.FDL-2及其在生物纳米硒制备中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
将海洋细菌Shewanella sp.FDL-2(菌种保藏号：CCTCC M 2020910)在最适生长条件下(温度25-35℃，盐度2％-3％，碳源乳酸钠，pH 7-8)于2216E培养基中培养，用无机盐培养基洗涤两次，加入含1-10mmol Se(IV)的无机盐溶液中，菌液终浓度OD 600约为0.3，厌氧曝气15min，室温下即可发生还原反应。
在无机盐培养基中的反应条件为：20-40℃反应温度(30℃最优)、1-3％盐度和pH5-10，并在电子供体存在下对Se(IV)进行还原0.1-72h，将反应得到的混合物离心，随后将沉积物置于去离子水中超声处理，再次离心后将沉淀干燥，所得粉状颗粒即为制备的生物纳米Se0。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
该海洋细菌及其在生物纳米硒制备中的应用
本发明获得的纳米硒是通过微生物方法获得，本方法绿色高效且环境友好；得到的生物纳米硒尺寸均匀且产出稳定，具有潜在的规模化前景。
与此同时，本发明获得微生物与陆源微生物相比，海洋微生物能够适应高盐、低温和寡营养的恶劣条件，抗逆性较强，更具实用价值。
附图说明
图1为本发明实施例提的Shewanella sp.FDL-2在不同培养基体积、碳源、盐度和pH值下生长情况，其中，A为体积，B为碳源，C为盐度，D为pH；
图2为本发明实施例提的Shewanella sp.FDL-2在48h内对100-800mM Se(IV)耐受图。其中，A为初始，B为24h，C为48h；
图3为本发明实施例提的Se(IV)还原速率图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-3，本发明提供以下技术方案：
实施例1
取0.1g海草床根际沉积物，接种到2216E培养基中中于摇床(150rpM)37℃过夜培养，以平板涂布法筛选得多株纯菌。进一步以含Se(IV)的无机盐培养基为测试体系，筛选能够将Se(IV)还原为Se0(表观上可以从无色变红色或黑色)的菌株用于后续研究。
基于以上背景，本发明以东营地区的海草床根际沉积物为菌源，筛选到一株具有Se(IV)还原能力的海洋土著细菌，命名为FDL-2，经鉴定为希瓦式菌属(Shewanella sp.)，菌种保藏号为CCTCC M 2020910。
实施例2
将上述获得菌株FDL-2在超净台中，加入分别含有100、200、300、400和500毫升2216E培养基的500毫升锥形瓶中(培养基体积)和分别以碳源(甲酸钠、乙酸钠、丙酮酸钠、葡萄糖和乳酸钠)，盐度(0、0.5％、1％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％和5％)和培养基pH(3、5、6、7、8和10)为唯一变量灭菌后的100ml无机盐培养基中，30℃摇床恒温培养，每隔一个半小时取样分析细胞浓度，用紫外可见分光光度计测其OD600，绘制生长曲线。
所述无机盐培养基为每升0.5g NH4Cl,0.5g KCl,0.85g MgCl2·6H2O,5.67gHEPS，余量为去离子水。
如图1a所示，在相同的初始浓度下，细菌的生长速度与培养基体积成反比；如图1b所示，中性pH值是最适合FDL-2生长的pH值，培养16小时后测量培养基上清液的pH值为7.79；如图1c所示，乳酸钠(甲酸钠＝葡萄糖<乙酸钠<丙酮酸钠<乳酸钠)与其他碳源相比，最适合FDL-2生长；如图1d所示，FDL-2可以在0-5％的盐度内生长，其中3％的盐度是最佳的。在这些条件下，均可观察到反应体系颜色的变化，暗示了纳米硒固体颗粒(红棕色)的形成。
FDL-2还原Se(IV)的所用到的无机盐培养基制备方法为：量取1.54ml乳酸钠(2g)、30g NaCl、0.5g NH4Cl,0.5g KCl,0.85g MgCl2·6H2O,5.67g HEPS溶于1L无菌水中，调节pH值为7.79。
实施例3
以无菌的15mL离心管为容器，在无菌超净台中分别再分别称取263.0mg、526.0mg、789.0mg、1052mg、1315mg、1578mg、1841mg、2104mg五水亚硒酸钠，再加入灭菌冷却的无机盐培养基至总体积为9ml，用0.45微米的水系滤膜过滤除菌后，再向各管中加入1ml已活化菌种，配置出浓度分别为100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L、400mmol/L、500mmol/L、600mmol/L、700mmol/L、800mmol/L的亚硒酸钠耐受体系。将耐受体系放于30℃恒温培养箱中恒温培养，观察耐受体系中的颜色变化。
所述无机盐培养基为每升，1.54ml乳酸钠(2g)、30g NaCl、0.5g NH4Cl,0.5g KCl,0.85g MgCl2·6H2O,5.67g HEPS溶于1L无菌水中，调节pH值为7.79。
由图2b可知，在24h时，只有100mmol/L发生颜色变化，在48h时，100mmol/L、200mmol/L均由无色透明变为红色。由此断定，48小时内100-200mmol Se(IV)可通过FDL-2细胞制备生物纳米Se0。
实施例4
将菌株FDL-2加入2216E培养基中，摇床(150rpm，30℃C)扩大培养10小时；离心(5分钟，8,000rpm)并清洗两次，重新悬浮在分别含有Se(IV)(1、5和10mM)的无菌MSM培养基中，FDL-2细胞的最终浓度为0.3(OD600)；用无菌针头和注射器定期取样，用紫外分光光度计法，分别在490nm和500nm处测量Se(IV)和Se0浓度，结果如图3所示。
由图3可知，FDL-2对Se(IV)有吸附作用，在Se(IV)浓度为1mM时，菌株FDL-2可以在12小时内产出1mM的生物纳米硒；并且在5和10mM Se(IV)还原体系中，24小时内生物纳米硒的产生率分别为93.2％和82％，且产生速率明显高于1mM体系，这些数据可为后续中试实验提供支撑数据。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种海洋细菌，其特征在于，海洋细菌为Shewanella sp.FDL-2，以保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学，保藏时间为2020年12月16日，菌种保藏号：CCTCC M2020910。
2.按权利要求1所述的海洋细菌，其特征在于，其最适生长条件为：温度25-35℃，盐度2％-3％，碳源乳酸钠，pH 7-8。
3.海洋细菌在生物纳米硒制备中的应用，其特征在于：所述海洋细菌在还原Se(IV)的应用，所述产物为生物纳米Se0。
4.按权利要求3所述的海洋细菌在生物纳米硒制备中的应用，其特征在于：所述将海洋细菌于无机盐培养基中在为20-40℃反应温度、1-3％盐度和pH 5-10，并在电子供体存在下对Se(IV)进行还原0.1-72h从而得回收生物纳米Se0。
5.按权利要求3所述海洋细菌在生物纳米硒制备中的应用，其特征在于：所述海洋细菌在还原Se(IV)制备生物纳米Se0中的应用。
6.一种生物纳米Se0，其特征在于：采用所述海洋细菌在含Se(IV)的无机盐培养基中培养，离心干燥得制备的生物纳米Se0。
7.按权利要求6所述的生物纳米Se0，其特征在于：
1)将所述海洋细菌在含硒的无机盐培养基中30-35℃避光反应0.1-72h的混合物；
2)将步骤1)中得到的混合物离心，将得到的沉淀置于去离子水中超声处理，再次离心将沉淀干燥，所得粉状颗粒即为制备的生物纳米Se0。
8.按权利要求7所述的生物纳米Se0的制备方法，其特征在于：采用所述海洋细菌在含Se(IV)的无机盐培养基中培养，离心干燥得制备的生物纳米Se0。
9.按权利要求8所述的生物纳米Se0的制备方法，其特征在于：
1)将所述海洋细菌在含Se(IV)的无机盐培养基中30-35℃避光反应0.1-72h的混合物；
2)将步骤1)中得到的混合物离心，将得到的沉淀置于去离子水中超声处理，再次离心将沉淀冷冻干燥，所得粉状固体即为制备的生物纳米Se0。
10.一种权利要求1所述的海洋菌的应用，其特征在于：所述海洋细菌在还原Se(IV)制备生物纳米Se0中的应用。
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|---|---|---|---|---|
| CN114836334A (zh) * | 2021-02-02 | 2022-08-02 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种海洋希瓦式菌株及其用途 |
-
2023
- 2023-04-03 CN CN202310344142.9A patent/CN116333938A/zh active Pending
Cited By (2)
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| CN114836334A (zh) * | 2021-02-02 | 2022-08-02 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种海洋希瓦式菌株及其用途 |
| CN114836334B (zh) * | 2021-02-02 | 2024-04-19 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一种海洋希瓦式菌株及其用途 |
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