CN108048361A

CN108048361A - 科氏葡萄球菌s154及其在生物合成纳米硒中的应用

Info

Publication number: CN108048361A
Application number: CN201711460184.XA
Authority: CN
Inventors: 郭岩彬; 李奎; 张暖暖; 赵桂慎; 吴文良; 李花粉
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2017-12-28
Publication date: 2018-05-18
Anticipated expiration: 2037-12-28
Also published as: CN108048361B

Abstract

本发明提供一种科氏葡萄球菌S154及其在生物合成纳米硒中的应用。本发明从土壤中分离得到一株可耐受极高浓度亚硒酸盐、硒酸盐的科氏葡萄球菌S154(保藏编号：CGMCC No.13328)，利用菌株S154合成生物纳米硒，对生物纳米硒进行分离纯化，大量制备生物纳米硒。采用生物发酵工艺制备纳米硒，具有环境友好，产率高，安全高效等特点，生产获得的生物纳米硒可用于肥料、饲料、富硒功能食品、保健品及医药产品等。

Description

科氏葡萄球菌S154及其在生物合成纳米硒中的应用

技术领域

本发明涉及微生物学及生物纳米硒制备技术领域，具体地说，涉及一种科氏葡萄球菌S154及其在生物合成纳米硒中的应用。

背景技术

硒(Selenium,Se)元素是许多有机体必需的微量元素之一，是生物体内多种含硒酶蛋白的必需组分，并且参与人体多种代谢途径，在提高人体免疫力，抗氧化，保护肝脏、肾脏、心血管，预防糖尿病、甲状腺疾病，抗病毒，抗癌等方面具有不可或缺的作用。中国营养学会及FAO/WHO/IAEA联合专家委员会确定人体摄入量适宜范围为60-250μg/d，安全剂量为400μg/d，中毒剂量为800μg/d。人体缺硒会造成多种疾病，包括克山病、大骨节病等，并增加癌症患病风险。硒过量摄入也会对人体造成严重毒害，包括脱甲、脱发、蹒跚病等。我国具有丰富硒资源，但硒在自然界分布极不均匀，导致我国三分之二以上地区缺硒。因此亟待为缺硒人群开发安全高效硒源。

硒有多种形态，包括负二价、零价、正四价、正六价等。纳米硒有别于灰色单质硒、硒化物、氧化态硒和有机硒等，是一种纳米级别红色单质硒。硒的形态不同，其生物活性和毒性差异很大。纳米硒毒性远低于无机硒和有机硒，其生物活性与有机硒无显著差异。因此开发纳米硒作为补硒源具有明显优势。国内外研究人员对微生物参与的硒的各价态间的转化及纳米硒的形成有较明确的认识。相对于化学或物理方法制备单质硒过程中的高能耗高污染，通过微生物对无机硒转化，可得到更为简便、经济、绿色环保获取单质硒的方法。近十年来，发现大约40个属细菌可以耐受硒盐，并转化硒盐为低毒的红色单质纳米硒。

发明内容

本发明的目的是提供一种科氏葡萄球菌S154及其在生物合成纳米硒中的应用。

为了实现本发明目的，本发明从土壤中分离得到一株可耐受极高浓度亚硒酸盐、硒酸盐的科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)S154，该菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.13328，保藏日期2016年11月22日。

本发明还提供含有所述科氏葡萄球菌S154的菌剂或复合微生物菌剂。

本发明还提供所述科氏葡萄球菌S154在生物合成纳米硒中的应用，向发酵培养基中添加六价和/或四价无机硒盐，发酵培养科氏葡萄球菌S154，并从发酵产物中分离纯化纳米硒。

优选地，所述发酵培养基中六价无机硒盐的浓度为0.001-500mM，更优选10-400mM，例如100mM、200mM、300mM、400mM。

优选地，所述发酵培养基中四价无机硒盐的浓度为0.001-400mM，更优选0.1-300mM，例如100mM、200mM、300mM。

本发明还提供利用所述科氏葡萄球菌S154生物合成纳米硒的方法，将S154菌株活化培养，以LB培养基为发酵培养基，将OD₆₀₀＝0.8-1.2的菌液按照1-5v/v％接菌量接种到发酵罐中，使发酵温度为35-39℃，搅拌速度为150-280rpm，发酵液体积：每分钟通气体积为1：0.5-3，罐压为1.0-1.4F/cm²，发酵60-150小时。

前述方法还包括从发酵产物中分离纯化纳米硒的步骤；具体如下：

方案I：发酵液下罐，3000-10000rpm离心10-20min收集菌体沉淀，将沉淀用无菌生理盐水洗2-3遍，并用发酵液1/30体积的水重悬沉淀，所得菌悬液经冷冻干燥，即得纳米硒干粉。

方案II：a、发酵液下罐，3000-10000rpm离心10-20min收集菌体沉淀，将沉淀用无菌生理盐水洗2-3遍，并用发酵液1/30体积的水重悬沉淀，得到纳米硒悬液；

b、将纳米硒悬液转移至萃取塔中，按照纳米硒悬液0.5-0.8倍体积的量加入正己烷萃取3-5次，收集下层水相，3000-5000rpm离心20-40min，所得沉淀用无菌生理盐水洗2-3遍；冷冻干燥，即得纯纳米硒干粉。

本发明还提供利用上述方法制备的生物纳米硒。

本发明进一步提供所述生物纳米硒在制备食品、保健品、药品、畜禽饲料以及农用肥料中的应用。

本发明对生物纳米硒合成菌科氏葡萄球菌S154对亚硒酸盐、硒酸盐的耐受范围，对不同浓度亚硒酸盐的转化效率，不同时间点的转化效率变化，以及对其生长曲线、发酵工艺、纳米硒分离纯化技术等进行研究，获得可进行再加工的生物纳米硒。此生物纳米硒可用于富硒肥料、富硒饲料、富硒功能食品、富硒保健品以及硒药片等。

本发明利用科氏葡萄球菌S154合成生物纳米硒，对生物纳米硒进行分离纯化，大量制备生物纳米硒。采用生物发酵工艺制备纳米硒，具有环境友好，产率高，安全高效等特点，生产获得的生物纳米硒可用于肥料、饲料、富硒功能食品、保健品及医药产品等。

附图说明

图1为本发明菌株S154系统进化树；其中，A、B、C、D、E分别为根据16S rRNA、dnaJ、hsp60、rpoB、sodA基因绘制的系统进化树。

图2为本发明菌株S154对不同浓度亚硒酸盐的耐受性。

图3为本发明菌株S154对不同浓度硒酸盐的耐受性。

图4为本发明菌株S154在不同亚硒酸盐浓度下的硒产量(A)及对应浓度下的转化率(B)。

图5为本发明菌株S154不同时间点纳米硒产量(A)和转化效率(B)。

图6为本发明实施例6培养基中添加20mM亚硒酸盐时，S154透射电子显微镜(TEM)照片(A)和生物纳米硒能谱(EDX)分析图(B：A图箭头所指颗粒分析)。

图7为本发明实施例7中纳米硒颗粒纯化后透射电子显微镜(TEM)照片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1科氏葡萄球菌S154的分离纯化及鉴定

1、PCR扩增16S rRNA及看家基因rpoB、dnaJ、hsp60、sodA基因序列：

将菌株S154接种于LB固体培养基培养48h，取0.2mL灭菌PCR管，加入10μL ddH₂O，无菌牙签挑取单个菌落到PCR管中搅拌混匀。

2、构建PCR反应体系并测序：

16S rRNA：以8F(5’-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’)及1506R(5’-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’)为引物，PCR扩增获得16S rRNA基因序列。PCR反应体系为：ddH₂O，18.5μL；10×Buffer，2.5μL，dNTP Mix，2μL；引物8F，0.5μL；引物1506R，0.5μL；菌液，0.5μL；rTaq酶，0.5μL；

PCR反应条件为：94℃：10min；(94℃：40s；56℃：40s；72℃：1min)×30个循环；72℃：10min；4℃；保存。rpoB：以2491F(5'-AACCAATTCCGTATIGGTTT-3')及

2491R(5'-CCGTCCCAAGTCATGAAAC-3')为引物，PCR扩增获得rpoB基因序列。PCR反应体系及条件同16S rRNA序列。

dnaJ：以d1(5'-CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC-3')及

d2(5'-ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRTC-3')为引物PCR扩增获得dnaJ基因序列。PCR反应体系及条件同16S rRNA序列。

hsp60：以H279(5'-GAATTCGAIIIIGCIGGIGA(TC)GGIACIACIAC-3’)和H280(5'-CGCGGGATCC(TC)(TG)I(TC)(TG)ITCICC(AG)AAICCIGGIGC(TC)TT-3’)为引物，PCR扩增获得hsp60基因序列。PCR反应体系同16S rRNA序列。

PCR反应条件为：94℃：3min；(94℃：30s；37℃：60s；72℃：45s)×30个循环；72℃：5min；4℃；保存。

sodA：以SA-(F)(5'-GCCAAAAGAGACTATTATGA-3’)和

SA-(R)(5'-ATTGYTTACCYGTTTGTGTACC-3')为引物，PCR扩增获得sodA基因序列。PCR反应体系及条件同hsp60。

其中，R为A或G，Y为C或T，I为次黄嘌呤。

将PCR扩增获得的DNA片段进行纯化，并测序，测序结果用DNAMAN软件拼接。所测得的16S rRNA及看家基因rpoB、dnaJ、hsp60、sodA序列分别如SEQ ID NO:1-5所示。应用BLAST程序与GenBank数据库(http：//www.ncbi.blm.nih.gov/blast.cgi)中已有的细菌的16SrRNA、rpoB、dnaJ、hsp60、sodA基因序列进行相似性比较分析，结果显示S154的16S rRNA基因序列与标准菌株Staphylococcus cohnii subsp.cohnii ATCC 29974的一致性达到99％，看家基因rpoB、dnaJ、hsp60、sodA与标准菌株Staphylococcus cohnii subsp.cohniiATCC 29974的一致性均达到99％，S154菌株16S rRNA、rpoB、dnaJ、hsp60、sodA进化树见图1。由此确定S154菌株为科氏葡萄球菌，定名为Staphylococcus cohnii S154(保藏编号CGMCC No.13328)。

科氏葡萄球菌属于芽孢杆菌目、葡萄球菌科，革兰氏阳性菌，不产生孢子，兼性厌氧，对多种抗生素有一定的抗性，是人体皮肤和黏膜上的正常菌群之一。

实施例2科氏葡萄球菌S154对亚硒酸盐的耐受浓度

1、制备含不同浓度亚硒酸盐固体LB培养基(每升培养基含NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂15g，去离子水1L)，121℃高压灭菌20min；配制亚硒酸盐母液，过滤灭菌，加入亚硒酸盐溶液，使培养基中亚硒酸盐含量分别0mM、100mM、200mM、300mM、350mM、400mM。

2、将LB平板分为四个区域，以大肠杆菌DH5α作对照，分别挑取S154和大肠杆菌DH5α单菌落，在固体LB平板上取对角划线，37℃培养48h；从固体LB平板上分别挑取活化后的S154和DH5α单菌落于含100mM亚硒酸盐的LB平板上划线，37℃培养；待长出菌落，再分别挑取单菌落在200mM亚硒酸盐平板上划线，37℃培养，依次类推，在含300mM、350mM、400mM亚硒酸盐的LB平板上划线，37℃培养；观察S154和DH5α在不同浓度亚硒酸盐LB平板上的生长情况。

3、结果如图2所示，对照板上科氏葡萄球菌S154和大肠杆菌DH5α生长状态良好，100mM亚硒酸盐时，S154生长不受影响且可生成红色纳米硒，DH5α生长被显著抑制；200mM亚硒酸盐存在时，S154能够较好的生长，并产生红色纳米硒，DH5α完全不生长；300mM、350mM和400mM亚硒酸盐存在时，S154仍可存活，由此知，科氏葡萄球菌S154对亚硒酸盐的耐受浓度范围为0-400mM。

实施例3科氏葡萄球菌S154对硒酸盐的耐受浓度

1、制备固体LB不同浓度含硒酸盐培养基(每升培养基含NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂15g，去离子水1L)，121℃高压灭菌20min；配制硒酸盐母液，过滤灭菌，加入硒酸盐溶液，使培养基中硒酸盐含量分别0mM、100mM、200mM、、300mM、400Mm、500mM。

2、挑取活化后的S154菌株单菌落接种于LB液体培养基中摇培8h(150rpm，37℃)取上述菌液，稀释为OD₆₀₀＝0.8的母液备用；将母液分别稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6，分别在含硒平板上滴加不同浓度的菌液，每个浓度6个重复，37℃培养48h，观察菌落生长及颜色变化。

3、结果如图3所示，100mM、200mM、300mM硒酸盐存在时，科氏葡萄球菌S154生长不受影响且可生成红色纳米硒；400和500mM硒酸盐存在时，科氏葡萄球菌S154生长仍能够较好生长并且产生红色纳米硒，由此可知科氏葡萄球菌S154对硒酸盐耐受浓度范围为0-500mM。

实施例4科氏葡萄球菌S154对生物纳米硒的合成效率

1、制备不同浓度含硒液体LB培养基，121℃高压灭菌20min；配制亚硒酸盐母液，过滤除菌，加入亚硒酸盐溶液，使培养基中亚硒酸盐含量分别1mM、10mM、20mM、30mM、40mM，每个浓度3个重复。

2、挑取活化后的S154菌株单菌落接种于LB液体培养基中摇培8h(150rpm，37℃)取上述菌液，稀释至OD₆₀₀＝0.8；将稀释好的菌液按照0.1％接种量接种于上述含硒LB培养基中，摇培48小时。

3、用蒸馏水配置1M的Na₂S溶液(现配现用)；取发酵液，9000-14000rpm离心10-20min，去上清，清洗三次，然后加入与样品原液体积比为1：2的1M Na₂S溶液，混匀后充分反应1h，再9000-14000rpm离心5-8min；然后取上清液在500nm处测定吸光度。每个样品三个重复，每个样品测定3次。

4、根据纳米硒吸光度标准曲线换算可知样品中纳米硒含量及S154菌株在不同亚硒酸盐浓度下的转化率(图4)。S154菌株在较低浓度下可将亚硒酸盐较大程度地转化为纳米硒，1mM时转化率为37.84％，10mM时转化率为6.38％，在20mM时S154对亚硒酸盐的转化率为4.76％，此时合成纳米硒的产量达到最高，为0.95mM。

实施例5科氏葡萄球菌S154合成纳米硒的最佳培养时间

1、制备含硒液体LB培养基，121℃高压灭菌20min；配制亚硒酸盐母液，过滤灭菌，加入亚硒酸盐溶液，使培养基中亚硒酸盐含量20mM。

2、挑取活化后的S154菌株单菌落接种于LB液体培养基中摇培8h(150rpm，37℃)取上述菌液，稀释至OD₆₀₀＝0.8；将稀释好的菌液按照0.1％接种量接种于空白与20mM亚硒酸盐LB培养基中，37℃，150rpm摇培，对照与处理各3个重复。分别于摇培0h、8h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取样，每个处理三个重复。

3、将培养好的菌液8000-13000rprn离心5-10min，弃上清，清洗三次，然后加入1mL的1M Na₂S溶液，混匀后充分反应1h，再8000-13000rpm离心2-5min；然后取上清液在500nm处测定吸光度。每个样品三个重复，每个样品测定3次。

4、将菌体样品恢复至室温，8000-13000rpm离心3-5min，弃上清，加入与样品体积比为5：8的0.5M NaOH，混匀；将样品沸水浴处理10-30min，8000-13000rpm离心3-5min；取上述样品上清液，加入10倍体积考马斯亮蓝染色3-5min，在595nm处测定样品的吸光度，每个样品3个重复。

5、根据纳米硒吸光度标准曲线换算可知，S154菌株在20mM亚硒酸盐浓度下的不同时间纳米硒产量(图5A)及对应的纳米硒转化效率(图5B)。是S154菌株在摇培60h合成纳米硒单位体积的产量达到最高，为1.55mM。由此说明科氏葡萄球菌S154合成纳米硒的最佳生长时间为60-84h。

实施例6科氏葡萄球菌S154合成生物纳米硒特征分析

1、活化科氏葡萄球菌，转接0.1％的菌液(OD₆₀₀＝0.8)于灭菌后的含LB液体培养基的锥形瓶中，加入亚硒酸盐母液，终浓度为20mM，置于摇床内，37℃，150rpm，培养时间为60h。

2、将摇培60h后的红色菌液取出，在常温下4000-12000rpm离心5-10min，去上清，用生理盐水重悬浮沉淀，离心冲洗3-5遍，取菌与纳米硒的红色混合液，滴加在碳支持膜铜网上，用滤纸吸去多余水分，晾干，在透射电镜下(TEM,JEM-1230,Japan)观察，并利用能谱分析仪(EDX)对该纳米颗粒进行分析。

3、结果如图6A和6B所示：透射电镜下，S154细胞膜上可见球形纳米硒颗粒，粒径约300nm。通过EDS能谱分析红色箭头所指的纳米颗粒知在1.37，11.22，和12.49KeV处分别出现硒的特征吸收峰，说明S154菌将亚硒酸盐还原后形成的纳米颗粒是纳米硒。

实施例7科氏葡萄球菌S154合成生物纳米硒发酵及分离纯化技术1、生物纳米硒发酵

将S154菌株活化培养，以LB培养基为发酵培养基，亚硒酸钠浓度为20mM，将OD₆₀₀＝0.8-1.2的菌液按照1-5％接菌量接种到发酵罐中，使发酵温度为35-39℃，搅拌速度为150-280rpm，通气量为1：0.5-3(发酵液体积：每分钟通气体积)，罐压1.0-1.4F/cm²，发酵60-150小时，纳米硒产量达到1.0-4mM。

2、生物纳米硒分离与纯化

发酵液下罐，3000-10000rpm离心10-20min收集菌体及纳米硒。将收集的红色沉淀用无菌生理盐水清洗2-3遍，并用发酵液1/30体积的纯净水重悬沉淀，浓缩后的纳米硒浓度可达30-120mM。

发酵液下罐，3000-10000rpm离心10-20min收集菌体及纳米硒。将收集的红色沉淀用无菌生理盐水清洗3遍，并用发酵液1/30体积的纯净水重悬沉淀，得到纳米硒悬液。转移生物纳米硒悬液至萃取塔，将纳米硒悬液0.5-0.8倍体积量的正己烷加入到生物纳米硒悬液中进行萃取5次，收集下层水相，3000-5000rpm离心20-40min，所得沉淀用无菌生理盐水清洗3遍。获得高纯度、分散性较好生物纳米硒悬液，透射电子显微镜观察结果见图7。

实施例8科氏葡萄球菌S154合成生物纳米硒发酵及分离纯化技术

1、生物纳米硒发酵

将S154菌株活化培养，以LB培养基为发酵培养基，亚硒酸钠浓度为20mM，将OD₆₀₀＝1.2的菌液按照1％接菌量接种到发酵罐中，使发酵温度为35℃，搅拌速度为150rpm，通气量为1：3(发酵液体积：每分钟通气体积)，罐压1.4F/cm²，发酵150小时，纳米硒产量达到3.5mM。

2、生物纳米硒分离与纯化

发酵液下罐，10000rpm离心10min收集菌体及纳米硒。将收集的红色沉淀用无菌生理盐水清洗3遍，并用发酵液1/30体积的纯净水重悬沉淀，浓缩后的纳米硒浓度高达105mM。

发酵液下罐，10000rpm离心10min收集菌体及纳米硒。将收集的红色沉淀用无菌生理盐水清洗3遍，并用发酵液1/30体积的纯净水重悬沉淀，得到纳米硒悬液。转移生物纳米硒悬液至萃取塔，将纳米硒悬液0.8倍体积量的正己烷加入到生物纳米硒悬液中进行萃取3次，收集下层水相，5000rpm离心20min，所得沉淀用无菌生理盐水清洗3遍。获得高纯度、分散性较好生物纳米硒悬液，透射电子显微镜观察结果。

实施例9科氏葡萄球菌S154合成生物纳米硒发酵及分离纯化技术

1、生物纳米硒发酵

将S154菌株活化培养，以LB培养基为发酵培养基，亚硒酸钠浓度为20mM，将OD₆₀₀＝0.8的菌液按照5％接菌量接种到发酵罐中，使发酵温度为39℃，搅拌速度为280rpm，通气量为1：0.5(发酵液体积：每分钟通气体积)，罐压1.0F/cm²，发酵60小时，纳米硒产量达到4.0mM。

2、生物纳米硒分离与纯化

发酵液下罐，10000rpm离心20min收集菌体及纳米硒。将收集的红色沉淀用无菌生理盐水清洗3遍，并用发酵液1/30体积的纯净水重悬沉淀，浓缩后的纳米硒浓度高达120mM。

发酵液下罐，10000rpm离心20mi收集菌体及纳米硒。将收集的红色沉淀用无菌生理盐水清洗3遍，并用发酵液1/30体积的纯净水重悬沉淀，得到纳米硒悬液。转移生物纳米硒悬液至萃取塔，将纳米硒悬液0.5倍体积量的正己烷加入到生物纳米硒悬液中进行萃取5次，收集下层水相，3000rpm离心40min，所得沉淀用无菌生理盐水清洗3遍。获得高纯度、分散性较好生物纳米硒悬液，透射电子显微镜观察结果。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 科氏葡萄球菌S154及其在生物合成纳米硒中的应用

<130> KHP171119271.0

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1381

<212> DNA

<213> 科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)

<400> 1

ataaggagct tgctcctttg acgttagcgg cggacgggtg agtaacacgt gggtaaccta 60

cctataagac tggaataact ccgggaaacc ggggctaatg ccggataaca tttagaaccg 120

catggttcta aagtgaaaga tggttttgct atcacttata gatggacccg cgccgtatta 180

gctagttggt aaggtaacgg cttaccaagg caacgatacg tagccgacct gagagggtga 240

tcggccacac tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 300

ttccgcaatg ggcgaaagcc tgacggagca acgccgcgtg agtgatgaag gtcttcggat 360

cgtaaaactc tgttattagg gaagaacaaa tgtgtaagta actatgcacg tcttgacggt 420

acctaatcag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca 480

agcgttatcc ggaattattg ggcgtaaagc gcgcgtaggc ggtttcttaa gtctgatgtg 540

aaagcccacg gctcaaccgt ggagggtcat tggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag 600

gaaagtggaa ttccatgtgt agcggtgaaa tgcgcagaga tatggaggaa caccagtggc 660

gaaggcgact ttctggtctg taactgacgc tgatgtgcga aagcgtgggg atcaaacagg 720

attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg 780

ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt 840

gaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa 900

gcaacgcgaa gaaccttacc aaatcttgac atcctttgac aactctagag atagagcctt 960

ccccttcggg ggacaaagtg acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1020

gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttaaactta gttgccagca tttagttggg 1080

cactctaagt tgactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca 1140

tgccccttat gatttgggct acacacgtgc tacaatggac aatacaaagg gcagctaaac 1200

cgcgaggtca tgcaaatccc ataaagttgt tctcagttcg gattgtagtc tgcaactcga 1260

ctacatgaag ctggaatcgc tagtaatcgt agatcagcat gctacggtga atacgttccc 1320

gggtcttgta cacaccgccc gtcacaccac gagagtttgt aacacccgaa gccggtggag 1380

t 1381

<210> 2

<211> 1058

<212> DNA

<213> 科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)

<400> 2

gatggatatc tgcagaattg cccttccgtc ccaagtcatg aaaccgacaa ctacgtttct 60

acctaacgcc atttcaccaa gttccattga aggaccatcg gctaaaattt cacctttcgt 120

tacgacatca cctgtagcaa cgattggtct ttggttataa caagtacctg tgtttgaacg 180

tttgaattta gctaatggat agcgatcgat ttcgccttcg tattcttgtc catcttcttc 240

gataagttga cgtacaagga tttcattaga ttcaacgtgt tcaacacggc ctttgttttt 300

agcaacaatt gctgcaccag agtcacgagc tgctacgtgt tccataccag tacctacgaa 360

aggtgattct ggattcatca atgggactgc ttgacgttgc atgttcgcac ccattaatgc 420

acggttagag tcatcgtttt ctaagaatgg aatacatgct gttgctgcag aaacaacctg 480

tttaggagat acatccatgt aatccatttt ttcttttgcc ataactgtgt tattaccacg 540

gaaacgacaa acaacttcat cctctaagaa gcgaccattt tcatctaact tagaatttgc 600

ttgtgctact acatagctat cttcttcgtc agctgttaaa taatcaattt gatctgtgat 660

actattcgtt tcaagatcta cttcacgata tggcgtttca atgaaaccaa attcatttac 720

acgtgcataa cttgataatg agttaatcaa accaatgttt ggtccctctg gtgtttcgat 780

tggacacata cgaccgtagt gagagtagtg aacgtcacgc acttccattt gagcacgttc 840

acgtgttaaa ccaccaggtc ctaatgctga tagacgacgt ttatgtgtca attccgctaa 900

tggattggct tggtccatga attgtgacaa ttgagaacta ccaaagaatt ctttaattga 960

cgcaataact ggacgaatat tgattaattg ttgtggtgta atagaatctg tatcttggat 1020

agacattctt tcacgtacca cacgttccat tcttgata 1058

<210> 3

<211> 980

<212> DNA

<213> 科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)

<400> 3

tgctcgagcg gccgccagtg tgatggatat ctgcagaatt gcccttgcca aaagagacta 60

ttatgatttc ttgggtgtca gtaaagacgc ttctaaagat gaaataaaaa aggcttatcg 120

taaattatca aaaaaatatc atcctgacat caataaagaa gaaggtgcag atgaaaagtt 180

caaggaaatt tcagaagcat atgaaacgtt aagtgatgaa aacaagcgtg caaactatga 240

tcaatttggt catgatggac cacaaggtgg atttggcggc caaggatttg gtggtcaaga 300

ctttagtggt ttcggcggcg gtttcgaaga tatattcagt tcattcttcg gtggtggacg 360

tcaaagagat ccaaatgcac ctagaaaagg tgatgaccta caatatacaa tgactgttac 420

ttttgaagaa gctgtattcg gtacaagcaa agagatttca atacgcaaag atgtaacttg 480

tcatacttgt gatggtgaag gtgcaaaacc gggaactaag aaaaaaacgt gtcattactg 540

taatggttca ggacatgttg ctgtagaaca gaatacgata ttaggtagag ttagaactga 600

aaaagtttgt ccagtttgta gtggttctgg tcaagaattt gaagaacctt gtccgacatg 660

tcacggtaaa ggaactgaaa acaaaacagt taaaattaat gtgacagtgc cagaaggtgt 720

agataatgaa caacaaataa gattagcagg tgaaggtgcg cctggagaaa atggtggacc 780

acaaggtgat ttatacgttg tatttagagt taaaccttct gaaacatttg aaagggaagg 840

cgacgatatt tacttttcac aagatatcag tatcgctcaa gcaacacttg gtgatgaaat 900

taaagtccca actttaaaag gtcatgttat gttaacaatt cctggcggta cacaaacagg 960

taaacaataa gggcaattcc 980

<210> 4

<211> 605

<212> DNA

<213> 科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)

<400> 4

cagaattgcc cttgaattcg agggggcggg ggatgggacg acgacagcta ctgtattagc 60

acaagcaatg attcaagaag gtttaaaaaa tgttacaagt ggtgctaatc cagtcggctt 120

acgtcaagga atcgacaaag ctgtagaagt agcgattgaa gcgttacatg aaatttcaca 180

aaatgtagat aataaaaatg aaatcgctca agttggttct atttcagcag ctgatgaaga 240

aattggtaaa tatatttctg aagcaatgga aaaagttgga aatgatggtg ttattacaat 300

tgaagagtca agcggtttta atactgaatt agaagttgta gaaggtatgc aatttgacag 360

aggttatcaa tctccatata tggtcacaga ttcagataag atggtcgcag agttagaaag 420

accgtatatt ttaattacag ataaaaagat ttcgtctttc caagatattt taccgttatt 480

agaacaagtg gttcaagcta atcgtccaat tttaattgta gctgatgacg ttgaaggcga 540

cgcattaaca aatatagtct taaaccgtat gcgtggtaca ttcacagcag tagcagtaaa 600

ggccc 605

<210> 5

<211> 481

<212> DNA

<213> 科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)

<400> 5

gtgatggata tctgcagaat tgcccttaga taataggcat gttcccagac gtctaagcct 60

aggattggtg ttttaccttc tgtaagtggg ttatcttggt ttggagttgt aacaatttct 120

aaattatcat tattaacaac tagccaagcc catcctgaac caaaacgagc tgcagcttta 180

tctgcaaatt cttctttaaa tgcatctaaa gaaccccatt gttctttaat tttatcaact 240

acagttcctt tttcttcaga gtttggagtt aataattccc agaataatga gtggtttaag 300

tgtccaccac cattatttct aacagctgtt tgaatatctt ctggtacact gtctaaattt 360

gcaataattt cttcaattga tttagactct aaatcagtac cttcaattgc tgcatttaat 420

ttagtaacat aagtgttatg atgtttgtcg tgatggattt ccattgtttg ttgatcaata 480

t 481

Claims

1.科氏葡萄球菌(Staphylococcus cohnii)S154，其特征在于，保藏编号为CGMCCNo.13328。

2.含有权利要求1所述科氏葡萄球菌S154的菌剂或复合微生物菌剂。

3.权利要求1所述科氏葡萄球菌S154在生物合成纳米硒中的应用，其特征在于，向发酵培养基中添加六价和/或四价无机硒盐，发酵培养科氏葡萄球菌S154，并从发酵产物中分离纯化纳米硒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基中六价无机硒盐的浓度为0.001-500mM，优选10-400mM。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基中四价无机硒盐的浓度为0.001-400mM，优选0.1-300mM。

6.利用权利要求1所述科氏葡萄球菌S154生物合成纳米硒的方法，其特征在于，将S154菌株活化培养，以LB培养基为发酵培养基，亚硒酸钠浓度为20mM，将OD₆₀₀＝0.8-1.2的菌液按照1-5v/v％接菌量接种到发酵罐中，使发酵温度为35-39℃，搅拌速度为150-280rpm，发酵液体积：每分钟通气体积为1：0.5-3，罐压为1.0-1.4F/cm²，发酵60-150小时。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括从发酵产物中分离纯化纳米硒的步骤；具体如下：

发酵液下罐，3000-10000rpm离心10-20min收集菌体沉淀，将沉淀用无菌生理盐水洗2-3遍，并用发酵液1/30体积的水重悬沉淀，所得菌悬液经冷冻干燥，即得纳米硒干粉。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括从发酵产物中分离纯化纳米硒的步骤；具体如下：

a、发酵液下罐，3000-10000rpm离心10-20min收集菌体沉淀，将沉淀用无菌生理盐水洗2-3遍，并用发酵液1/30体积的水重悬沉淀，得到纳米硒悬液；

9.利用权利要求6-8任一项所述方法制备的生物纳米硒。

10.权利要求9所述生物纳米硒在制备食品、保健品、药品、畜禽饲料以及农用肥料中的应用。