CN115927114B

CN115927114B - 一种亚硒酸盐还原菌及其合成纳米硒的方法与应用

Info

Publication number: CN115927114B
Application number: CN202211689552.9A
Authority: CN
Inventors: 许玫英; 葛梦; 李道波; 黄浩斌; 周少锋; 陈杏娟
Original assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Microbiology of Guangdong Academy of Sciences
Priority date: 2022-12-27
Filing date: 2022-12-27
Publication date: 2023-10-13
Anticipated expiration: 2042-12-27
Also published as: CN115927114A

Abstract

本发明公开了一种亚硒酸盐还原菌及其合成纳米硒的方法与应用。Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129于2022年12月6日，保藏于为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号：GDMCC No.62529。本发明筛选的亚硒酸盐还原菌Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129对高浓度亚硒酸盐的耐受性强，并能将亚硒酸盐高效地转化为纳米硒，所需培养条件简单、成本低、易操作。回收的纳米硒颗粒性质稳定、生物活性高、毒性低，在农业生产、环境污染治理、生物传感器制作以及医药领域的抗菌、抗氧化、抗癌等方面优势明显。

Description

一种亚硒酸盐还原菌及其合成纳米硒的方法与应用

技术领域

本发明属于纳米硒生物合成技术领域，具体涉及一种亚硒酸盐还原菌及其合成纳米硒的方法与应用。

背景技术

硒是人体必需的微量元素之一，在人体抗癌、抗氧化、抗衰老、增强免疫力、解毒、排毒、保护肝脏及保护心血管等方面具有重要的作用。然而，据中国营养学会及FAO/WHO/IAEA发布的数据显示，人体每天摄入硒的安全剂量非常狭窄，成年人需摄入40-400μg/d硒才能保障机体正常的新陈代谢。硒摄入量不足可能引起人体抵抗力变差，罹患心脑血管疾病、克山病、大骨节病等，甚至会增加人体患癌风险，而硒的过量摄入也可能引发人体失明、脱发、呼吸困难、心脏萎缩等硒中毒现象。很多人类活动都可能导致局部地区形成硒污染，例如工厂含硒废水的排放、农业污染排水、煤炭和磷酸盐开采、煤炭燃烧和石油精炼，对有毒硒污染物的治理以及硒的回收利用具有重要意义。

亚硒酸盐是自然界中最普遍存在的硒形态，然而，由于亚硒酸盐具有高毒性和高流动性，亚硒酸盐浓度超标的硒污染区域往往面临着巨大的生态风险。单质纳米硒是已发现毒性最低的硒形态，将高毒性的亚硒酸盐还原为低毒性的单质纳米硒，是硒污染物处理以及硒资源回收的重要手段。传统的亚硒酸盐去除及纳米硒制备通常采用化学法，例如向亚硒酸盐中添加维生素C还原剂以及牛血清白蛋白稳定剂进行制备，但该过程成本高、纳米硒产物纯度低、粒径分布不均且稳定性差等缺点限制了纳米硒的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种亚硒酸盐还原菌及其合成纳米硒的方法与应用。

为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：

一种亚硒酸盐还原菌，名称为Metasolibacillus fluoroglycofenilyticusES129，于2022年12月6日，保藏于为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号：GDMCC No：62529。

本发明的第二个目的是提供Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129在合成纳米硒中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种亚硒酸盐还原菌生物合成纳米硒的方法，包括以下步骤：

利用Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129还原含硒的盐合成纳米硒。

优选，具体步骤为：

(1)菌种活化：将Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129接种于固体培养基中，进行恒温培养；

(2)种子培养：将活化后的Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129接种到液体培养基中进行振荡培养，得到种子培养液；

(3)发酵培养：将种子培养液接种到含亚硒酸钠的液体发酵培养基中，振荡培养Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129合成纳米硒。

优选，是Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129合成纳米硒得到的菌悬液进行低速离心，收集沉淀，并用0.5-1.5％的NaCl洗涤2-3次后，将沉淀重悬浮于TE缓冲液中，加入溶菌酶对菌体细胞壁进行破坏，随后对菌体进行超声破碎，低速离心，弃沉淀，收集含纳米硒的上清液，对上清液进行高速离心，收集沉淀，并用去离子水清洗沉淀2-3次，获得纯净的纳米硒颗粒。

进一步优选，所述步骤(1)中将Metasolibacillus fluoroglycofenilyticusES129接种于固体培养基，其接种量为体积比1％-5％，固体培养基成分为胰蛋白胨5-15g/L、酵母提取物2-10g/L、氯化钠5-15g/L、琼脂粉15-20g/L，培养条件为30-35℃培养12-36h，直至形成直径约3mm的菌落。

进一步优选，所述步骤(2)将活化后的Metasolibacillusfluoroglycofenilyticus ES129接种到液体培养基中，其接种量为1-5％，液体培养基成分为胰蛋白胨5-15g/L、酵母提取物2-10g/L、氯化钠5-15g/L，培养条件为30-35℃、150-200r/min、振荡培养12-36h。

进一步优选，所述步骤(3)中将种子培养液接种到含亚硒酸钠的液体发酵培养基，其接种量为1-5％，液体发酵培养基的成分为胰蛋白胨5-15g/L、酵母提取物2-10g/L、氯化钠5-15g/L、亚硒酸钠1-20mM，培养条件为30-35℃、150-200r/min、振荡培养24-72h。

进一步优选，所述低速离心条件为3000-8000*g、5-15min，高速离心条件为10000-20000*g、10-30min。

进一步优选，所述的溶菌酶，终浓度为5-15mg/mL，37℃温育0.5-1.5h。

进一步优选，所述的对菌体进行超声破碎的条件为：置于冰上进行超声、功率设置为功率设置为100-180W、超声运行5s暂停5s、总运行时间为20-40min。

本发明提出的亚硒酸盐还原菌对高浓度亚硒酸盐的耐受性强，并能将亚硒酸盐高效地转化为纳米硒，所需培养条件简单、成本低、易操作。回收的纳米硒颗粒性质稳定、生物活性高、毒性低，在功能化农业、环境污染治理、生物传感器制作以及医药领域的抗菌、抗氧化、抗癌等方面优势明显。

本发明的有益效果在于：

本发明筛选的亚硒酸盐还原菌Metasolibacillus fluoroglycofenilyticusES129对高浓度亚硒酸盐的耐受性强，并能将亚硒酸盐高效地转化为纳米硒，所需培养条件简单、成本低、易操作。回收的纳米硒颗粒性质稳定、生物活性高、毒性低，在农业生产、环境污染治理、生物传感器制作以及医药领域的抗菌、抗氧化、抗癌等方面优势明显。

Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129于2022年12月6日，保藏于为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号：GDMCC No.62529。

附图说明

图1为本发明实施例1中亚硒酸盐还原菌Metasolibacillusfluoroglycofenilyticus ES129分别在不添加亚硒酸盐(图1左)和添加5mM亚硒酸盐(图1右)的固体培养基上的生长情况；

图2为本发明实施例2中菌株ES129在液体培养基以及在含有1mM亚硒酸盐的液体发酵培养基中随时间的生长曲线；

图3为本发明实施例2中菌株ES129在含有1mM亚硒酸盐的液体发酵培养基中对亚硒酸钠的消耗(A)以及合成纳米硒的浓度(B)随时间的变化曲线；

图4为本发明实施例3中菌株ES129在含有不同浓度亚硒酸盐的液体发酵培养基中生物合成纳米硒的浓度(A)及转化率(B)；

图5为本发明实施例4中生长在液体培养基中的ES129菌株的SEM图；

图6为本发明实施例4中生长在含有5mM亚硒酸盐的液体发酵培养基中的ES129菌株的SEM图，箭头指示的是纳米硒；

图7为本发明实施例4中生长在含有5mM亚硒酸盐的液体发酵培养基中的ES129菌株的TEM图，箭头指示的是纳米硒；

图8为本发明实施例4中纳米硒的Raman光谱图；

图9为本发明实施例5中菌株ES129在不同浓度亚硒酸盐培养基中的生长情况。

具体实施方式

为进一步阐述本发明的特征及所达成的功效，现结合实施例以及附图对本发明进行更详细的描述。

实施例1

亚硒酸盐还原菌的分离纯化，包括以下步骤：

1.从湖北恩施渔塘坝富硒矿区采集土壤，取0.5g土壤加入50mL 0.01M灭菌PBS中，充分混匀，制成土壤悬液；

2.高浓度亚硒酸盐耐受性菌株的富集：取1mL土壤悬液加入到50mL高浓度亚硒酸盐培养基中进行培养，培养基的成分为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、亚硒酸钠100mM，培养条件为30℃、150r/min、恒温振荡培养约72h，直到培养基变成明显红色，得到高浓度亚硒酸盐耐受性菌株的富集液；

3.取1mL富集液，使用0.01M灭菌PBS梯度稀释10¹-10⁹倍，取各个稀释剃度的富集液0.1mL均匀涂布于含5mM亚硒酸盐的固体培养基上，固体培养基配方为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉17g/L以及亚硒酸钠5mM，培养条件为30℃培养约48h；

4.待平板上长出菌落后，选取红色单菌落在含亚硒酸盐的固体培养基上进行划线分离纯化，30℃培养约48h。该步骤重复进行2-3次，直到获取纯菌。将纯菌用15％灭菌甘油进行保存；

5.将纯菌送至生物工程(上海)股份有限公司鉴定后，命名为Metasolibacillusfluoroglycofenilyticus ES129，于2022年12月6日，保藏于为广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号：GDMCCNo.62529。

实施例2

亚硒酸盐还原菌Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129生物合成纳米硒的最佳培养时间，包括以下步骤：

1.菌种活化：将Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129接种于含胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉17g/L的固体琼脂平板上，30℃培养24h，直至形成直径约3mm的菌落；

2.种子培养：将活化后的菌株ES129按体积比1％接种量接种到含有胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L的液体培养基中进行恒温振荡培养，培养条件为30℃、150r/min、恒温振荡培养24h；

3.发酵培养：将种子培养液按体积比1％接种量接种到含胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、亚硒酸钠1mM的液体发酵培养基(LB+1mM SeO₃ ^2-)，以不含亚硒酸钠的液体发酵培养基作为对照-LB中，培养温度为30℃，转速为150r/min，培养时间分别为0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h以及96h；

4.纳米硒的分离纯化：将发酵培养结束后所得菌悬液按5000*g低速离心10min，收集沉淀，并用质量分数0.9％的NaCl洗涤两次后，将沉淀重悬浮于TE缓冲液中，加入终浓度为10mg/mL的溶菌酶，在37℃温育1h对菌体细胞壁进行破坏，随后将菌体置于冰上进行超声破碎，超声条件设置为功率150W、超声运行5s暂停5s、总运行时间为30min，超声结束后，以5000*g离心10min，弃沉淀，收集含纳米硒的上清液，对上清液按12000*g高速离心20min，收集沉淀，并用去离子水清洗沉淀两次，获得纯净的纳米硒颗粒。

5.培养结束后对样品细胞蛋白浓度、亚硒酸盐残留以及纳米硒合成量进行测试；

实验结果：如图2所示，在亚硒酸钠浓度约为1mM的液体发酵培养基中，菌株ES129生长情况在60h内基本未受到明显影响，60h-96h仅受到轻微抑制；如图3中A所示，恒温振荡培养24h后亚硒酸盐消耗率达到90％，培养48h后亚硒酸盐消耗率达到99％，培养60h后，体系中无亚硒酸盐残留；如图3中B所示，纳米硒最高转化率达78％。

实施例3

亚硒酸盐还原菌Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129生物合成纳米硒的最佳底物浓度，包括以下步骤：

3.发酵培养：液体发酵培养基成分为胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、亚硒酸钠1-20mM，将种子培养液按体积比1％接种量分别添加到亚硒酸钠终浓度分别为1mM、5mM、10mM、20mM的液体发酵培养基中，培养温度为30℃，转速为150r/min，培养时间为96h；

4.纳米硒的分离纯化：将发酵培养结束后所得菌悬液按5000*g低速离心10min，收集沉淀，并用0.9％的NaCl洗涤两次后，将沉淀重悬浮于TE缓冲液中，加入终浓度为10mg/mL的溶菌酶，在37℃温育1h对菌体细胞壁进行破坏，随后将菌体置于冰上进行超声破碎，超声条件设置为功率150W、超声运行5s暂停5s、总运行时间为30min，超声结束后，以5000*g离心10min，弃沉淀，收集含纳米硒的上清液，对上清液按12000*g高速离心20min，收集沉淀，并用去离子水清洗沉淀两次，获得纯净的纳米硒颗粒。

实验结果：如图4所示，含1mM亚硒酸钠的液体发酵培养基在培养结束后，亚硒酸钠消耗率为100％，无亚硒酸钠残留，纳米硒转化率为78％；含5mM亚硒酸钠的液体发酵培养基在培养结束后，亚硒酸钠消耗率为92％，纳米硒转化率为83％；含10mM亚硒酸钠的液体发酵培养基在培养结束后，亚硒酸钠消耗率为67％，纳米硒转化率为48％；含20mM亚硒酸钠的液体发酵培养基在培养结束后，亚硒酸钠消耗率为37％，纳米硒转化率为13％。

实施例4

菌株ES129生物合成纳米硒的特征

1.将种子培养液按体积比1％接种量添加到含有胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L以及亚硒酸钠5mM的液体发酵培养基中，培养条件为30℃、150r/min、培养48h，并设置一组含有胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L的液体培养基作为对照组，以相同的培养条件进行培养；

2.扫描电子显微镜观察：将培养结束后的样品经过表1所述SEM样品前处理过程，冷冻干燥后使用捷克Tescan MIRA LMS扫描电子显微镜进行成像并拍照，空白对照组结果见图5所示，实验组结果见图6所示，图6中箭头指示纳米硒颗粒；

表1SEM样品前处理过程

步骤	试剂	处理时间	重复次数
				1	2.5％戊二醛固定	5h	1次
2	0.01M PBS清洗	20min	6次
				3	30％乙醇脱水	10min	2次
4	50％乙醇脱水	10min	2次
				5	70％乙醇脱水	15min	1次
6	90％乙醇脱水	15min	1次
				7	无水乙醇脱水	15min	3次
8	叔丁醇置换	20min	2次
				9	冷冻干燥	-	-

3.透射电子显微镜观察：将戊二醛添加到0.01M PBS中，配置含量为2.5％戊二醛的固定液，将培养结束后的样品使用2.5％戊二醛固定液在4℃条件下固定过夜。经处理后的样品固定在铜网格上，使用日立H-7650透射电子显微镜进行成像并拍照，实验组结果见图7所示，箭头指示纳米硒颗粒；

4.纳米硒的拉曼光谱鉴定：将发酵培养结束后所得菌悬液按5000*g低速离心10min，收集沉淀，并用0.9％的NaCl洗涤两次后，将沉淀重悬浮于TE缓冲液中，加入终浓度为10mg/mL的溶菌酶，在37℃温育1h对菌体细胞壁进行破坏，随后将菌体置于冰上进行超声破碎，超声条件设置为功率150W、超声运行5s暂停5s、总运行时间为30min，超声结束后，以5000*g离心10min，弃沉淀，收集含纳米硒的上清液，对上清液按12000*g高速离心20min，收集沉淀，并用去离子水清洗沉淀两次，经冷冻干燥后获得纯净的纳米样品，使用HoribaLabRAM HR Evolution拉曼光谱仪对样品进行分析，实验组结果见图8所示，拉曼光谱显示出纳米硒的特征峰，表明所制备的样品为纳米硒。

实施例5

ES129对亚硒酸盐的耐受性测试，包括以下步骤：

配置含有胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L以及亚硒酸钠0-400mM的液体培养基，分别按1％接种量将种子培养液添加到终浓度分别为0、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM亚硒酸钠的液体培养基中，培养温度为30℃，转速为150r/min，培养时间为96h；

实验结果：如图9所示，ES129能在0-400mM亚硒酸钠培养基中生长良好并将亚硒酸钠还原为红色纳米硒，表明ES129对亚硒酸盐具有很强的耐受性，可耐受浓度超过400mM。

Claims

1.Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129，保藏编号：GDMCC No. 62529。

2.权利要求1所述的Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129，保藏编号为GDMCC No. 62529在合成纳米硒中的应用。

3.一种亚硒酸盐还原菌生物合成纳米硒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

利用Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129 GDMCC No. 62529还原含硒的盐合成纳米硒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体步骤为：

（1）菌种活化：将Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129 GDMCC No.62529接种于固体培养基中，进行恒温培养；

（2）种子培养：将活化后的Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129 GDMCCNo. 62529接种到液体培养基中进行振荡培养，得到种子培养液；

（3）发酵培养：将种子培养液接种到含亚硒酸钠的液体发酵培养基中，振荡培养Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129 GDMCC No. 62529合成纳米硒。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（4）：纳米硒的分离纯化是将发酵培养结束后的Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129 GDMCC No. 62529的菌悬液进行离心，离心条件是3000-8000*g、5-15min，收集沉淀，并用0.5-1.5%的NaCl洗涤2-3次后，将沉淀重悬浮于TE缓冲液中，加入溶菌酶对菌体细胞壁进行破坏，随后对菌体进行超声破碎，离心，离心条件是3000-8000*g、5-15min，弃沉淀，收集含纳米硒的上清液，对上清液进行离心，离心条件是10000-20000*g、10-30min，收集沉淀，并用去离子水清洗沉淀2-3次，获得纯净的纳米硒颗粒。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中将Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129 GDMCC No. 62529接种于固体培养基，其接种量为体积比1%-5%，固体培养基成分为胰蛋白胨5-15g/L、酵母提取物2-10g/L、氯化钠5-15g/L、琼脂粉15-20g/L，培养条件为30-35°C培养12-36h，直至形成直径约3mm的菌落。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）将活化后的Metasolibacillus fluoroglycofenilyticus ES129 GDMCC No. 62529接种到液体培养基中，其接种量为1-5%，液体培养基成分为胰蛋白胨5-15g/L、酵母提取物2-10g/L、氯化钠5-15g/L，培养条件为30-35°C、150-200r/min、振荡培养12-36h。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中将种子培养液接种到含亚硒酸钠的液体发酵培养基，其接种量为1-5%，液体发酵培养基的成分为胰蛋白胨5-15g/L、酵母提取物2-10g/L、氯化钠5-15g/L、亚硒酸钠1-20mM，培养条件为30-35°C、150-200r/min、振荡培养24-72h。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述加入溶菌酶对菌体细胞壁进行破坏，其溶菌酶的终浓度为5-15 mg/mL，37°C温育0.5-1.5h；所述的对菌体进行超声破碎的条件为：置于冰上进行超声、功率设置为功率设置为100-180W、超声运行5s暂停5s、总运行时间为20-40min。