CN107446829A - 一种绿僵菌袋式固体培养工艺 - Google Patents

一种绿僵菌袋式固体培养工艺 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种绿僵菌袋式固体培养工艺，包括绿僵菌液体培养种子按1∶3‑7的比例接种于装有灭菌冷却的固体培养基封闭式培养袋内，混匀后密封，平铺于培养架上进行培养，18‑22℃培养5‑7天至菌丝生长密实，产孢前，揉散，通入空气；24‑26℃继续培养5‑7天后，揉散，开袋干燥。所述的固体培养基为麦麸、谷壳和大米中的一种或几种混合物，所述的封闭式培养袋为封闭式真菌杀虫剂固体发酵培养袋。本发明适用于不同规模的绿僵菌固体培养，具有操作简便、污染率低和产孢量高等优点。

Description

一种绿僵菌袋式固体培养工艺
技术领域
本发明涉及虫生真菌固体发酵领域，主要涉及绿僵菌袋式固体发酵培养工艺流程。
背景技术
绿僵菌应用于地下害虫的防治开创了生物防治的历史，利用昆虫病原薇生物开展害虫防治成为生物防治的重要研究领域和防治策略。虫生真菌具有无残留、对环境无污染、对目标害虫具专化性，目前已有数十种虫生虫真菌应用于农、林、牧和卫生害虫的防治研究，并且已在生物防治上占一席之地。
近年来，研究应用绿僵菌防治害虫达300多种，约有100多种害虫进行了田间防治试验，是当今用于生物防治的主要真菌杀虫剂之一，林业上主要用于防治地下害虫、椰心叶甲、白蚁、星天牛、黄脊竹蝗等，农业上用于无公害蔬菜的地下害虫、水稻沫蝉、花生、甘蔗地的蛴螬防治，畜牧业上用于草地蝗虫的防治，另外还用于卫生害虫的蟑螂的防治。自然界，绿僵菌主要是通过分生孢子感染目标寄主昆虫，侵入昆虫体内后利用寄主营养进行生长和分泌毒素杀死寄主，并在昆虫体表形成新的分生孢子作为新的侵染体，实现循环侵染。防治上主要是通过人工培养绿僵菌分生孢子，制成粉剂、油剂等不同剂型进行应用。分生孢子可以感染目标寄主，也可以宿存于土壤内，起到持续控制害虫的目的。
绿僵菌分生孢子的获得主要是通过液固双相培养工艺进行，即先进行液态培养获得液体种子，再将液态种子接种于固态培养基，在一定的温度、湿度和氧气条件下菌体利用固体培养基的营养进行发酵培养，并在固体表面形成分生孢子的过程。液体培养可根据培养规模采用液体发酵罐或摇床培养，培养工艺比较成熟，而固态培养多年来以盘式培养为主，因为污染率高、产孢量低和活孢率低等缺点而影响产品质量，近年来研发的大型固体发酵设备也因为价格昂贵、占地面积大、能耗大、生产成本高等原因使用率不高。
由此，本领域需要一种经济适用、操作简易，液固混合简便均匀，培养占地少、污染率低、产孢量高，保证孢子活力，适合不同规模的生产需要，可根据孢子粉需求量灵活确定培养规模的绿僵菌培养工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作灵活、规模可控、污染率低、产孢量高的绿僵菌固体发酵工艺。
本发明的技术方案如下。
一种绿僵菌的袋式固体培养方法，包括以下步骤：
步骤S1，将绿僵菌液体种子接种于装有灭菌冷却的固体培养基的封闭式培养袋内，混匀后密封；
步骤S2，将所述培养袋平铺于培养架上进行固体发酵培养；
其特征在于，所述步骤S2的固体发酵培养包括如下步骤：
步骤S2.1，营养生长：在18-22℃的温度培养4-5天至菌丝生长密实；
步骤S2.2，产孢培养：将结块的培养基揉散、混匀，通入洁净空气，在24-26℃的温度密闭培养5-6天，揉散，开袋干燥。
进一步地，所述液体种子的液体培养基包括：粘米粉2％，白沙糖3％，K2HPO40.1％，MgSO40.05％，蛋白胨0.5％。
进一步地，所述液体种子为通过摇瓶进行液体发酵培养所得，培养工艺为：1000ml三角瓶装入700ml液体培养基，在121℃温度下灭菌冷却后接入绿僵菌斜面，在25-26℃温度下，200rpm往复旋转培养72h形成液体种子。
进一步地，所述液体种子为通过发酵罐进行液体发酵培养所得，培养工艺为：按发酵罐体积的70％装入液体培养基，灭菌后按10％接种量接入液体种子扩大培养，24-26℃培养72小时。
进一步地，所述的固体培养基为大米。
进一步地，所述固体培养基的制备方法为在大米中按重量的8-10％加入水，拌匀至培养基表面湿润，按每包1.9-2.1kg分装于保鲜袋内，放置20-30min至培养基吸干表面水份，揉散，密封，在121℃温度灭菌30min，冷却备用。
进一步地，所述的封闭式培养袋为封闭式真菌杀虫剂固体发酵培养袋。
进一步地，所述密封式真菌杀虫剂固体发酵培养袋被浸泡于5％新洁尔灭(苯扎溴铵)溶液内24h，取出晾干后备用。
进一步地，所述步骤S1中绿僵菌液体种子按1∶3-7的比例接种于装有灭菌冷却的固体培养基封闭式培养袋内。
进一步地，所述绿僵菌包括金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、黄绿绿僵菌(Metarhizium flavoviride)、贵州绿僵菌(Metarhizium guizhouense)、平沙绿僵菌(M.pingshaense)、鳞腮绿僵菌(M.lepidiotae)、蚱蜢绿僵菌(M.acridum)、罗伯氏绿僵菌(M.robertsii)的一种或多种。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)采用平铺式培养，利用多层培养架占用的场地较少；
(2)培养基为农副产品，易于获得；
(3)采用密封式培养，可同时满足绿僵菌生长对湿度和通气的要求，污染率低，产孢量高；
(4)培养规模灵活可控，可根据需求量灵活掌控培养批次及培养量。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，以下试剂和原料如无特殊说明均为市售。
实施例1 金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)袋式培养工艺
摇瓶培养绿僵种子液：粘米粉420g，白沙糖630g，K2HPO421g，MgSO410.5g，蛋白胨105g，加入矿泉水配制成21L培养基，分装于30个1000mL三角瓶，每瓶700mL，塞上硅胶盖，用牛皮纸包扎，置于100L立式灭菌锅内，121℃灭菌30min，取出冷却后置于超净工作台内，每瓶接入1/3支金龟子绿僵菌种子斜面，在25-26℃温度，200rpm往复旋转培养72h，获得液体种子，备用。
固体培养工艺：以大米为固体培养基，按重量的10％加入水，拌匀至大米表面湿润，按每包2kg分装于保鲜袋内，放置20-30min至大米吸干表面水份，揉散，密封，在121℃温度灭菌30min，冷却后倒入无菌的密封式固体培养袋内，接入液体种子600mL，揉散结块的大米，混匀，封口，通气侧朝上平铺于培养架上，在20-22℃温度培养5天，揉散结块的大米，通入空气，平铺于培养架上，在25-26℃温度继续培养5天，产孢完全后，开袋，抽湿干燥后，分离孢子。
按照本工艺，采用实验室保藏的金龟子绿僵菌Ma25进行了三批次培养，结果表明，液体培养72h后形成稠密的种子液，种子液按2∶1加无菌水稀释后，每袋接种600mL，21±1℃培养3天，大米上开始出现白色菌丝，至第5天菌丝基本长结实，并有少量产孢，所有批次均未见有污染。揉散菌块后，在25±1℃温度培养，开始大量产孢，至第10天左右产孢完全，抽湿干燥48h后，真空抽提分生孢子，称重，平均每袋可获得105.4g绿僵菌高孢粉(含孢量为4.3×1010孢子/克)，平均产孢率达5.27％。经活孢检测，所获得的孢子均为活孢。
活孢率测定：取分离的分生孢子粉适量，加入0.05％吐温-80无菌溶液，振荡15min，梯度稀释后血球计数板计数，移液器取一滴1×107孢子/mL菌液滴于涂有SDAY培养基的载玻片上，在26℃温度保湿培养22-24小时，显微镜下观察，萌发的芽管长度大于或等于孢子直径则认为是活孢，观测5个视野孢子的活孢率，取平均数。
实施例2 黄绿绿僵菌(Metarhizium flavoviride)袋式培养工艺
发酵罐培养液体种子：取1000mL摇瓶装400mL PPD培养基，灭菌后接种黄绿绿僵菌斜面种子，在25-26℃温度，200rpm往复旋转培养72h，作为种子液接于发酵罐种子罐培养基(10升罐装7L培养基：粘米粉2％，白沙糖3％，K2HPO40.1％，MgSO40.05％，蛋白胨0.5％)，在25-26℃温度培养3天，转接至大发酵罐(100L装培养基70L)，培养72小时作为种子接种于固体培养基。
固体培养工艺：以大米为固体培养基，按重量的8％加入水，拌匀至大米表面湿润，按每包1.9kg分装于保鲜袋内，放置20min至大米吸干表面水份，揉散，密封，在121℃温度灭菌30min，冷却后倒入消毒的密封式固体培养袋内，接入液体种子600mL，揉散结块的大米，混匀，封口，通气侧朝上平铺于培养架上，在20-22℃温度培养5天，揉散开结块的大米，通入空气，平铺于培养架上，在25-26℃温度继续培养6天，产孢完全后，开袋，抽湿干燥后，分离孢子。
按照本工艺，利用实验室保藏的黄绿绿僵菌Mfl245进行了三批次培养，每批5包，结果表明，接种后在21±1℃温度培养至第5天菌丝基本长结实，所培养的三批次均未见污染。菌块揉散后混匀，通入空气，封闭后置于25±1℃温度下进行产孢培养，培养至第11天左右，产孢完全，开袋抽湿干燥，真空抽提孢子粉，称重，平均每袋可获绿僵菌高孢粉约81.4g(含孢量为3.9×1010孢子/克)，平均产孢率可达4.28％，经活孢率检测，活孢率达100％。
实施例3 贵州绿僵菌(Metarhizium guizhouense)袋式培养工艺
液体种子培养采用摇瓶往复旋转培养，方法同实例1金龟子绿僵菌种子液培养。
固体培养工艺：以大米为固体培养基，加水拌匀至大米表面湿润，沥干后分装于保鲜袋内，每袋2Kg，在121℃温度灭菌30min，冷却后倒于无菌的密封式固体培养袋内，接入液体种子600mL，揉散结块的大米，混匀，封口，通气侧朝上平铺于培养架上，在20-22℃温度培养4天，揉散开结块的大米，通入空气，平铺于培养架上，在25-26℃温度继续培养6天，产孢完全后，开袋，抽湿干燥后，分离孢子。
按照本工艺，利用实验室保藏的贵州绿僵菌Mg20进行了三批次培养，每批5包，结果表明，接种后在21±1℃温度培养至第6天菌丝基本长结实，揉散后，将培养袋内的培养基混匀，通入空气，封闭后置于25±1℃温度下进行产孢培养，培养至第14天左右，抽湿干燥，真空抽提孢子粉，称重，平均每袋可分离高孢粉约83g(含孢量3.68×1010孢子/克)，平均产孢率可达4.15％，经活孢率检测，活孢率达100％。
本领域技术人员能够理解，本发明所使用的培养袋可以是现有技术中适用的任何产品。优选地，使用的是如中国实用新型专利ZL200620066657.9提供的一种封闭式真菌杀虫剂固体发酵培养袋。
本领域技术人员能够理解，虽然以上实施例中绿僵菌包括金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、黄绿绿僵菌(Metarhizium flavoviride)、贵州绿僵菌(Metarhizium guizhouense)，然而本发明并不局限于此。本工艺同样适合于平沙绿僵菌(M.pingshaense)、鳞腮绿僵菌(M.lepidiotae)、蚱蜢绿僵菌(M.acridum)、罗伯氏绿僵菌(M.robertsii)的固体培养，产孢量可达3.9-4.3％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种绿僵菌的袋式固体培养方法，包括以下步骤：
步骤S1，将绿僵菌液体种子接种于装有灭菌冷却的固体培养基的封闭式培养袋内，混匀后密封；
步骤S2，将所述培养袋平铺于培养架上进行固体发酵培养；
其特征在于，所述步骤S2的固体发酵培养包括如下步骤：
步骤S2.1，营养生长：在18-22℃的温度培养4-5天至菌丝生长密实；
步骤S2.2，产孢培养：将结块的培养基揉散、混匀，通入洁净空气，在24-26℃的温度密闭培养5-6天，揉散，开袋干燥。
2.根据权利要求1所述的绿僵菌的袋式固体培养方法，其特征在于，所述液体种子的液体培养基包括：粘米粉2％，白沙糖3％，K2HPO40.1％，MgSO40.05％，蛋白胨0.5％。
3.根据权利要求2所述的绿僵菌的袋式固体培养方法，其特征在于，所述液体种子为通过摇瓶进行液体发酵培养所得，培养工艺为：1000ml三角瓶装入700ml液体培养基，在121℃温度下灭菌冷却后接入绿僵菌斜面，在25-26℃温度下，200rpm往复旋转培养72h形成液体种子。
4.根据权利要求2所述的绿僵菌的袋式固体培养方法，其特征在于，所述液体种子为通过发酵罐进行液体发酵培养所得，培养工艺为：按发酵罐体积的70％装入液体培养基，灭菌后按10％接种量接入液体种子扩大培养，24-26℃培养72小时。
5.根据权利要求1所述的绿僵菌的袋式固体培养方法，其特征在于，所述的固体培养基为大米。
6.根据权利要求5所述的绿僵菌的袋式固体培养方法，其特征在于，所述固体培养基的制备方法为在大米中按重量的8-10％加入水，拌匀至培养基表面湿润，按每包1.9-2.1kg分装于保鲜袋内，放置20-30min至培养基吸干表面水份，揉散，密封，在121℃温度灭菌30min，冷却备用。
7.根据权利要求1所述的绿僵菌的袋式固体培养方法，其特征在于，所述的封闭式培养袋为封闭式真菌杀虫剂固体发酵培养袋。
8.根据权利要求7所述的绿僵菌的袋式固体培养方法，其特征在于，所述密封式真菌杀虫剂固体发酵培养袋被浸泡于5％新洁尔灭(苯扎溴铵)溶液内24h，取出晾干后备用。
9.根据权利要求1所述的绿僵菌的袋式固体培养方法，其特征在于，所述步骤S1中绿僵菌液体种子按1∶3-7的比例接种于装有灭菌冷却的固体培养基封闭式培养袋内。
10.根据权利要求1所述的绿僵菌的袋式固体培养方法，其特征在于，所述绿僵菌包括金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)、黄绿绿僵菌(Metarhizium fiavoviride)、贵州绿僵菌(Metarhizium guizhouense)、平沙绿僵菌(M.pingshaense)、鳞腮绿僵菌(M.lepidiotae)、蚱蜢绿僵菌(M.acridum)、罗伯氏绿僵菌(M.robertsii)的一种或多种。
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