CN104911111A - 一种金龟子绿僵菌固体培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种金龟子绿僵菌固体培养方法，将金龟子绿僵菌液体菌种接种到固体培养基后装入底面具有通孔的发酵箱中进行固体培养，固体培养前期，在18～22℃环境中，将盛有接种过金龟子绿僵菌的固体培养基的发酵箱在底面不具有通孔的空发酵箱上逐层堆叠4～8层，最上层的发酵箱盖上盖体，进行密闭式发酵3～4天；固体培养后期，打开最上层的发酵箱的盖体并将所有发酵箱隔开或将发酵箱错开堆叠，在温度为23～27℃、湿度为80％的环境中开放式发酵3～4天。本发明的有益效果在于：发酵过程中基本不需要进行湿度调控，发酵周期均≤8天，发酵产物的产孢水平均≥1×10¹⁰孢子/g发酵物，发酵质量稳定、污染率低，易于规模化生产。

Description

一种金龟子绿僵菌固体培养方法

技术领域

本发明属生物发酵方法领域，涉及一种真菌的固体培养方法，特别是涉及一种金龟子绿僵菌的固体培养方法。

背景技术

20世纪中期以来，由于化学杀虫剂无限制地使用，严重污染了环境和农林牧产品，危害了人畜健康，同时使自然生态系统遭到破坏。生物防治日益被人们所重视，利用昆虫病原微生物防治害虫是生物防治的重要手段之一。真菌杀虫剂由于具有良好的扩散效果、较长的宿存能力、独特的体壁入侵方式，以及对害虫不产生抗药性和易大量生产等特点，使得真菌杀虫剂在森林害虫、土壤害虫和刺吸式口器害虫的生物防治中具有明显的优势。其中，金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是世界性分布的杀虫真菌，能寄生8个目30个科昆虫，利用金龟子绿僵菌防治害虫的研究与实践已逾百年，其具有致病力强、对人、畜、作物无害、不杀伤天敌、不污染环境、持效期长等特点，是一种可持续防治害虫的优良制剂，也是当今用于生物防治的主要菌剂之一，可替代化学药剂的使用，在生物防治中具有重要的应用价值。

金龟子绿僵菌大量培养是满足生产上应用的基础。目前国内外金龟子绿僵菌固体培养一般采用单一的浅盘式、框架式或者塑料袋培养法，培养过程中对湿度要求高，环境因子调控困难，同时设备复杂、发酵周期长，污染率高，产品质量不稳定，生产效率较低，这些因素制约了绿僵菌的生产应用和防治效果。

公开号为CN101525577的中国发明专利公开了一种绿僵菌的固体培养方法，在固体培养前期采用框架式培养，在固体培养后期采用塑料袋法培养，固体培养基中具有营养原料麦麸和作为原料载体的玉米秸秆粉。将框架式和塑料袋法结合起来，虽然在一定程度上减少了污染几率和培养后期对湿度的要求，但培养前期菌丝生长的湿度无法保证，培养后期固体料通气不佳，生产效率仍然低下，产品质量不稳定。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种发酵周期短、产量高且产品质量稳定的金龟子绿僵菌固体培养方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种金龟子绿僵菌固体培养方法，将金龟子绿僵菌液体菌种接种到固体培养基后装入可堆叠的、底面具有通孔的发酵箱中，进行固体培养，包括两个时期，菌丝生长期(包含菌丝生长延滞期、对数生长期和生长稳定期)和产孢期(菌丝生长衰退期)；

所述的菌丝生长期为：在18～22℃环境中，将盛有接种过金龟子绿僵菌的固体培养基的发酵箱在空发酵箱上逐层堆叠4～8层，最上层的发酵箱盖上盖体，进行密闭式发酵3～4天，所述空发酵箱的底面不具有通孔；

所述的产孢期为：菌丝生长期后，打开最上层的发酵箱的盖体并将所有发酵箱隔开，或将发酵箱错开堆叠，在温度为23～27℃、湿度为80％的环境中进行开放式发酵3～4天。

本发明的有益效果在于：在固体培养前期堆叠4～8个发酵箱进行发酵(不包括底部的空发酵箱)，这可有效保证在菌丝生长期所需求的高湿度，使菌丝迅速长满整个培养基，同时极大降低培养过程中的污染几率；固体培养后期分离、隔开堆叠的发酵箱，采用开放式发酵，可有效改善培养基的通气性能，促进分生孢子的产生。同时，堆叠式发酵箱轻巧、移动方便、组装快捷、不受场地限制、容易清洗，可根据实际需要增减发酵箱数量，易实现规模化生产。使用本发明的金龟子绿僵菌的发酵过程中基本不用调控环境湿度，发酵周期平均≤8天，发酵产物的产孢水平均≥1×10¹⁰孢子/g发酵物。本发明的发酵质量稳定、污染率低，且不需要复杂的设备，对发酵室环境湿度要求低，降低了金龟子绿僵菌的生产技术门槛，可实现金龟子绿僵菌的规模化生产。

附图说明

图1为实施例1发酵过程固体料温度变化图。

图2为实施例2发酵过程固体料温度变化图。

图3为实施例1～5的发酵箱的立体图。

图4为实施例1～5的空发酵箱的立体图。

图5为实施例1～5固体培养前期发酵箱堆叠状态示意图。

图6为实施例1～5固体培养后期发酵箱隔开状态示意图。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：固体培养前期采用4～8个发酵箱堆叠进行密闭式发酵，保证在菌丝生长期所需求的高湿度，使菌丝迅速长满整个培养基，同时极大降低培养过程中的污染几率；固体培养后期采用开放式发酵，可有效改善培养基的通气性能，促进分生孢子的产生。

请参照图3～6，本发明提供一种金龟子绿僵菌固体培养方法，该方法将金龟子绿僵菌液体菌种接种到固体培养基后装入底面具有通孔的、可堆叠的发酵箱中，进行固体培养，包括两个时期，菌丝生长期和产孢期；

所述的菌丝生长期为：在18～22℃环境中，将盛有接种过金龟子绿僵菌的固体培养基的发酵箱在底层空发酵箱上逐层堆叠4～8层，最上层的发酵箱盖上盖体，进行密闭式发酵3～4天，所述空发酵箱的底面不具有通孔；

所述的产孢期为：菌丝生长期后，打开最上层的发酵箱的盖体并将所有发酵箱隔开，或将发酵箱错开堆叠，在温度为23～27℃、湿度为80％的环境中进行开放式发酵3～4天。

从上述描述可知，本发明的有益效果在于：在固体培养的前3～4天(接种后第1天为金龟子绿僵菌生长的延滞期，第2天为金龟子绿僵菌生长的对数生长期，第3～4天为菌丝生长稳定期，此3个时期为金龟子绿僵菌菌丝生长期)，在此期间采用4～8个发酵箱堆叠进行发酵(不包括底部的空发酵箱)，这可有效保证在菌丝生长期所需求的高湿度，使菌丝迅速长满整个培养基，同时极大降低了培养过程中的污染几率；固体培养的后期(为绿僵菌菌丝生长的衰退期，也是绿僵菌的产孢期)分离、隔开堆叠的发酵箱，采用开放式发酵，可有效改善培养基的通气性能，促进分生孢子的产生。同时，堆叠式发酵箱轻便、移动方便、不受场地限制、容易清洗，可根据实际需要增减发酵箱数量，易实现规模化生产。本发明固体培养工艺简单，不需要复杂设备，发酵期间基本不需要调控湿度，发酵周期短，产品质量稳定，降低了金龟子绿僵菌的生产技术门槛。

进一步的，进行固体培养前，先配制固体培养基，按体积份将麦麸3份、谷壳3份、米粉1份和玉米粉1份混合后得到固体培养料，每500g固体培养料混合后加入400～500g水得到所述固体培养基。

由上述描述可知，固体培养基配方中农副产品麦麸和谷壳占比大，并加入了米粉和玉米粉等，配制简单，原料价廉、来源广泛，降低了生产成本。

进一步的，固体培养基接种前，将固体培养基蒸汽高温灭菌30～50min，冷却后用于金龟子绿僵菌的固体培养。所述发酵箱中的接种过金龟子绿僵菌的固体培养基的厚度为3～5cm，所述发酵箱的内部高度为15cm～25cm。所述的发酵箱采用PP材质，所述通孔的直径为4～5mm。

由上述描述可知，堆叠时按照逐个累叠的方式进行，基层为空发酵箱(不打孔)，顶部用塑料盖盖好，以保证固体培养基的水分不会散失，故此过程中对环境湿度无要求；保持固体培养基的厚度为3～5cm，发酵箱内部高度15cm-25cm，底部密布4～5mm的通孔，培养温度设定为18～22℃。实验中发现当通孔过小的情况下影响发酵容器中的温湿度分散的均一性，将导致各箱层间的湿度相差大，发酵不均匀；而通孔过大后会出现培养基质漏到下层的情况，不利于生产。箱体高度太低会导致发酵时所产生的热量无法及时扩散，出现“烧料”现象，不利于菌种繁殖；箱体过高，会造成空间浪费，空间利用率下降，也会导致水蒸气和温度扩散范围过广达不到发酵的温湿要求。选择合适的范围，既能保证菌丝生长快速，又能避免发酵产热出现“烧料”现象。

本发明的具体实施方式有：

一种金龟子绿僵菌固体培养方法，包括如下步骤：

1液体菌种的培养

1.1菌种：产孢良好的金龟子绿僵菌。一般以斜面低温保存。

1.2斜面菌种：预先将金龟子绿僵菌菌种用试管斜面在25±1℃条件下传代培养、活化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为微生物培养中所通用的马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。

1.3液体培养基：为通用的马铃薯葡萄糖培养基，每个500ml三角瓶中装入200ml培养基，121℃下蒸汽高温灭菌50min，冷却后备用。

1.4接种：于无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培养基中。

1.5摇床培养：25±1℃恒温振荡培养箱中振荡培养60-72h，待长成粘稠菌丝体后即可接入固体培养基，进行固体培养。

2固体培养，包括如下步骤：

2.1固体培养基配方及制备：

金龟子绿僵菌固体培养基配方：以体积份为单位，配方中含麦麸3份，谷壳3份，米粉1份，玉米粉1份，每500g固体培养基混合后加入400～500g水。

制备方法：将各种原料分别称量，然后加入水后，搅拌均匀，装入塑料袋中，放入高压灭菌锅中，121℃下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。

2.2接种：在预先进行空间灭菌的密闭房间内进行，按10-20％的接种量(V/W)，将液体菌种倒入固体培养基中，搅拌均匀，装入已经过表面消毒的底部有孔、可堆叠的塑料发酵箱中(外尺寸：480×355×170mm，内尺寸：445×320×165mm)，培养料厚度3-5cm，随即转入发酵室培养。

2.3培养前期(第1～4天)：将上述装有接种后固体培养基的发酵箱3～8个堆叠起来放入发酵室中，放入20±2℃的发酵室中，培养3～4d，待固体培养基长满菌丝即可。该培养时期由于使用发酵箱堆叠，发酵空间密闭，因发酵产热散发出来固体培养基中的水分可有效地保持在培养容器中，可满足金龟子绿僵菌菌丝生长所需求的高湿度，所以该阶段无需对环境湿度进行调控。

2.4培养后期(第5～8天)：用木条(400×50×30mm)或类似物体将堆叠的发酵箱隔开、支起，或将发酵箱错开堆叠，提高培养料的通气性，保持培养室内温度在25±2℃，湿度80％左右，继续培养3～4天，待固体培养基内外长满绿色孢子后，将发酵产物置于阴凉通风处自然晾干即成粗粉剂(或在28～30℃烘干箱中烘24～36h，含水率≤10％)。

步骤1.2中所述马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基，具体配方为：含200g马铃薯(煮沸过滤)、20g葡萄糖、20g琼脂。步骤1.3中所述马铃薯葡萄糖培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基配方中去掉琼脂，其它物质比例及制作方法不变。

步骤2.1中所述的塑料袋为PP材质聚丙烯袋，该袋特点是可耐130℃以上的高温，适用于高压灭菌。

步骤2.2中所述接种量是指液体菌种体积与固体培养基重量的比(ml∶g)。

步骤2.2中所述的可堆叠的发酵箱为PP塑料材质，规格：外尺寸：480×355×170mm，内尺寸：445×320×165mm，底部密布直径4～5mm的圆孔。培养前进行表面消毒。

请参照图1以及图3～6，本发明的实施例1为：

1液体菌种的培养，包括如下步骤：

1.1菌种：金龟子绿僵菌MaYTTR-04菌株，福建省林业科学研究院森林保护研究所保存，为公知菌株。

1.2斜面菌种：预先将绿僵菌菌种用试管斜面培养基在25℃条件下传代培养、活化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

1.3液体培养基：配制马铃薯葡萄糖培养基2L，用500ml三角瓶中装入，每个装200ml培养基，121℃下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。

1.4接种：于无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培养基中。

1.5摇床培养：25±1℃恒温振荡培养箱中振荡培养72h，待长成粘稠菌丝体后即可接入固体培养基，进行金龟子绿僵菌固体培养。

2固体培养，包括如下步骤：

2.1固体培养基配方及制备：

金龟子绿僵菌固体培养基配方：按体积分麦麸3份，谷壳3份，米粉1份，玉米粉1份，混合均匀后，按每500g培养基加入400ml水进行混匀。

制备方法：将固体培养基的各组分分别称量，加入水后搅拌均匀，装入塑料袋中，放入高压灭菌锅中，121℃下蒸汽高温灭菌50min，冷却后备用。

2.2接种：在预先进行空间灭菌的密闭房间内进行，按10％的接种量，将液体菌种倒入固体培养基中，搅拌均匀，装入预先进行过表面消毒的、可堆叠的PP塑料发酵箱(底部有孔)中(培养基厚度5cm)，随即转入发酵室培养。培养过程中用ONESET HOBO温度记录仪自动记录培养过程温度。

2.3培养前期：将6个上述装有接种后固体培养基的塑料发酵箱堆叠放入22±1℃的发酵室中培养，3天后待固体培养基长满菌丝即可。该时期由于培养容器密闭，培养基自身湿度不会散失，所以对发酵室内湿度无特殊要求。

2.4培养后期：第5天，用木条(400×50×30mm)将堆叠的发酵箱逐个隔开、支起，或将发酵箱错开堆叠，采用开放式培养，或将发酵箱错开堆叠，可提高培养料的通气性，保持培养室内温度在25±2℃，湿度80％左右，继续培养，4d后，待固体料内外长满墨绿色孢子即可，将发酵产物置于阴凉通风处晾干即成粗粉剂。

3培养结果：发酵周期为8d，自然干燥后随机称取粗粉剂5g，用0.03％吐温-80溶液进行稀释，血球计数板计数，结果发酵产物平均含孢量为1.02×10¹⁰孢子/克粗粉剂。粗粉剂用于松墨天牛成虫的防治。

发酵过程中固体料温度见图1。从图中可以清晰地看出绿僵菌固体发酵过程中的不同生长时期，其中前12-24h为生长延滞期，固体料的温度与室温无明显差异，而延滞期后，菌丝开始迅速生长，固体料温度也随之快速上升，显著的高于室温，即菌丝的对数生长期，约1天后，固体料温度达到一个顶峰，随后稳定在一个较高的温度范围，26～28℃，菌丝大量生长，固体料完全被白色菌丝占据，此过程约2～3天。当固体料温度逐渐下降至25℃以下时，表层菌丝开始出现绿色孢子时，标志着进入菌丝生长衰退期，此时，将前期堆叠的发酵箱分隔、支起，固体料的温度迅速降低，孢子生长时期固体料中的生物活动没有对数生长期和生长稳定期剧烈，固体的的温度与室温差异不大。随着通气条件的变化，固体培养基内的菌丝逐渐长出绿色的孢子。此过程约3～4天。随后即可进行干燥，干燥后，即成绿僵菌固体发酵产物。

请参照图2以及图3～6，本发明的实施例2为：

1液体菌种的培养，包括如下步骤：

1.1菌种：金龟子绿僵菌MaYDTR-01菌株，福建省林业科学研究院森林保护研究所保存，为公知菌株。

1.2斜面菌种：同实施例1。

1.3液体培养基：同实施例1，共配制4L。

1.4接种：于同实施例1。

1.5摇床培养：同实施例1，不同的是摇床培养时间为84h。

2固体培养，包括如下步骤：

2.1固体培养基配方及制备：

绿僵菌固体培养基配方：按体积份为麦麸3份、谷壳3份、米粉1份和玉米粉1份，混合均匀后，按每500g培养基加入500ml水进行混匀。

制备方法：同实施例1。

2.2接种：同实施例1，不同的是培养料厚度3cm。

2.3菌丝生长期：同实施例1，不同的是8个发酵箱累叠，培养时间为3天。

2.4产孢期：同实施例1。

3培养结果：发酵周期为8天，自然干燥后随机称取粗粉剂5g，用0.03％吐温-80溶液进行稀释，然后用血球计数板计数，结果发酵产物平均含孢量为1.08×10¹⁰孢子/克粗粉剂。粗粉剂用于木毒蛾的林间防治。

发酵过程中固体料温度见图2。从图中可以清晰地看出绿僵菌固体发酵过程中的不同生长时期，其中前12-24h为生长延滞期，固体料的温度与室温无明显差异，而延滞期后，菌丝开始迅速生长，固体料温度也随之快速上升，显著的高于室温，即菌丝的对数生长期，约1天后，固体料温度达到一个较高值，随后稳定在一个较高的温度范围，26～28℃，菌丝大量生长，固体料完全被白色菌丝占据，此过程约2～3天。当固体料温度逐渐下降至24℃以下时，表层菌丝开始出现绿色孢子时，标志着进入菌丝生长衰退期，此时，将前期堆叠的发酵箱分隔、支起，固体料的温度迅速降低，孢子生长时期固体料中的生物活动没有对数生长期和生长稳定期剧烈，固体的温度与室温差异不大。随着通气条件的变化，固体培养基内的菌丝逐渐长出绿色的孢子。此过程约3～4天。随后即可进行干燥，干燥后，即成绿僵菌固体发酵产物。

请参照图3～6，本发明的实施例3～5为：

以下实施例中所使用的菌株均为公知菌株。其区别于在于这些菌株自身生物学特性存在一定的区别以及防治对象不同。

表1为其他实施例配比与发酵产物情况。

表1

实施效果：

使用本发明的金龟子绿僵菌的发酵周期均≤8天，发酵产物的产孢水平均≥1×10¹⁰孢子/g发酵物。发酵产品已应用于多种林业主要害虫的防治中，取得了良好的防治效果；本发明的发酵质量稳定、污染率低，且不需要复杂的设备，对发酵室环境湿度要求低，降低了金龟子绿僵菌的生产技术门槛，可实现金龟子绿僵菌的规模化生产。

综上所述，本发明提供的金龟子绿僵菌固体培养方法有益效果有：

1、根据金龟子绿僵菌生长特性，在固体培养前期(绿僵菌生长的延滞期、对数生长期和菌丝生长稳定期，菌丝生长期)，使用发酵箱堆叠培养，培养空间密闭，因发酵产热散发出来固体培养基中的水分可有效地保持在培养容器中，保证了培养环境始终保持较高的湿度，从而满足菌丝生长需要的高湿度，克服了开放式培养中湿度无法控制的缺点；本发明中发酵前期使用发酵箱堆叠发酵培养，使得培养料与外界隔绝，大大降低了传统浅盘或框架式发酵过程中早期杂菌污染几率，同时由于菌丝在高湿度下生长迅速，绿僵菌菌丝很快长满整个培养基，成为优势菌群，杂菌滋生的可能性大大降低，且即使出现污染的情况，由于每发酵箱的培养空间独立，不会扩散蔓延；在绿僵菌生长后期(菌丝生长衰退期，产孢期)，对环境湿度要求没有菌丝生长期高，只需发酵室内湿度保持在80％左右即可，甚至过高的湿度，会使得孢子二次萌发，或使得杂菌滋生，从而影响产孢的进程，故在此过程中，采用开放式培养，增加通气量，可促进金龟子绿僵菌更快产孢，因此，本发明金龟子绿僵菌固体培养过程中，基本不用调控环境湿度；

2、本发明用于培养金龟子绿僵菌的固体培养基配方简单，原料主要为农副产品麦麸和谷壳以及米粉和玉米粉，且麦麸和谷壳的占比高，廉价易得，成本低，制作简单，不仅使农业废弃物得以有效利用，同时，固体培养基的间隙度、疏松度合适，通气性良好，培养过程中无需额外通气；

3、本发明的金龟子绿僵菌固体培养方法，工艺简单，不需要复杂设备，发酵周期短，极大地提高了生产效率，同时堆叠式发酵箱轻便、装卸方便、机动灵活、可根据生产量增减发酵箱数量，不受场地限制，生产可实现规模化，易控制，成功率高，产品质量稳定，可为生产单位提供优质的金龟子绿僵菌菌剂，具有显著的社会和经济效益。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：将金龟子绿僵菌液体菌种接种到固体培养基后装入可堆叠的、底面具有通孔的发酵箱中，进行固体培养，包括两个时期，菌丝生长期和产孢期；

所述的菌丝生长期为：在18～22℃环境中，将盛有接种过金龟子绿僵菌的固体培养基的发酵箱在空发酵箱上逐层堆叠4～8层，最上层的发酵箱盖上盖体，进行密闭式发酵3～4天，所述空发酵箱的底面不具有通孔；

所述的产孢期为：菌丝生长期后，打开最上层的发酵箱的盖体并将所有发酵箱隔开，或将发酵箱错开堆叠，在温度为23～27℃、湿度为80％的环境中进行开放式发酵3～4天。

2.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：进行固体培养前，先配制固体培养基，即按体积份将麦麸3份、谷壳3份、米粉1份和玉米粉1份混合后得到固体培养料，每500g固体培养料混合后加入400～500g水搅拌后得到所述固体培养基。

3.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：固体培养基接种前，将固体培养基蒸汽高温灭菌30～50min，冷却后用于金龟子绿僵菌的固体培养。

4.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：所述发酵箱的内部高度为15～25cm。

5.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：所述发酵箱中的接种过金龟子绿僵菌的固体培养基的厚度为3～5cm。

6.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：所述的发酵箱采用PP材质，所述通孔的直径为4～5mm。

7.根据权利要求1所述的金龟子绿僵菌固体培养方法，其特征在于：一种金龟子绿僵菌固体培养方法，包括如下步骤：

步骤1、液体菌种的培养：将金龟子绿僵菌菌种用盛有斜面培养基的试管在25±1℃条件下传代培养、活化，当所述斜面培养基的斜面长满孢子时于无菌操作台中，从所述斜面培养基的斜面挑取少量孢子及菌苔接入经蒸汽高温灭菌并冷却至室温的的液体培养基中；接种后的液体培养基在恒温振荡箱24～26℃恒温培养60-72h，待长成粘稠菌丝体后即得所述液体菌种；

所述斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基，所述马铃薯葡萄糖琼脂培养基按重量份包括200份马铃薯、20份葡萄糖和20份琼脂；所述液体培养基为马铃薯葡萄糖培养基，所述马铃薯葡萄糖培养基按重量份包括200份马铃薯和20份葡萄糖；

步骤2、固体培养：按体积份将麦麸3份、谷壳3份、米粉1份和玉米粉1份混合后得到固体培养料，每500g固体培养料混合后加入400～500g水搅拌后得到所述固体培养基，将所述固体培养基进行蒸汽高压灭菌30～50min，冷却后将所述液体菌种按每100g固体培养基中倒入10～20mL液体菌种的接种量接种到固体培养基中并搅拌，搅拌后将接种过金龟子绿僵菌的固体培养基装入经过消毒的底部具有直径为4～5mm通孔的PP材质的发酵箱中，进行固体培养，包括两个时期，菌丝生长期和产孢期；

所述的菌丝生长期为：在18～22℃环境中，将盛有接种过金龟子绿僵菌的固体培养基的、可堆叠的发酵箱在空发酵箱上逐层堆叠4～8层，最上层的发酵箱盖上盖体，进行密闭式发酵3～4天，所述空发酵箱的底面不具有通孔；

所述的产孢期为：菌丝生长期后，打开最上层的发酵箱的盖体并将所有发酵箱隔开，或将发酵箱错开堆叠，在温度为23～27℃、湿度为80％的环境中进行开放式发酵3～4天；

所述发酵箱的内部高度为15～25cm，所述发酵箱中的接种过金龟子绿僵菌的固体培养基的厚度为3～5cm。