CN1415736A - 低值陈米作为丝孢类真菌孢子粉主要原料的固相发酵方法 - Google Patents
低值陈米作为丝孢类真菌孢子粉主要原料的固相发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种低值陈米作为丝孢类真菌孢子粉主要原料的固相发酵方法。它的步骤如下：将粮库中库存较久的低值陈米浸泡后，经蒸汽灭菌和熟化至5～6成熟，冷却后，按重量体积百分比为：10－20％的液相发酵的菌丝液，加入添加剂，或者直接用上一轮生产的孢子粉配成孢子悬浮液体，加入添加剂，与适度熟化的大米混合接种；然后，将上述混合料装入透明或半透明塑料发酵箱的内箱后加盖，或者摊于平底盘中覆以保鲜膜保湿及防止杂菌污染，上架培养；再将上述发酵料加温烘干或风干、过筛即可。本发明的优点：1)创新性强；2)工艺流程简化、杂菌污染杜绝、生产周期缩短并可控；3)孢子粉纯度高、生产过程无废水废气产生；3)投资省、管理方便；4)原料易得：5)效益高、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种低值陈米作为丝孢类真菌孢子粉主要原料的固相发酵方法。
背景技术
研究开发以有效侵染体为活性成份的微生物制剂控制作物害虫，杀虫真菌是可资利用的重要资源，因为只有真菌能够在自然条件下通过体壁接触感染并杀死害虫，不仅对刺吸式口器害虫有效，而且对咀嚼式口器害虫也有效。目前已知的丝孢类杀虫真菌(Entomopathogenic hyphomycetes)有数十种，但国内外重点研究和开发应用的菌种主要集中在白僵菌、绿僵菌及拟青霉等少数种类。根据现有研究报道，杀虫真菌的分生孢子(有效侵染体)可通过各种方式附着到虫体表面，在适宜条件下萌发并产生芽管，穿透寄主体壁进入血腔，继而利用寄主的营养在血腔中繁殖，当血腔中充满菌丝体时寄主死亡变僵，若遇适合的环境条件菌丝便从体壁长出分生孢子梗并产生分生孢子，开始新的侵染。以此种方式产生的分生孢子是气生性的，称为气生分生孢子，对昆虫寄主而言是最有效的自然侵染体。在真菌杀虫剂的研究开发中，气生分生孢子粉是配制孢子油剂、孢子乳悬剂及孢子可湿性粉剂等各类孢子制剂的有效成份，其纯度和质量直接关系到孢子制剂的质量、寿命及田间应用效果。
气生分生孢子的工业生产一般采用两相发酵原理，即液相发酵生产菌丝液，再转入固体基质上发酵(即固相发酵)生产孢子。将孢子从固体发酵基质上分离并以适当方式收集起来，便获得孢子粉。基于两相发酵生产气生分生孢子粉的一般原理，国内外已经开发出了一系列专利或非专利生产工艺技术，经查新检索，主要包括以下专利技术：
1)中国发明专利CN1014427B(公开日：87-10-07)公开了一种白僵菌的固体培养方法。该方法除了培养原料中有部分麦麸或者细米糠或者面粉以外，其特点是在培养原料中以土为主并加少量尿素和钙镁磷肥，其中土的比例为50～85％，未涉及以大米作为基质的固相发酵，亦未见描述孢子粉的收获技术和产品的孢子含量及纯度。
2)中国发明专利CN1149394A(公开日：97-05-14)公开了一种用糖厂废料液相发酵生产淡紫拟青霉菌丝制剂防治作物线虫病的方法，未涉及固相发酵和气生分生孢子。
3)中国发明专利CN1149393A(公开日：97-05-14)公开了一种用啤酒厂废料生产淡紫拟青霉菌丝制剂防治作物线虫病的方法，未涉及利用大米的固相发酵和气生分生孢子。
4)中国发明专利CN1127592A，(公开日：96-07-31)公开了一种通过液相发相生产毒力虫霉(非丝孢类真菌)作为灭蚜制剂的工艺，未涉及固相发酵和气生分生孢子。
5)中国发明专利CN1138096A，(公开日：96-12-18)公开了一种用于防治大豆胞囊线虫病的淡紫拟青霉的液体发酵制剂，未涉及固相发酵和气生分生孢子。
6)中国发明专利CN1093524A(公开日：94-10-19)公开了一种聚合凝胶生物菌杀虫剂的制备工艺，未涉及固相发酵和气生分生孢子。
7)中国发明专利CN1225236A(公开日：99-08-11)公开了一种从自然土壤中分离出来的厚垣轮枝菌为主效成份、用于生物防治植物寄生线虫病害的颗粒状制剂及其生产过程，产品每克含厚垣孢子500～5000个，未涉及气生分生孢子。
8)美国专利USP5968808(公开日：99-10-19)公开了一种高效生产大批耐干旱真菌孢子(如玫烟色拟青霉)的技术和一种富氮、富碳的液体培养基，未涉及固相发酵和气生分生孢子。
9)美国专利USP4925663(公开日：90-05-15)公开了一种防治火蚁的含白僵菌农用组合物制剂。公开的白僵菌生产方法是将大米盛入塑料袋(750克/袋)灭菌，然后接种并在控温(25～27℃)控湿(70％RH)控光(日照16小时)的培养室中培养2～3天，再转入托盘发酵12～15天，共发酵14～18天；大米发酵产物缓慢碾碎后备用。该方法制作的产品是碾碎米粒与孢子、菌丝的混合物，与高纯度孢子粉无关，未涉及专用的固体发酵箱和气生分生孢子的收获。
10)美国专利USP5413784(公开日：95-05-09)公开了一种防治棉铃象鼻虫、甘薯粉虱、棉盲蝽的生物杀虫剂配方，由昆虫病原真菌如球孢白僵菌ATCC-74040、昆虫引诱剂和取食刺激物等组成，未涉及发酵工艺。
11)美国专利USP5579562(公开日：98-06-02)公开了一种以液体发酵生产的芽生孢子为基础的颗粒状真菌杀虫剂的配方及制备工艺，真菌可以是白僵菌、轮枝菌、绿僵菌、拟青霉等，未涉及固相发酵和气生分生孢子。
12)美国专利USP5888989(公开日：99-05-30)公开了有关Silafuofen的杀昆虫及螨类的组合配方，含至少一种昆虫病原真菌，可以是轮枝菌、绿僵菌、白僵菌或拟青霉，未涉及发酵工艺。
13)美国专利USP6261553(公开日：01-07-21)公开了一种基于两相发酵法生产白僵菌孢子粉用于蝗虫防治的方法。其固相发酵采用了大麦片(barley flakes)作为产孢基质，但未涉及使用大米作为固相发酵基质。
14)美国专利USP5418164(公开日：95-05-23)公开了一种有可能用于害虫防治的无载体微生物细胞颗粒的制作方法，未涉及固相发酵和气生分生孢子。
15)美国专利USP5804208(公开日：98-09-08)公开了一种由粗麦粉为载体吸附金龟子绿僵菌孢子粉而制作微生物颗粒剂用于害虫防治的方法，未涉及以大米作为基质的固相发酵和气生分生孢子。
16)美国专利USP4942030(公开日：90-07-17)公开了一株可用防治粉虱的高毒力玫烟色拟青霉菌株ATCC20874，未涉及发酵工艺。
17)美国专利USP5360607(公开日：94-11-01)公开了一种以玫烟色拟青霉菌株ATCC20874为基础的新型真菌杀虫剂的配方及使用方法，未涉及发酵工艺。
18)美国专利USP5730973(公开日：98-03-24)公开了一种水分散的球孢白僵菌孢子颗粒剂的配方和制作方法，未涉及发酵工艺。
19)美国专利USP5512280(公开日：96-04-30)公开了一种绿僵菌、白僵菌等杀虫真菌分生孢子的单分散水悬液的配方及长期贮存方法，关键在于所用高浓度表面活性剂与真菌孢子完全相容，未涉及发酵工艺。
20)世界专利WO9525430(公开日：95-09-28)公布了一种防治蟑螂、木工蚁和小家蚁的高致病力球孢白僵菌分离菌株的组合配方及独特制剂方法，该配方幅花生或玉米粉、硅藻土或硅土及孢子粉组成，未涉及发酵工艺。
21)欧洲专利EP0570089(公开日：93-11-18)公开了一种以白僵菌菌株ATCC74037为基础的菌剂配方及液相发酵用培养基配方，未涉及以大米作为基质的固相发酵和气生分生孢子。
23)欧洲专利EP0406103(公开日：91-01-02)公开了一种白僵菌与高岭土混合制备真菌杀虫剂粉剂的方法，未涉及用大米固相发酵的技术。
24)世界专利WO9309672(公开日：93-05-27)公开了一种利用金龟子绿僵菌防治白蚁的孢子制剂及其应用技术，未涉及发酵工艺。
25)日本专利JP2000083471(公开日：00-03-28)公开了一种用锯木粉、米糠、蝶蛹和水的混合基质培养拟青霉的方法，未涉及以大米为基质的固相发酵技术。
26)俄罗斯专利RU2120756(公开日：98-10-27)公开了一个蜡蚧轮枝菌菌株F-8的杀螨活性及其实验室琼脂平板培养方法，未涉及以大米作为基质的固相发酵和气生分生孢子。
27)日本专利JP10218716(公开日：98-08-18)公开了一种真菌杀虫剂的原料及制备方法，涉及丝孢类真菌如绿僵菌的培养及培养基的组分：米糠、珍珠岩和水，未涉及以大米作为基质的固相发酵技术。
28)日本专利JP11269019(公开日：99-10-05)公开了一种摇瓶发酵生产白僵菌作为真菌杀虫物质的方法，未涉及以大米作为基质的固相发酵技术和气生分生孢子。
专利查新结果表明，国内外未见利用低值陈米固相发酵生产丝孢类真菌孢子粉的记录。有关丝孢类杀虫真菌生产、菌剂加工及应用的非专利技术见诸于国内外许多研究报道及文献综述(如：Feng，M.G..(冯明光)，et al.[1994]Biocontrol Sci.Techn.4：3-340)。我国在利用球孢白僵菌防治林区松毛虫的长期实践中，经数十年的努力，也形成了基于两相发酵原理生产白僵菌孢子粉的技术工艺(殷风鸣，陈权才[1996]安徽农业大学学报23：313-320；殷风鸣等[1996]安徽农业大学学报23：321-325)。国内外的技术研发现状表明，丝孢类杀虫真菌孢子粉的两相发酵法生产工艺在技术路线上是很成熟的。对于特定的菌种菌株，主要的技术关键在于因地制宜地筛选采用廉价易得的农副产品作为两相发酵的营养虫的生物学习性和制剂应用的实际需要出发，所生产孢子粉的纯度必须与后续剂型设计的要求相结合。如施于土壤中防治地下害虫的制剂一般用量大，制剂中孢子含量可以较低；而用于叶面害虫防治一般采用喷雾形式，最佳剂型是乳悬剂或可湿性粉剂，稀释倍数不宜过低，因而要求孢子粉的纯度尽可能高。国内林业部门防治松毛虫用的白僵菌孢子粉的两相法生产工艺是用稻壳和麦麸按6∶4的比例混合作为固相发酵产孢的基质，其特点是成本较低，产孢后需经晾干过程再用旋风分离设备将孢子收获，所获孢子粉不可避免地含有尘灰杂质，孢子原粉的含孢量一般为250亿/克，含水量达12～14％，生产周期一般在15天左右。由于原粉的含孢量太低，需要进一步提纯精制才能达到1000亿/克而满足高标准孢子制剂的配制要求，由此大大提升孢子粉生产成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种低值陈米作为丝孢类真菌孢子粉主要原料的固相发酵方法。
它的步骤如下
1)将粮库中库存较久的低值陈米浸泡后，经蒸汽灭菌和熟化至5～6成熟，冷却后，按重量体积百分比为：10-20％的液相发酵的菌丝液，加入添加剂，或者直接用上一轮生产的孢子粉配成孢子悬浮液体，加入添加剂，与适度熟化的大米混合接种；
2)然后，将上述混合料装入透明或半透明塑料发酵箱的内箱后加盖，或者摊于平底盘中覆以保鲜膜保湿及防止杂菌污染，在20-30℃的温度下上架培养6～7天；
3)再将上述发酵料在30-35℃下加温烘干或风干12-24小时后，采用过100～200目机械振动筛的方法过筛，即可。
本发明的优点：
1)创新性强：根据“固体颗粒越小表面积越大”的物理学原理和菌体产孢对氧气的需求以及适当的湿度要求，采用熟化度恰到好处的的稻米进行固相发酵，既保证了发酵过程中的氧气需求和湿度自动调控(米粒中含水)，又保证了足够大的固相产孢面积。这是本发明最为合理的生物学和物理学解释，不仅适用于丝孢类杀虫真菌孢子粉的生产，还原则上适用于包括植物病害拮抗微生物等其它丝孢类真菌孢子粉的生产。
2)工艺流程简化、杂菌污染杜绝、生产周期缩短并可控：从液相发酵到收孢的整个生产过程一般在9~10天内完成，若直接用孢子悬浮液接种只需7~8天，生产周期比传统的两相发酵法缩短1/3，生产过程中排除了杂菌污染的机会。
3)孢子粉纯度高、生产过程无废水废气产生：经振动过筛或收孢机直接收获的孢子粉，无粉尘杂质，极纯。在整个生产过程中，液相发相的菌液全部按比例拌入熟化的米粒中，无任何废液产生，更无废气产生。
4)投资省、管理方便：与传统的两相发酵法相比，利用低值陈米生产孢子粉的工艺，固相发酵车间只需控温控光，无需控湿，因而投资省，管理方便。
4)原料易得：大型粮库中的陈谷需每年置换，用作真菌杀虫剂的生产原料，为低值陈米的合理利用开辟了一条新途径。
5)效益高、成本低：利用低值陈米生产丝孢类杀虫真菌的高纯度孢子粉(＞1000亿/克)，得率为30克/公斤以上，仅需10克配制成孢子制剂就可满足1亩地喷雾一次。低值陈米的批量进价不超过1.5元/公斤，害虫防治每亩次的孢子粉原料成本仅0.5元左右。
具体实施方式
通过吸收国内外的经验教训，发明人对现行两相发酵法进行了大幅改进，并成功地用于生产球孢白僵菌SG8702、金龟子绿僵菌和玫烟色拟青霉Pfr116的高纯度气生分生孢子粉。液相发酵采用20％马铃薯煮汁或15～20％麦麸浸汁加2％食用蔗糖、0.1％蛋白胨、0.01％ NaNO3、0.01％ KCl、0.025％ MgSO4、0.005％ MnSO4、0.005％ FeSO4及0.05％ KH2PO4组成的低成本营养液配方，经40～48小时发酵转入固相发酵产孢。
固相发酵采用粮库中库存较久的低值陈米作为主要基质，将稻米浸泡后经蒸汽灭菌和熟化至5～6成熟，经冷却后，按10％的比例(W/V)将液相发酵的菌丝液或直接用上一轮生产的孢子粉配成孢子悬浮液体与适度熟化的大米混合接种，菌丝液或孢子悬浮液中添加微量有助于孢子形成和pH平衡的配方优化添加剂(W/V：KNO3 0.02～0.8％，KH2PO4 0.02～0.2％及MgSO4 0.005～0.095％)。然后，将上述混合料装入透明或半透明塑料发酵箱的内箱后加盖，或摊于平底盘中覆以保鲜膜保湿及防止杂菌污染，上架培养。在25℃左右的温度下培养6～7天，所有米粒表面长满孢子粉，此时终止发酵，通风干燥1～2天，即可过振动筛收获孢子粉；或直接将发酵物批量倒入进口收孢机进行分离而收获孢子粉。过筛收获的孢子粉含水量一般不超过10％(否则不宜过筛)，含孢量达1000亿/克以上，活孢率90％以上，再经数小时常温真空抽干，孢子粉含水量可轻易降至5％左右。收孢机收获的孢子粉含水量一般不超过8％，含孢量达1000亿/克以上，活孢率90％以上，可直接用于配制孢子制剂。
发酵箱由外箱体、外箱盖和内箱体组成，外箱体长20～60厘米，宽10～40厘米，高5～15厘米；内箱体长宽高尺寸与外箱体内壁尺寸吻合，内箱体底部密布小孔，与外箱体相通，内箱底设置4～8个0.5～2厘米
丝孢类真菌是指在分类上属于半知菌亚门(Deuteromycotina)丝孢纲(Hyphomycetes)的种类：具有杀虫用途的白僵菌(Beauveria spp.)、绿僵菌(Metarhizium spp.)、拟青霉(Paecilomyces spp.)、座壳孢(Aschersonia spp.)、野村菌(Nomuraea spp.)、被毛孢(Hirsutella spp.)、轮枝菌(Verticillium spp.)，用于植物病害控制的拮抗真菌：木霉(Trichoderma spp.)。
实施例l
采用本发明方法生产球孢白僵菌SG8702菌株的高纯度气生分生孢子粉，用大米6公斤，经灭菌熟化，接入液相发酵48小时的菌丝液并按比例加入添加剂，装箱后在25℃下经6天固体发酵和35℃下烘干1天过120目筛，再经室温真空抽干12小时，获得孢子粉189克(产粉率3.15％)，含水量为5.25％，含孢量为1480亿/克，活孢率为98.7％。实施例2
采用本发明方法生产玫烟色拟青霉Pfr116菌株的高纯度气生分生孢子粉，用大米7公斤，经灭菌熟化，接入液相发酵48小时的菌丝液并按比例加入添加剂，装箱后在25℃下经8天固体发酵和35℃下烘干1天过120目筛，再经室温真空抽干18小时，获得孢子粉187.6克(产粉率2.68％)，含水量为3.16％，含孢量为1352亿/克，活孢率为91.2％。
实施例3
采用本发明方法生产金龟子绿僵菌ZD-15菌株的高纯度气生分生孢子粉，用大米0.85公斤，经灭菌熟化，接入液相发酵48小时的菌丝液并按比例加入添加剂，装盘后在25℃下经9天固体发酵和35℃下烘干1天过120目筛，再经室温真空抽干24小时，获得孢子粉27.65克(得率3.25％)，含水量为4.16％，含孢量为1215亿/克，活孢率为92.3％。
Claims (4)
1.一种低值陈米作为丝孢类真菌孢子粉主要原料的固相发酵方法，其特征在于，它的步骤如下
1)将粮库中库存较久的低值陈米浸泡后，经蒸汽灭菌和熟化至5～6成熟，冷却后，按重量体积百分比为：10-20％的液相发酵的菌丝液，加入添加剂，或者直接用上一轮生产的孢子粉配成孢子悬浮液体，加入添加剂，与适度熟化的大米混合接种；
2)然后，将上述混合料装入透明或半透明塑料发酵箱的内箱后加盖，或者摊于平底盘中覆以保鲜膜保湿及防止杂菌污染，在20-30℃的温度下上架培养6～7天；
3)再将上述发酵料在30-35℃下加温烘干或风干12-24小时后，采用过100～200目机械振动筛的方法过筛，即可。
2.根据权利要求1所述的一种低值陈米作为丝孢类真菌孢子粉主要原料的固相发酵方法，其特征在于所说添加剂配方的重量体积百分比为：KNO30.02～0.8％，KH2PO4 0.02～0.2％及MgSO4 0.005～0.095％。
3.根据权利要求1所述的一种低值陈米作为丝孢类真菌孢子粉主要原料的固相发酵方法，其特征在于，所说的发酵箱由外箱体、外箱盖和内箱体组成，外箱体长20～60厘米，宽10～40厘米，高5～15厘米；内箱体长宽高尺寸与外箱体内壁尺寸吻合，内箱体底部密布小孔，与外箱体相通，内箱底设置4～8个0.5～2厘米高的支柱。
4.根据权利要求1所述的一种低值陈米作为丝孢类真菌孢子粉主要原料的固相发酵方法，其特征在于，所说的丝孢类真菌是指在分类上属于半知菌亚门丝孢纲的种类：具有杀虫用途的白僵菌、绿僵菌、拟青霉、座壳孢、野村菌、被毛孢、轮枝菌，用于植物病害控制的拮抗真菌：木霉。
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