CN107916227B - 一种球孢白僵菌菌株对酪氨酸酶活性的抑制 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BACC1632，该菌株已作为专利菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC NO：12876。该菌株对酪氨酸酶二酚酶抑制率为60.49％。

Description

一种球孢白僵菌菌株对酪氨酸酶活性的抑制
技术领域
本发明涉及一种球孢虫草无性型—球孢白僵菌菌株BACC1632，属于微生物领域。
背景技术
人的面部皮肤色素沉着归根结底是由黑色素沉着所造成的。酪氨酸酶(Tyrosinase,EC.1.14.18.1)在皮肤黑色素沉淀或变态过程中具有重要作用，如黑斑、黑素瘤的形成。最近有报道说，酪氨酸酶与帕金森病和神经衰退疾病有关。Tyr广泛存在于人、动物、植物和微生物中，属需氧氧化酶，是目前己知的生物体中参与黑色素(Melanin)合成的关键酶，其表达和活性决定着黑色素生成的速度和产量，控制其活力即可控制黑色素生成量。酪氨酸酶的异常表达引起了各种各样的皮肤病，如老年斑及光照损伤等，它还与人脑中的神经黑色素形成及神经退行性病变相关的帕金森病有关，因此酪氨酸酶抑制剂临床应用于与黑色素失调相关疾病的治疗且在美白化妆品及日晒变黑应用方面具有重要作用。
鉴于酪氨酸酶上述重要生理功能，开展对天然植物源酪氨酸酶调节剂的研究，不仅对于色素型皮肤病的治疗，增白美容化妆品配方的研制也有着重要的作用。
白僵菌[Beauveria bassiana(Bals.)]是发现最早的一种虫草类真菌，是一类专化性比较强的昆虫病原微生物，不仅是很好的生物防治材料，也是最具潜力从中发现生物活性物质的材料。2001年李增智等在科学通报撰文(第46卷第1期2001年1月)证实球孢虫草Cordycepsbassiana Li,LI,Huang&Fan spnov是球孢白僵菌的有性型，这样，球孢白僵菌就和虫草密切联系起来。白僵蚕是由白僵菌感染家蚕后形成的僵虫。
我国古代就有利用白僵蚕用药和美白功效的记载。同时，白僵蚕含有氨基酸和活性丝光素物质草酸铵，有营养皮肤和美容作用僵蚕所含蛋白质有刺激上皮脂腺，调节性激素分泌的作用，因而对女性性激素分泌失调引起的黄褐斑有一定疗效。僵蚕维生素E的含量为9.89％，维生素E能清除自由基，抗脂质氧化形成的老年斑，其所含的活性丝光素能促使皮肤细胞新生，调节皮脂，改善皮肤微循环，可增白防晒，消除色素沉着，保持皮肤弹性。白僵蚕还含有有蛋白酶壳质酶脂酶等水解酶，可消化角质，分解色素，防疤痕去粉刺治瘀斑的作用。2015版已使用化妆品原料名称目录中，1149-01147白僵菌(BEAUVEERIA BASSIANA)提取物，列入其中。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种球孢白僵菌菌株，该菌株对酪氨酸酶具有较高抑制活性；本发明的目的之二是提供由该白僵菌孢子粉制备的提取物。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
从二十株不同寄主来源的白僵菌中筛选出一株对酪氨酸酶抑制率最高的球孢白僵菌，其分类命名为(Beauveria bassiana)BACC1632，该菌株已作为专利菌种保藏于位于我国北京的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC NO：12876，保藏日期：2016年9月18日。
该菌株对酪氨酸酶二酚酶抑制率为60.49％，明显高于其他筛选的菌株。
该菌株可按现有技术公开的培养方法(如CN 102286385 A、CN 102329837 A、CN101724571 A等专利公开的人工培养方法)进行人工培养获得白僵菌孢子粉。
本发明进一步提供利用所述白僵菌孢子粉制备的提取物，所述提取物按如下方法制备：取白僵菌孢子粉，以水或有机溶剂提取。
所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等；所述提取物方法包括浸泡提取、超声提取、回流提取、渗漉提取、煎煮提取等。
优选的，所述提取物按如下方法制备：取白僵菌孢子粉，加8～12倍(w/v)水，用磁性震荡器加热至45～50℃，保持1.5～2小时，用高压均质机处理2～3次，4000r/min，每次2～3分钟，过滤，浓缩，即得。该提取物与市售白僵蚕相比，对酪氨酸甲酚酶的抑制率和对酪氨酸二酚酶抑制率，分别提高65.98％和205.04％。
本发明白僵蚕菌株培养的孢子粉或其提取物具有较高的酪氨酸酶抑制活性，可作为美白、祛斑化妆品的主要原料，进行化妆品生产。
生物材料保藏信息
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BACC1632，已作为专利菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号：CGMCC NO：12876，保藏日期：2016年9月18日。
具体实施方式
实施例1 白僵菌菌株的筛选
对二十株不同寄主来源的白僵菌进行研究测定，分别取其培养的孢子粉用甲醇提取，提取物以酪氨酸酶单酚酶和二酚酶抑制率为指标进行筛选实验，选择酪氨酸酶抑制活性最高的球孢白僵菌。
测定方法：酪氨酸酶活性抑制试验
酪氨酸酶的单酚酶活力测定是以0.5mmol/L L-酪氨酸为底物，而二酚酶活力的测定则以0.5mmol/L L-多巴(L-DOPA)为底物。测定单酚酶(表1)和二酚酶(表2)的活力时，酶的最终浓度分别为25.0μg/ml和5.0μg/ml。酪氨酸溶液、多巴溶液、酶溶液及样品溶液均以50mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.8)配制。按表1-2准确吸取1、2、3、4组反应液，充分混匀后在37℃水浴温育30min迅速转移至反应体系为1ml的比色皿中，于475nm处测吸光度A，按公式I求抑制率。
表1 反应液组成(单酚酶)
实验组号 第1组 第2组 第3组 第4组
底物/ml 0.5 0 0.5 0
样品/ml 0 0 0.25 0.25
PBS(pH＝6.8)/ml 0.25 0.75 0 0.5
酪氨酸酶溶液/ml 0.25 0.25 0.25 0.25
合计/ml 1.0 1.0 1.0 1.0
表2 反应液组成(二酚酶)
实验组号 第1组 第2组 第3组 第4组
底物/ml 0.7 0 0.7 0
样品/ml 0 0 0.25 0.25
PBS(pH＝6.8)/ml 0.25 0.95 0 0.7
酪氨酸酶溶液/ml 0.05 0.05 0.05 0.05
合计/ml 1.0 1.0 1.0 1.0
抑制率＝[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100％ (I)
结果见表3。
表3 不同寄主的白僵菌提取物对酪氨酸酶抑制率
Figure BDA0001127675660000041
注：由于单酚酶的抑制率往往出现迟滞性，所以，常以二酚酶作为测定依据。
由表3结果可知，3号白僵菌的甲醇提取物对酪氨酸酶的抑制活性最高。
实施例2 白僵菌孢子粉的培养
参照CN101724571A号发明专利公开的白僵菌培养方法，具体方法如下：
所用菌种为球孢白僵菌BACC1632，即CGMCC NO：3.18095；将斜面上的孢子与摇瓶中进行培养42h，温度25℃，转速180rpm，然后将种子液接到固体培养基上发酵7d，发酵条件：温度25℃，湿度95％；固态发酵培养基为：麸皮872.5g、稻壳40g、蔗糖34.7g、硝酸钠52.8g、硼酸79.6μg、水1000ml。培养得到孢子粉。
分别取上述人工培养得到的白僵菌孢子粉、白僵菌BACC1632接种家蚕得到的白僵蚕以及市售白僵蚕，粉碎至100目，用水提取后，测定酪氨酸酶抑制活性，实验方法同实施例1，结果见表4。
表4 三种不同样品对酪氨酸酶抑制效果
Figure BDA0001127675660000051
结果表明，本发明白僵菌菌种孢子粉的酪氨酸酶抑制活性显著优于其感染后的白僵蚕，更优于市售白僵蚕。
实施例3 白僵菌孢子粉提取物的制备
取实施例2培养的白僵菌孢子粉7g，加去离子水70ml，用磁性振荡器加热至45℃度2小时，用高压均质机处理三次，4000r/min，每次2-3分钟，过滤、浓缩，即为白僵菌孢子粉提取物。
取上述提取物加水溶解至14ml(即为样品量的2倍)，按实施例1方法测定对酪氨酸酶的抑制率。结果见表5。
表5 白僵菌孢子粉提取物对酪氨酸酶的抑制率
Figure BDA0001127675660000061
结果表明，本发明白僵菌孢子粉提取物，对酪氨酸甲酚酶的抑制率和对酪氨酸二酚酶抑制率分别为53.57％和68.42％，与市售白僵蚕相比，分别提高89.29％和205.04％。

Claims (4)

1.一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)BACC1632，该菌株已作为专利菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号：CGMCC NO：12876。
2.如权利要求1所述球孢白僵菌的提取物，其特征在于，所述提取物按如下方法制备：取白僵菌孢子粉，以水或有机溶剂提取。
3.如权利要求2所述的提取物，其特征在于，所述有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇；所述提取物方法包括浸泡提取、超声提取、回流提取、渗漉提取中的任意一种。
4.如权利要求2所述的提取物，其特征在于，所述提取物按如下方法制备：取白僵菌孢子粉，加8～12倍量水，用磁性震荡器加热至45～50℃，保持1.5～2小时，用高压均质机处理2～3次，4000r/min，每次2～3分钟，过滤，浓缩，即得。
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