CN104087520A - 一种球孢白僵菌的液体固体培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种球孢白僵菌的液体固体培养方法，包括以下步骤：步骤1、液体菌丝阶段：采用液体深层发酵培养；步骤2、固体菌丝培养阶段：步骤1待获得大量菌丝体后，转入固体发酵罐进行培养，固体发酵罐中放有固体培养料；步骤3、开放产孢阶段：待步骤2中固体发酵罐长满菌丝体后，将固体培养料扣出，采用开放式发酵最终得粗粉剂。本发明由于培养白僵菌的固体培养料配方简单，原料主要为农副产品，价廉，成本低，制作简单。同时又促进了农业废弃物得以有效利用。

Description

一种球孢白僵菌的液体固体培养方法

技术领域

本发明涉及生物发酵方法领域，尤其是涉及一种虫生真菌球孢白僵菌Bcauveria Bassiana(以下简称白僵菌)的固体培养方法。

背景技术

白僵菌是一类对农林害虫寄主范围广且致病性强的昆虫病原真菌，在农林害虫生物防治研究与应用中占有非常重要的地位。由于白僵菌具有对环境和脊椎动物无害，易培养、杀虫谱广、致病力强等特点，是目前应用最非常广泛的生物农药，在多种农林害虫的生物防治中都取得了非常明显的成效。

目前，国内外白僵菌生产主要采用液-固双相发酵工艺，即首先经过液体发酵得到白僵菌芽生孢子或菌丝体，再将其接种于固体料上继续培养，以获得分生孢子。目前我国固态发酵阶段大多数生产厂家采用浅盘、纱窗等开放式生产模式，生产过程存在着对温、湿度要求高，发酵过程周期长，易感染染菌，产品质量不稳定等缺点，严重影响了白僵菌生物农药的生产及防治效果。

发明内容

本发明设计了一种球孢白僵菌的液体固体培养方法，其解决的技术问题是现有液-固双相发酵工艺存在着对温度、湿度要求高，发酵过程周期长，易感染染菌，产品质量不稳定等技术缺陷。

为了解决上述存在的技术问题，本发明采用了以下方案：

一种球孢白僵菌的液体固体培养方法，包括以下步骤：步骤1、液体菌丝阶段：采用液体深层发酵培养；步骤2、固体菌丝培养阶段：步骤1待获得大量菌丝体后，转入固体发酵罐进行培养，固体发酵罐中放有固体培养料；步骤3、开放产孢阶段：待步骤2中固体发酵罐长满菌丝体后，将固体培养料扣出，采用开放式发酵最终得粗粉剂。

进一步，所述步骤2固体菌丝培养阶段的培养周期为1-2天，培养温度设定为24±1℃。

进一步，所述步骤3中开放产孢阶段的培养周期为4-5天，培养温度设定为25±2℃。

进一步，所述固体培养料的配方：以重量百分比为单位，其中甘蔗糖液1-5％，稻糠4-8％，豆粕2-4％，麦麸26-30％，余量为水。

进一步，所述固体发酵罐在培养前需进行消毒。

进一步，开放产孢阶段所用的容器为底部是布满20目小孔的不锈钢盘。

该球孢白僵菌的液体固体培养方法与传统的球孢白僵菌的培养方法，具有以下有益效果：

(1)本发明由于培养白僵菌的固体培养料配方简单，原料主要为农副产品，价廉，成本低，制作简单。同时又促进了农业废弃物得以有效利用。

(2)本发明的分阶段固体培养白僵菌的方法，是针对白僵菌生长的特点而设计，在菌丝生长阶段，需要较高湿度，使用密闭的培养容器，可始终保证培养料和培养环境的湿度较高，从而满足菌丝生长需要，这样克服了开放式培养中湿度无法控制的缺点。同时，因白僵菌生产中，杂菌污染多出现在早期菌丝生长的阶段，密闭式培养，可大大降低污染的概率，且即使出现污染的情况，亦不会扩散蔓延。白僵菌产孢阶段，对环境湿度要求没有菌丝生长阶段高，甚至过高的湿度，会使得孢子二次萌发，从而影响产孢的进程。故产孢阶段，采用开放式培养；且因培养料已经布满白僵菌菌丝，不会出现杂菌污染情况。所以，整个固体培养过程无需调控环境湿度。

(3)本发明的白僵菌固体培养方法，工艺简单，发酵周期可缩短到6-8d，极大地提高了生产效率，同时对环境湿度要求不高，显著减少了杂菌污染概率，生产成本低廉，易控制，成功率高，产品质量稳定。可应用于实验室生产及作为众多中小白僵菌生产厂家技术升级的优选方案。具有显著的社会和经济效益。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步说明：

本发明的白僵菌的分阶段培养方法：

1液体菌种的培养，包括如下步骤：

1.1菌种：白僵菌菌种，以斜面低温保存。

1.2斜面菌种：预先将白僵菌菌种用试管斜面在25±1℃条件下传代培养、活化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为微生物培养中所通用的萨氏培养基。

1.3液体培养基：使用培养基。用500ml三角瓶中装入200ml液体萨氏培养基，121℃下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。

1.4接种：在无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培养基中。

1.5摇床培养：25±1℃恒温振荡培养箱中振荡培养72h，待长成白色粘稠菌丝体后即可接入液体液体种子发酵罐培养。

1.6液体种子罐培养进行白僵菌菌丝体培养。待液体种子罐温度达到25～27℃时，即可接种，接种量7％～15％。

2固体培养，包括如下步骤：

2.1固体培养料配方及制备：

白僵菌固体培养料配方：以重量份为单位，其中甘蔗糖液1-5％，稻糠4-8％，豆粕2-4％，麦麸26-30％，余量为水。

制备方法：将麦麸和甘蔗渣(或谷壳)分别称量，配方中甘蔗糖液1-3％，稻糠2-6％，豆粕1-2％，麦麸24-30％，装入固体发酵罐中，搅拌均匀，121℃下蒸汽高温灭菌60min，冷却后备用。

2.2接种：按10-20％的接种量，将液体菌转入已灭菌的装有固体培养料的固体发酵罐中，搅拌均匀，随即转入培养实培养，24±1℃培养2d后，待菌丝长满后白色菌丝即可。

3开放产孢阶段：倒出长满白色菌丝固体培养料，将其反扣于培养室内放有不锈钢盘的培养架上，轻拍使长满白色菌丝的固体培养料落下，铺在培养架上不锈钢盘内，然后保持培养室内温度在25±2℃，继续培养3-4天，待固体料内外长满白色(乳黄色)孢子后，将固体培养物置于阴凉通风处自然晾干即成粗粉剂(或在30-35℃烘干箱中烘36h，含水率≤10％)。

以下为本发明的几个具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。

实施例一：

1液体菌种的培养，包括如下步骤：

1.1菌种：球孢白僵菌Bcauveria Bassiana菌株，为公知菌株。

1.2斜面菌种：预先将白僵菌菌种用试管斜面培养基在25℃条件下传代培养、活化，当斜面表面长满孢子时即可使用。斜面培养基为萨氏培养基。

1.3液体培养基：配制萨氏培养基1L，用250ml三角瓶中装入，每个装100ml培养基，121℃下蒸汽高温灭菌30min，冷却后备用。

1.4接种：于无菌操作台中，从菌种斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液体培养基中。

1.5摇床培养：25±1℃恒温振荡培养箱中振荡培养72h，待长成白色粘稠菌丝体即可接入固体培养料，进行白僵菌固体培养。

2固体培养，包括如下步骤：

2.1固体培养料配方及制备：

白僵菌固体培养料配方：麦麸20kg，甘蔗糖液2kg，稻糠5kg，水15L。

制配方法：将麦麸和甘蔗糖液分别称量，加入水后搅拌均匀，50L固体发酵罐中，121℃下蒸汽高压灭菌60min，冷却后备用。

2.2接种：按15％的液体菌丝接种量，将液体菌种转入固体发酵罐培养料中，搅拌均匀，25±2℃培养2天后待固体培养料长满白色菌丝即可。

2.4产孢阶段：将长满白色菌丝固体培养料培养架上的不锈钢盘上，保持温度在26±2℃，继续培养4天，待固体料内外长满白色(乳黄色)孢子即可，将固体培养物置于阴凉通风处晾干即成粗粉剂(或在32±3℃烘干箱中烘40h，含水率≤10％)

3培养结果：发酵周期为6d，晾干后随机称取粗粉剂5g，用0.3‰吐温-80溶液进行稀释，血球计数板计数，结果培养物含孢量为2.8X1010孢子/克粗粉剂。粗粉剂制作成粉炮用于农林业害虫防治。

实施例二：

11液体菌种的培养，包括如下步骤：

1.1菌种：球孢白僵菌Bcauveria Bassiana菌株，为公知菌株。

1.2斜面菌种：同实施例一。

1.3液体培养基：同实施例一，共配制10L。

1.4接种：同实施例一。

1.5摇床培养：同实施例一。不同的是摇床培养时间为60h。

2固体培养，包括如下步骤：

2.1固体培养料配方及制备：

白僵菌固体培养料配方：麦麸50kg，谷壳105kg，甘蔗糖液5kg，水30L。

制配方法：同实施例一。

2.2接种：同实施例一。不同的是固体发酵罐体积是100L。

2.3菌丝生长阶段：同实施例一。

2.4产孢阶段：同实施例一。

3培养结果：发酵周期为5-7天，晾干后随机称取粗粉剂5g，用0.2‰吐温-80溶液进行稀释，然后用血球计数板计数，结果培养物含孢量为3.5×10¹⁰孢子/克粗粉剂。粗粉剂直接用于防治农林业害虫。

本发明将白僵菌培养分为三个阶段，液体菌丝阶段、固体菌丝培养阶段和开放产孢阶段。即：在菌丝生长阶段，即液体发酵罐培养阶段，这可有效保证在菌丝生长阶段所需求的高湿度，最大程度减少了培养过程中的污染几率；固体培养菌丝阶段，即利用固体发酵罐进行菌丝培养，待物料长满菌丝体后，倒出，后期采用开放式发酵，可显明改善培养料的通气性能，促进分生孢子大量产生。在产孢阶段将固体培养料倒出后，增加通气量，促进白僵菌快速产孢。

本发明发酵工艺简单，发酵周期短，产品质量稳定，适合白僵菌实验室生产、中试生产，同时亦可作为白僵菌生产企业生产工艺改进的优选方案。

本发明同时提供一种白僵菌固体培养料配方，该配方以麦麸、糖液和稻壳)作为主要载体，价廉，降低了生产成本。

上面结合实施例对本发明进行了示例性的描述，显然本发明的实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种球孢白僵菌的液体固体培养方法，包括以下步骤：步骤1、液体菌丝阶段：采用液体深层发酵培养；步骤2、固体菌丝培养阶段：步骤1待获得大量菌丝体后，转入固体发酵罐进行培养，固体发酵罐中放有固体培养料；步骤3、开放产孢阶段：待步骤2中固体发酵罐长满菌丝体后，将固体培养料扣出，采用开放式发酵最终得粗粉剂。

2.根据权利要求1所述球孢白僵菌的液体固体培养方法，其特征在于：所述步骤2固体菌丝培养阶段的培养周期为1-2d，培养温度设定为24±1℃。

3.根据权利要求1所述球孢白僵菌的液体固体培养方法，其特征在于：所述步骤3中开放产孢阶段的培养周期为4-5天，培养温度设定为25±2℃。

4.根据权利要求1所述球孢白僵菌的液体固体培养方法，其特征在于：所述固体培养料的配方：以重量百分比为单位，其中甘蔗糖液1-5％，稻糠4-8％，豆粕2-4％，麦麸26-30％，余量为水。

5.根据权利要求1-4中任何一项所述球孢白僵菌的液体固体培养方法，其特征在于：所述固体发酵罐在培养前需进行消毒。

6.根据权利要求1-5中任何一项所述球孢白僵菌的液体固体培养方法，其特征在于：开放产孢阶段所用的容器为底部是布满20目小孔的不锈钢盘。