CN103609329B - 提高虫草素含量的蛹虫草培养方法 - Google Patents
提高虫草素含量的蛹虫草培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高虫草素含量的蛹虫草培养方法。所述培养方法包括菌丝体培养和子实体培养，所述菌丝体培养包括以下步骤：在固体培养基中进行菌种的活化、在液体培养基中液体菌种的培养、发酵罐培养基中进行发酵罐培养，所述固体培养基、所述液体培养基和所述发酵罐培养基均含有醋酸锌。本发明通过在固体培养基、液体培养基中加入醋酸锌，由于较高浓度的锌离子对于虫草素的产生具有诱导作用和促进作用，提高了蛹虫草中虫草素含量。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种提高虫草素含量的蛹虫草培养方法。
背景技术
蛹虫草，又名北冬虫夏草，属于子囊亚门、核菌纲、球壳菌目、麦角菌科、虫草属，是我国名贵中药材之一。虫草素是一些虫草真菌的特征性成分，也是虫草真菌中最重要的活性成分之一。
虫草素有免疫调节、抗肿瘤、抗疲劳、调节心肺等功能。虫草素作为一种新型的广谱抗菌素，以其特有的抗菌抗病毒活性，它能抑制病毒的RNA合成；对枯草杆菌和鸟结核杆菌均有抑制作用；对HIV-I型病毒也有杀伤作用；尤其对多种实体恶性肿瘤有很强的抑制作用，能增强免疫功能、防治心脑血管疾病等等。虫草素显示极好的药学应用前景，目前虫草素的研究正成为药物化学中的一个极其活跃的领域。
虫草素在冬虫夏草中的含量极微，提高虫草属真菌的虫草素含量的方法有两类，一类是通过菌株的诱变育种等方式，提高原有菌种的虫草素产量水平；另一种方法是通过培养条件优化和培养过程中添加诱导物的方式提高虫草素的含量。
发明内容
为了提高蛹虫草中虫草素的含量，本发明提供一种提高虫草素含量的蛹虫草子实体培养方法。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种提高虫草素含量的蛹虫草培养方法，包括菌丝体培养和子实体培养，所述菌丝体培养包括以下步骤：在固体培养基中进行菌种的活化、在液体培养基中进行液体菌种的培养和在发酵罐培养基中进行发酵罐培养，所述固体培养基含有重量百分比1.54％～7.36％的醋酸锌，所述液体培养基含有重量百分比为0.81％～1.75％的醋酸锌，所述发酵罐培养基含有重量百分比12.5％～76.3％的醋酸锌。
虫草菌丝体对锌离子有极强的富集能力，在锌离子胁迫下，菌丝体内虫草素含量会增加；子实体虫草素含量可达1.5～2.1mg/g，是未加高浓度锌离子胁迫的所获得的子实体的虫草素含量的2～3倍。
此外，本发明采用醋酸锌，醋酸锌水溶液的pH值适于菌种的培养，醋酸根离子生物相容性好，易吸收降解，不会刺激人体肠胃，不会对人体产生副作用。
作为优选，所述固体培养基包括以下重量配比的组分：葡萄糖15～25份、蛋白胨5～10份、琼脂14～19份、磷酸二氢钾0.02～0.04份、硫酸镁0.02～0.03份、醋酸锌4.3～17份、维生素B10.01～0.03份和土豆180～220份。
作为优选，所述液体培养基包括以下重量配比的组分：葡萄糖16～25份、蛋白胨6～10份、磷酸二氢钾0.03～0.05份、硫酸镁0.03～0.04份、醋酸锌8～17份、维生素B10.01～0.03份和水930～950份。
作为优选，所述发酵罐培养基包括以下重量配比的组分：蔗糖8～20份、蛋白胨1.6～4份、酵母提取物1.6～4份和醋酸锌4～36份。
作为优选，所述发酵罐培养基包括以下重量配比的组分：玉米浆8～20份、蛋白胨1.6～4份、酵母提取物1.6～4份和醋酸锌4～36份。
作为优选，所述发酵罐培养基包括以下重量配比的组分：土豆8～20份、蛋白胨1.6～4份、酵母提取物1.6～4份和醋酸锌4～36份。
作为优选，所述子实体培养包括以下步骤：子实体培养基的制备、子实体培养基灭菌、接种、遮光密闭培养和采收；所述子实体培养基包括富硒大米、稻米谷蛋白的酶水解溶液和醋酸锌。
子实体培养基中含有富硒大米，能够提高培养出的蛹虫草的虫草素含量，而且富硒能力强，硒利用率更高，大幅度提高子实体硒含量，子实体硒含量可达42～57μg/g，是子实体培养基中采用普通大米所获得的子实体中硒含量的10倍左右。蛹虫草子实体产量更高，色泽鲜艳，提高了蛹虫草的营养和药用价值。此外，子实体培养基中还含有醋酸锌，使培养出的子实体达到含锌量达1150～1260mg/g，是子实体培养基中不采用醋酸锌所获得的子实体中锌含量的10000～12000倍，可以起到补锌的作用。
作为优选，所述子实体培养基灭菌是指子实体培养基在高压蒸汽中控温120～125℃处理1小时，停止加热后保温1小时。
本发明通过在固体培养基、液体培养基和发酵罐培养基加入醋酸锌，在高浓度锌离子胁迫下，提高虫草素含量，既满足了工业生产的要求，也符合现代消费者对食品营养和保健的要求。生产工序简单，见效快，生产成本低；制备的虫草营养价值高。
具体实施方式
实施例一：
一种提高虫草素含量的蛹虫草培养方法，包括菌丝体培养和子实体培养，所述菌丝体培养包括以下步骤：
(1)在固体培养基中进行菌种的活化：
所述固体培养基包括葡萄糖18g、蛋白胨8g、琼脂15g、磷酸二氢钾0.03g、硫酸镁0.03g、维生素B10.03g、土豆200g和醋酸锌5g。
将所述固体培养基分装于试管中；将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管斜面，15～30℃遮光密闭培养5～10天。
(2)在液体培养基中液体菌种的培养：
所述液体培养基包括葡萄糖20g、蛋白胨10g、磷酸二氢钾0.04g、硫酸镁0.03g、维生素B10.02g，醋酸锌8g和水950g。
将配置好的液体培养基按每瓶200ML装入罐头瓶内，用聚丙烯薄膜和橡皮筋封口，放入高压锅中灭菌，按照常规的高压灭菌程序，0.12Mpa时，保持50分钟。待培养液温度冷却到23℃以下后，在无菌环境中每瓶接入活化后斜面菌种。将接好菌种的罐头瓶放在培养室进行遮光密闭培养，先避光，静止两至三天。避光，上摇床，防止菌丝结块，顺便检查菌丝生长状况，发现可疑的菌种及时剔除。培养室温度控制在18℃～23℃，五天后即可得到能用于生产的蛹虫草液体菌种。
(3)在发酵罐培养基中培养：
当菌丝体收率0.4～0.8％时，转入发酵罐培养，所述发酵罐培养基包括蔗糖1000g，蛋白胨200g，酵母提取物200g，醋酸锌1000g。发酵罐封盖，装在架子上，进入蒸房，进行高温灭菌，120℃保持一小时，温度至70℃时，打开蒸房门，拿出进行冷却，20℃至23℃接种，臭氧机灭菌。接种在无菌操作台上进行，打开发酵罐封盖后，用接种枪均匀喷洒菌种，每个发酵罐5ML，蒸后封好。在16℃至18℃恒温下进行避光培养，培养至菌丝体收得率1.2-1.8％，放罐收获。
所述子实体培养包括以下步骤：
(1)子实体培养基制备：子实体培养基的配方如下:富硒大米20份，醋酸锌加入稻米谷蛋白的酶水解溶液35份，醋酸锌加入稻米谷蛋白的酶水解溶液形成的溶液，其醋酸锌的浓度是20mg/L，其含谷类蛋白肽10g/L。
(2)灭菌：子实体培养基在高压蒸汽中控温120～125℃灭菌1小时，停止加热后保温1小时。装在架子上，进入蒸房，进行高温灭菌，120℃保持一小时，温度至70℃时，打开蒸房门，拿出进行冷却，20℃至23℃接种，臭氧机灭菌。
(3)接种：
所述子实体培养基冷却后，接入上述发酵罐培养基培养出的液体菌种，液体菌种的重量是子实体培养基内所含富硒大米重量的6％；培养温度控制在15℃～20℃，空气湿度60％～65％。
(4)遮光密闭培养：
完全黑暗条件培养7～8天；
转色期管理：培养温度在18℃～22℃，每天光照11小时以上，光照强度保持在150～160Lx，同时进行连续变温刺激，昼夜温差控制在14～18℃，培养3～4天；
子实体生长阶段管理：料面上出现菌蕾后，温度适当降低。控制在20～22℃，空气湿度83％～87％，光照强度保持在130～170Lx，增加新鲜空气，促进子实体形成，培养30～40天。
(5)采收：当子实体高度达到6～9cm子实体顶端膨大即可采收烘干。
子实体中虫草素含量达到1.8mg/g，硒含量达到35μg/g，锌含量达到1260mg/g。
实施例二：
一种提高虫草素含量的蛹虫草培养方法，包括菌丝体培养和子实体培养，所述菌丝体培养包括以下步骤：
(1)在固体培养基中进行菌种的活化：
所述固体培养基包括葡萄糖25g、蛋白胨10g、琼脂19g、磷酸二氢钾0.04g、硫酸镁0.03g、维生素B10.01～0.03g、土豆180～220g和醋酸锌4.3～17g。分装于试管中；将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管斜面，15～30℃遮光密闭培养5～10天。
(2)在液体培养基中液体菌种的培养：
所述液体培养基包括葡萄糖25g、蛋白胨10g、磷酸二氢钾0.04g、硫酸镁0.03g、维生素B10.03g、醋酸锌17g和水950g。将配置好的培养液按每瓶200ML装入罐头瓶内，用聚丙烯薄膜和橡皮筋封口，放入高压锅中灭菌，按照常规的高压灭菌程序，0.12Mpa时，保持50分钟。待培养液温度冷却到23℃以下后，在无菌环境中每瓶接入活化后斜面菌种。将接好菌种的罐头瓶放在培养室进行遮光密闭培养，先避光，静止两至三天。避光，上摇床，防止菌丝结块，顺便检查菌丝生长状况，发现可疑的菌种及时剔除。培养室温度控制在18℃～23℃，五天后即可得到能用于生产的蛹虫草液体菌种。
(3)在发酵罐培养基中培养：
当菌丝体收率0.4～0.8％时，转入发酵罐培养，所述发酵罐培养包括土豆2000g、蛋白胨400g、酵母提取物400g和醋酸锌3600g。发酵罐封盖，装在架子上，进入蒸房，进行高温灭菌，120℃保持一小时，温度至70℃时，打开蒸房门，拿出进行冷却，20℃至23℃接种，臭氧机灭菌。接种在无菌操作台上进行，打开发酵罐封盖后，用接种枪均匀喷洒菌种，每个发酵罐5ML，蒸后封好。在16℃至18℃恒温下进行避光培养，培养至菌丝体收得率1.2-1.8％，放罐收获。菌丝体中虫草素含量达到2.6mg/g，而未添加醋酸锌的条件下菌丝体中虫草素含量仅有0.62mg/g，添加醋酸锌之后增加1.98mg/g。
所述子实体培养包括以下步骤：
(1)子实体培养基制备：子实体培养基的配方如下:富硒大米20份，醋酸锌加入稻米谷蛋白的酶水解溶液35份，醋酸锌加入稻米谷蛋白的酶水解溶液形成的溶液，其醋酸锌的浓度是20mg/L，其含谷类蛋白肽10g/L。
(2)灭菌：子实体培养基在高压蒸汽中控温120～125℃灭菌1小时，停止加热后保温1小时。装在架子上，进入蒸房，进行高温灭菌，120℃保持一小时，温度至70℃时，打开蒸房门，拿出进行冷却，20℃至23℃接种，臭氧机灭菌。
(3)接种：
所述子实体培养基冷却后，接入上述发酵罐培养基培养出的液体菌种，液体菌种的重量是子实体培养基内所含富硒大米重量的6％；培养温度控制在15℃～20℃，空气湿度60％～65％。
(4)遮光密闭培养：
完全黑暗条件培养7～8天；
转色期管理：培养温度在18℃～22℃，每天光照11小时以上，光照强度保持在150～160Lx，同时进行连续变温刺激，昼夜温差控制在14～18℃，培养3～4天；
子实体生长阶段管理：料面上出现菌蕾后，温度适当降低。控制在20～22℃，空气湿度83％～87％，光照强度保持在130～170Lx，增加新鲜空气，促进子实体形成，培养30～40天。
(5)采收：当子实体高度达到6～9cm子实体顶端膨大即可采收烘干。
子实体中虫草素含量达到2.1mg/g，硒含量达到57μg/g，锌含量达到1150mg/g。
实施例三：
一种提高虫草素含量的蛹虫草培养方法，包括菌丝体培养和子实体培养，所述菌丝体培养包括以下步骤：
(1)在固体培养基中进行菌种的活化：
所述固体培养基包括葡萄糖25g、蛋白胨10g、琼脂19g、磷酸二氢钾0.04g、硫酸镁0.03g、维生素B10.01～0.03g、土豆180～220g和醋酸锌4.3～17g。分装于试管中；将蛹虫草菌种在无菌条件下接入试管斜面，15～30℃遮光密闭培养5～10天。
(2)在液体培养基中液体菌种的培养：
所述液体培养基包括葡萄糖25g、蛋白胨10g、磷酸二氢钾0.04g、硫酸镁0.03g、维生素B10.03g、醋酸锌17g和水950g。将配置好的培养液按每瓶200ML装入罐头瓶内，用聚丙烯薄膜和橡皮筋封口，放入高压锅中灭菌，按照常规的高压灭菌程序，0.12Mpa时，保持50分钟。待培养液温度冷却到23℃以下后，在无菌环境中每瓶接入活化后斜面菌种。将接好菌种的罐头瓶放在培养室进行遮光密闭培养，先避光，静止两至三天。避光，上摇床，防止菌丝结块，顺便检查菌丝生长状况，发现可疑的菌种及时剔除。培养室温度控制在18℃～23℃，五天后即可得到能用于生产的蛹虫草液体菌种。
(3)在发酵罐培养基中培养：
当菌丝体收率0.4～0.8％时，转入发酵罐培养，所述发酵罐培养包括玉米浆2000g、蛋白胨400g、酵母提取物400g和醋酸锌3600g。发酵罐封盖，装在架子上，进入蒸房，进行高温灭菌，120℃保持一小时，温度至70℃时，打开蒸房门，拿出进行冷却，20℃至23℃接种，臭氧机灭菌。接种在无菌操作台上进行，打开发酵罐封盖后，用接种枪均匀喷洒菌种，每个发酵罐5ML，蒸后封好。在16℃至18℃恒温下进行避光培养，培养至菌丝体收得率1.2-1.8％，放罐收获。菌丝体中虫草素含量达到3.2mg/g，而未添加醋酸锌的条件下菌丝体中虫草素含量仅有0.52mg/g，添加醋酸锌之后增加2.68mg/g。
所述子实体培养包括以下步骤：
(1)子实体培养基制备：子实体培养基的配方如下:富硒大米20份，醋酸锌加入稻米谷蛋白的酶水解溶液35份，醋酸锌加入稻米谷蛋白的酶水解溶液形成的溶液，其醋酸锌的浓度是20mg/L，其含谷类蛋白肽10g/L。
(2)灭菌：子实体培养基在高压蒸汽中控温120～125℃灭菌1小时，停止加热后保温1小时。装在架子上，进入蒸房，进行高温灭菌，120℃保持一小时，温度至70℃时，打开蒸房门，拿出进行冷却，20℃至23℃接种，臭氧机灭菌。
(3)接种：
所述子实体培养基冷却后，接入上述发酵罐培养基培养出的液体菌种，液体菌种的重量是子实体培养基内所含富硒大米重量的6％；培养温度控制在15℃～20℃，空气湿度60％～65％。
(4)遮光密闭培养：
完全黑暗条件培养7～8天；
转色期管理：培养温度在18℃～22℃，每天光照11小时以上，光照强度保持在150～160Lx，同时进行连续变温刺激，昼夜温差控制在14～18℃，培养3～4天；
子实体生长阶段管理：料面上出现菌蕾后，温度适当降低。控制在20～22℃，空气湿度83％～87％，光照强度保持在130～170Lx，增加新鲜空气，促进子实体形成，培养30～40天。
(5)采收：当子实体高度达到6～9cm子实体顶端膨大即可采收烘干。子实体中虫草素含量达到1.5mg/g，硒含量达到42μg/g，锌含量达到1200mg/g。
对比例：
与实施例1的区别在于，所述固体培养基、液体培养基、发酵罐培养基和子实体培养基中不包括醋酸锌，子实体培养基中的富硒大米为普通大米。
表1：在所述固体培养基、液体培养基、发酵罐培养基和子实体培养基加入醋酸锌，子实体培养基中采用富硒大米对所培养的子实体中虫草素含量、硒含量和锌含量的影响。
| 虫草素含量 | 硒含量 | 锌含量 | |
| 实施例1 | 1.8mg/g | 35μg/g | 1260mg/g |
| 实施例2 | 2.1mg/g | 57μg/g | 1150mg/g |
| 实施例3 | 1.5mg/g | 42μg/g | 1200mg/g |
| 对比例 | 0.7mg/g | 3.9μg/g | 0.08mg/g |
本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包括这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.一种提高虫草素含量的蛹虫草培养方法，包括菌丝体培养和子实体培养，所述菌丝体培养包括以下步骤：在固体培养基中进行菌种的活化、在液体培养基中进行液体菌种的培养和在发酵罐培养基中进行发酵罐培养，其特征在于，所述固体培养基含有重量百分比1.54％～7.36％的醋酸锌，所述液体培养基含有重量百分比为0.81％～1.75％的醋酸锌，所述发酵罐培养基含有重量百分比12.5％～76.3％的醋酸锌。
2.根据权利要求1所述的提高虫草素含量的蛹虫草培养方法，其特征在于，所述固体培养基包括以下重量配比的组分：葡萄糖15～25份、蛋白胨5～10份、琼脂14～19份、磷酸二氢钾0.02～0.04份、硫酸镁0.02～0.03份、醋酸锌4.3～17份、维生素B10.01～0.03份和土豆180～220份。
3.根据权利要求1所述的提高虫草素含量的蛹虫草培养方法，其特征在于，所述液体培养基包括以下重量配比的组分：葡萄糖16～25份、蛋白胨6～10份、磷酸二氢钾0.03～0.05份、硫酸镁0.03～0.04份、醋酸锌8～17份、维生素B10.01～0.03份和水930～950份。
4.根据权利要求1所述的提高虫草素含量的蛹虫草培养方法，其特征在于，所述发酵罐培养基包括以下重量配比的组分：蔗糖8～20份、蛋白胨1.6～4份、酵母提取物1.6～4份和醋酸锌4～36份。
5.根据权利要求1所述的提高虫草素含量的蛹虫草培养方法，其特征在于，所述发酵罐培养基包括以下重量配比的组分：玉米浆8～20份、蛋白胨1.6～4份、酵母提取物1.60～4份和醋酸锌4～36份。
6.根据权利要求1所述的提高虫草素含量的蛹虫草培养方法，其特征在于，所述发酵罐培养基包括以下重量配比的组分：土豆8～20份、蛋白胨1.6～4份、酵母提取物1.6～4份和醋酸锌4～36份。
7.根据权利要求1所述的提高虫草素含量的蛹虫草培养方法，其特征在于，所述子实体培养包括以下步骤：子实体培养基的制备、子实体培养基灭菌、接种、遮光密闭培养和采收；所述子实体培养基包括富硒大米、稻米谷蛋白的酶水解溶液和醋酸锌。
8.根据权利要求7所述的提高虫草素含量的蛹虫草培养方法，其特征在于，所述子实体培养基灭菌是指子实体培养基在高压蒸汽中控温120～125℃处理1小时，停止加热后保温1小时。
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