CN108551973A - 一种蛹虫草培养方法及蛹虫草菌素提取方法 - Google Patents

Abstract

一种蛹虫草培养方法及蛹虫草菌素提取方法，属于菌类培养领域。蛹虫草培养方法包括：将野生型蛹虫草进行第一次子实体培养，以获得具有不同的表型子实体的多个蛹虫草菌株。使多个蛹虫草菌株分别进行第二次子实体培养，以获得不同表型的多个子实体。分别对多个子实体独立地以光照条件、氮源条件以及碳源条件进行培养，并在子实体成熟后检测蛹虫草菌素含量。通过本发明提供的蛹虫草培养方法能够筛选出蛹虫草菌素含量更高的蛹虫草。

Description

一种蛹虫草培养方法及蛹虫草菌素提取方法

技术领域

本发明涉及菌类培养领域，具体而言，涉及一种蛹虫草培养方法 及蛹虫草菌素提取方法。

背景技术

蛹虫草[Cordyceps militaris(L.ex Fr.)Link],又称蛹草、北虫草、 北冬虫夏草，与冬虫夏草同属异种，是属于子囊菌类的麦角菌目，麦 角菌科，虫草属真菌。在世界各地分布广泛，我国的吉林、河北、四 川、湖南、湖北、山西等省均有生长。民间用于肺炎、肾虚、腰痛等 疾病的治疗。蛹虫草对于生长环境的要求较低,液体发酵可形成菌丝 球,人工大规模固体培养可获得子座。

蛹虫草含有磷、钾、镁等多种无机元素和蛋白质、氨基酸、糖类、 脂肪、生物碱挥发油、虫草酸、虫草素、超氧化物歧化酶(SOD)、 核苷酸等有机物。其中，虫草素(3′-脱氧腺嘌呤核苷，cordycepin) 又称虫草菌素、蛹虫草菌素，是其重要的有效成分之一。

目前，使用的较多的蛹虫草为野生蛹虫草，其虫草素含量相对于 人工培育的蛹虫草而言更多。如何提高人工培育蛹虫草中的虫草素含 量是一个难题。

发明内容

基于现有技术的不足，本发明提供了一种蛹虫草培养方法及蛹虫 草菌素提取方法，以部分或全部地改善、甚至解决以上问题。

本发明是这样实现的：

在第一方面，本发明实施例的提供了一种蛹虫草培养方法。

蛹虫草培养方法包括：

将野生型蛹虫草进行第一次子实体培养，以获得具有不同的表型子实 体的多个蛹虫草菌株；

使多个蛹虫草菌株分别进行第二次子实体培养，以获得不同表型的多 个子实体；

分别对多个子实体独立地以光照条件、氮源条件以及碳源条件进行培 养，并在子实体成熟后检测蛹虫草菌素含量，以获得被提高的蛹虫草菌素 含量的培养条件。

在第二方面，本本发明的提供了一种蛹虫草菌素提取方法。

蛹虫草菌素提取方法包括对蛹虫草菌株进行培养直至子实体成 熟，然后获取菌丝体并制作为粉末，在超声波条件下通过提取剂对粉 末进行提取。其中，培养方法是通过上述的蛹虫草培养方法确定的。

有益效果：

本发明实施例提供的蛹虫草培养方法以野生型蛹虫草为源头通 过培养，并对其不同表型的菌株进行二次培养，待其子实体成熟后检 测用虫草菌素含量。进一步地，通过对培养过程中的不同培养条件(如 光照条件、碳源、氮源)的考察，获得更理想的培养条件，从而使得 蛹虫草的蛹虫草菌素产量提高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下 将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示出了本发明实施例1提供的蛹虫草培养方法中所采用的野 生型蛹虫草菌株；

图2示出了由图1中的蛹虫草菌株分离并进行培养后子实体；

图3示出了本发明实施例2提供的蛹虫草培养方法中所采用的野 生型蛹虫草菌株；

图4示出了由图3中的蛹虫草菌株分离并进行培养后子实体；

图5示出了本发明实施例3提供的蛹虫草培养方法中所采用的野 生型蛹虫草菌株；

图6示出了由图5中的蛹虫草菌株分离并进行培养后子实体；

图7示出了本发明实施例4提供的蛹虫草培养方法中所采用的野 生型蛹虫草菌株；

图8示出了由图7中的蛹虫草菌株分离并进行培养后子实体；

图9示出了本发明实施例5提供的蛹虫草培养方法中所采用的野 生型蛹虫草菌株；

图10示出了由图9中的蛹虫草菌株分离并进行培养后子实体；

图11示出了本发明实施例6提供的蛹虫草培养方法中所采用的 野生型蛹虫草菌株；

图12示出了本发明实施例7提供的蛹虫草培养方法中所采用的 野生型蛹虫草菌株；

图13示出了由图12中的蛹虫草菌株分离并进行培养后子实体；

图14示出了本发明实施例8提供的蛹虫草培养方法中所采用的 野生型蛹虫草菌株；

图15示出了由图14中的蛹虫草菌株分离并进行培养后子实体；

图16示出了实施例1-8中的15个蛹虫草菌株的成熟子实体重量 分布。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领 域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限 制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造 商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通 过市售购买获得的常规产品。

以下针对本发明实施例的一种蛹虫草培养方法及蛹虫草菌素提 取方法进行具体说明：

本发明实施例提供的蛹虫草培养方法及蛹虫草菌素提取方法旨 在提供一种获得更高蛹虫草菌素产量的方法。由于蛹虫草的子实体具 有表型多样性的特点，而不同表型的蛹虫草以及在不同的培养条件下 具有不同的蛹虫草菌素含量。发明人出人意料地发现，通过选择光照、 碳源以及氮源可以对蛹虫草中的蛹虫草菌素含量产生较大的影响。

本发明实施例中，采用野生型蛹虫草，对其进行子实体培养，从 而获得其完整的多个具有不同表型的子实体，然后针对这样的一些子 实体进行培养，并且在培养过程中对前述之光照、碳源、氮源进行考 察，从而获得了具有更好蛹虫草菌素含量的具有特定表型的蛹虫草。

蛹虫草培养方法包括：

第一步骤、菌株分离。

将野生型蛹虫草进行第一次子实体培养，以获得具有不同的表型子实 体的多个蛹虫草菌株。

其中，所采用的培养基可以是如下配方：高粱粉24-26份、银杏叶粉 4-6份、蛋白胨0.04-0.06、甘露糖0.04-0.08份、磷酸二氢钾0.02-0.04份、 硫酸镁0.02-0.03份、葡萄糖0.04-0.06份、维生素B1 0.0005-0.001份、水 30-40份。或者是，马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，KH₂PO₄2g， MgSO₄·7H₂O1g，琼脂粉15g，水1000mL。或者，马铃薯汁700-800ml、蔗 糖18-22g，茧蛹汁200-300ml，奶粉90-100g，琼脂15-20g。

第二步骤、使多个蛹虫草菌株分别进行第二次子实体培养，以获得不 同表型的多个子实体；

其中，所采用的培养基可以是：小米10-20g、大麦10-15g、液体菌种 培养基20-30ml，其中，液体菌种培养基为：茧蛹汁50-100ml，红糖20-25g， 蛋白胨15-20g，纯净水200-350ml，腺嘌呤质量浓度0.8-1.0g/L。

第三步骤、分别对多个子实体独立地以光照条件、氮源条件以及碳源 条件进行培养，并在子实体成熟后检测蛹虫草菌素含量。

在本发明实施例中，进行培养时(第一子实体培养和/或第二次子实体 培养)可以采用各种发明人已知或市售的培养基。优选地，培养基为加富 培养基。更好地，加富培养基的碳源为大米、氮源为有机氮、有机氮为赖 氨酸或谷氨酸。

另外，结合培养基，对光照进行筛选可以更好地提升蛹虫菌素产量。 例如，进行第一子实体培养和/或第二次子实体培养所采用的光照条件为白 光和黑暗交替的明暗照射方式，且每天为14～18小时光照，其余时间为黑 暗。较佳地，所述光照条件为18小时光照，6小时黑暗。

发明人在实践中还发现，具有不同表型的蛹虫草具有不同的成熟时间， 在不同的时间对蛹虫草进行虫草菌素提取会影响到期产量的多寡。因此， 获得适当的培养时间以便兼顾生产效率和蛹虫草菌素产量是显著有利的。 例如，在本发明的一些示例中，在进行第一子实体培养和/或第二次子实体 培养时，从接种到子实体成熟的培养时间为30～60天，更好地，培养时间 为50天。

基于以上的蛹虫草培养方法，可以获得对蛹虫草的更好的培养条件， 从而为高产量的蛹虫草菌素提取提供基础。因此，在本发明的实施例中还 提供了一种蛹虫草菌素提取方法。蛹虫草菌素提取方法通过被筛选出来的 有利的培养条件，对蛹虫草进行培养，然后再进行蛹虫草菌素进行提取。

蛹虫草菌素提取方法包括对蛹虫草菌株进行培养直至子实体成熟，然 后获取菌丝体并制作为粉末，在超声波条件下通过提取剂对粉末进行提取。 其中，蛹虫草菌株及其培养方法均是通过前述的蛹虫草培养方法而确定。

其中，经过超声波提取后，离心并过滤收集滤液。滤液中即含有更高 浓度的被提取的蛹虫草菌素。优选地，通过液相色谱柱进行提纯。更优选 地，液相色谱条件如下：色谱条件Spheriorb C18柱，4.6mm×150mm，5 μm；柱温30℃；流动相为甲醇-乙酸铵溶液，乙醇胺的浓度为0.02mol·L^-1， 甲醇和乙醇胺体积比为85:15；流速1.0mL·min^-1；进样量10μL。

以下结合实施例对本发明的蛹虫草培养方法及蛹虫草菌素提取 方法作进一步的详细描述。

实施例1

采集具有第一表型特征的野生型蛹虫草，通过培养从蛹虫草的顶 部和基部分离获得2个菌株(1#菌株和2#菌株)。参阅图1，蛹虫草 的第一表型特征如下：无分枝型子实体，子实体长棒状顶部纺锤型， 颜色柠檬黄，表面附有白色菌丝。针对1#菌株和2#菌株进行子实体 培养，其表型特征参阅图2。其子实体有正常的长棒状的橘黄色子实 体，还产生树状分枝型的子实体；分枝顶部有绒毛状的菌丝包裹，显 得膨大。

实施例2

采集具有第二表型特征的野生型蛹虫草，通过培养从蛹虫草分离 获得1个菌株(4#菌株)。参阅图3，蛹虫草的第二表型特征如下： 子实体块状，下部附有白色菌丝，上部黄色乳突状。针对4#菌株进 行子实体培养，其表型特征参阅图4。子实体大部分为长棒状的橘黄 色子实体，如图4中b1所示。有子实体的顶部发生了比较有特点的 变化，如图4所示。其中，一种呈现出短须根状分枝，如图4中b2 所示；一种是子实体前端刺突状，如图4中b3所示。

实施例3

采集具有第三表型特征的野生型蛹虫草，通过培养从蛹虫草分离 获得1个菌株(5#菌株)。参阅图5，蛹虫草的第三表型特征如下： 子实体扁平无分枝，橘黄色。针对5#菌株进行子实体培养，其表型 特征参阅图6。除有正常的长棒状菌株，还发现有子实体柄部极细， 顶端膨大，茸毛状，整体类似蝌蚪形的子实体，如图6所示。

实施例4

采集具有第四表型特征的野生型蛹虫草，通过培养从蛹虫草的基 部和分枝部分分离获得2个菌株(7#菌株和8#菌株)。参阅图7，蛹 虫草的第四表型特征如下：子实体基部成为一个整体，柠檬黄色，生 长到一定阶段子实体出现多根分枝，长棒状，橘黄色。针对7#菌株 和8#菌株进行子实体培养，其表型特征参阅图8。子实体培养产生了 一些顶部包裹或绒毛状或粉状的白色菌丝。

实施例5

采集具有第五表型特征的野生型蛹虫草，通过培养从蛹虫草的尖 端、中部和基部分离获得3个菌株(9#菌株、10#菌株、11#菌株)。 参阅图9，蛹虫草的第五表型特征如下：子实体在中部分化成两条， 顶端尖头。针对9#菌株、10#菌株、11#菌株进行子实体培养。其中，9#和11#菌株没有产生正常的子实体，其子实体顶部常见有点状突起， 类似原基，或可见顶端有根状分枝，其表型特征参阅图10。10#在产 子实体多为正常的长棒状子实体。

实施例6

采集具有第六表型特征的野生型蛹虫草，通过培养从蛹虫草分离 获得2个菌株(12#菌株、13#菌株)。参阅图11，蛹虫草的第六表型 特征如下：底部子实体紧密结合在一起，上半部分呈短小的分枝，且 每个小枝子实体尖部呈现珊瑚状分叉。针对12#菌株、13#菌株进行 子实体培养。其中，12#和13#菌株子实体表型多为典型长棒状子实 体。

实施例7

采集具有第七表型特征的野生型蛹虫草，通过培养从蛹虫草分离 获得2个菌株(15#菌株、16#菌株)。参阅图12，蛹虫草的第七表型 特征如下：正常长棒状子实体，橘黄色。针对15#菌株、16#菌株进 行子实体培养，参阅图13。其中，除正常长棒状子实体外，可见多种顶端分枝型的子实体，有的分枝短小，有的分枝细长，有的分枝呈 球状并附有大量菌丝。

实施例8

采集具有第八表型特征的野生型蛹虫草，通过培养从蛹虫草分离 获得2个菌株(17#菌株、18#菌株)。参阅图14，蛹虫草的第八表型 特征如下：粗短型棒状子实体，顶端呈圆头，橘黄色。针对17#菌株、 18#菌株进行子实体培养。参阅图15，这两株菌株培养所得子实体发 育不良，长度短，还可见许多子实体粘连在一起的情况。

通过以上对野生型蛹虫草分离菌株及子实体培养可知，其子实体 的表型具有如下多种。

1.正常型，子实体单根无分支，宽5mm左右，长5-7cm，柠檬 黄色。

2.细长型，子实体单根无分支，宽2-3mm，长4cm左右，多橘 黄色。

3.顶端长分枝型，子实体柄部与通常型类似，但是顶部产生 0.5-1cm左右的分支子实体，分支数量从2支到10数支不等。

4.顶端短分支型，子实体柄部与通常型类似，顶部有点状或短棒 形的突起。

5.顶端被菌丝类型，有子实体在生长发育过程中子实体顶部菌丝 化。菌丝也可见不同状态，有绒毛状菌丝，有粉状菌丝，颜色从白色 到橘黄色不一致。有的只包裹单根子实体顶部，有的产生大量菌丝包 裹整根子实体。

6.蝌蚪型，有些子实体的柄部极细，约2mm以下，但是顶部膨 大，椭圆形，整体呈蝌蚪状。

7.短粗棒状型，子实体短棒状，长度3cm以下，粗5mm左右， 颜色从柠檬黄至橙黄色不同，顶部多球状，有的光滑有的被覆菌丝。

以上实施例1-8中所采用的培养基为：马铃薯200g，葡萄糖20g， 蛋白胨3g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O1g，琼脂粉15g，水1000mL。

培养条件为光强50-100lx，温度15-30℃，空间湿度为70％-75％。 子实体形成后，6℃温差刺激，加强通风，每天通风2次-3次，每次 30min。光强为200-500lx，温度16-20℃，空间湿度85％-95％，培 养40d-50d子实体成熟。

实施例9

以上述实施例1-8分离、培养得到的15个菌株为考察对象，本 实施例对进行培养。蛹虫草子实体的生长发育从菌丝生长，到见光转 色，到出现原基，最后直至子实体开始生长，这是一个具有鲜明时间 节点生长发育过程。

本实施例采用的培养基、培养条件与实施例1-8中所采用的培养 基和培养条件相同。

本实施例通过截取子实体生长发育的过程中比较有代表的原基 形成时间、子实体形成时间和子实体成熟时间来比较这15个菌株的 生长发育过程，生长时间阶段见表1。通常从转色的情况就可以初步 预测整个蛹虫草子实体整个发育过程。例如，9#、11#和18#其原基 形成时间明显长于其他菌株，基部菌丝多呈白色，最后所得子实体正 常型较少，多为粗短棒状形或粗短分枝型。

结果表明：半数以上的菌种5天就可见原基产生。其中有4个菌 种第8天就可见1cm以上的子实体产生。其中的2#、5#和12#整个 生长发育过程最短，从接种到子实体成熟只需35天。其次，15#虽子 实体产生时间为11天，但是，其子实体的在35天也完全成熟。

表1.不同编号子实体生长发育过程

上述15个菌株进行子实体培养后的成熟子实体重量分布如图16 所示。结果表明，在子实体干重方面，4#、10#、13#、15#和16#干 重大于1.5g子实体数量较为丰富。9#和10#干重低于0.5g，培养基大 量产生白色菌丝，子实体较少。

15株虫草菌株的虫草菌素含量如表2所示，其中，15#菌株显著 高于其他菌株。

表2.不同菌株子实体虫草菌素含量

实施例10

对实施例9中所述的15#菌株进行子实体培养，通过控制光照条 件、氮源、碳源，考察收获时的虫草菌素含量(每一百克干燥子实体 中虫草菌素重量)。不同光照条件下蛹虫草菌素含量结果如表3所示。 不同氮源下蛹虫草菌素含量结果如表4所示。不同碳源下蛹虫草菌素 含量结果如表5所示。

表3.光照对蛹虫草子实体虫草菌素含量影响

注：24表示每天24h光照；16/8表示每天光照16h，黑暗8h。

表4.不同氮源蛹虫草子实体虫草菌素含量的影响

表5.不同碳源对蛹虫草子实体虫草菌素含量的影响

根据以上表3、表4、表5结果可得以下结论：

白光照射下的蛹虫草子实体虫草菌素含量显著高于(P＜0.05) 蓝光照射。在蓝光照射下培养的蛹虫草子实体虫草菌素含量又极显著 (P＜0.01)高于红光和黄光。黑暗条件下，检测不到。白光18h/6h、 蓝光18h/6h和黄光18h/6h三种交替类型的光照下的子实体虫草菌素 含量显著高于其24h全程光照的子实体。

使用单一赖氨酸或谷氨酸子实体虫草菌素含量极显著高于其他 氨基酸和无机氮源。

大米作为碳源时，蛹虫草子实体虫草菌素含量极显著高于其他碳 源。

实施例11

采用前述的实施例9中所述的15#菌株进行培养，在以赖氨酸为 氮源、大米为碳源，且每天以18小时白光照射、8小时黑暗的光照 条件下培养50天，采收后，测量蛹虫草中的蛹虫草菌素的含量可达 到11-13mg/g，相比于现有的培养蛹虫草方法中所获得1.02mg/g的蛹 虫草菌素含量具有显著的提升。

培养基为：大米100克，马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g， KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O1g，赖氨酸溶液0.5～0.6g/L，琼脂粉15g， 水1000mL。

培养条件为光强80-95lx，温度15-2℃，空间湿度为50％-63％。 子实体形成后，10℃温差刺激，加强通风，每天通风2次-3次，每次 30min。光强为200-300lx，温度16-20℃，空间湿度80％-90％。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在 不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修 改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有 这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种蛹虫草培养方法，其特征在于，包括：

将野生型蛹虫草进行第一次子实体培养，以获得具有不同的表型子实体的多个蛹虫草菌株；

使所述多个蛹虫草菌株分别进行第二次子实体培养，以获得不同表型的多个子实体；

分别对所述多个子实体独立地以光照条件、氮源条件以及碳源条件进行培养，并在子实体成熟后检测蛹虫草菌素含量，以获得被提高的蛹虫草菌素含量的培养条件。

2.根据权利要求1所述的蛹虫草培养方法，其特征在于，进行第一子实体培养和/或第二次子实体培养所采用的培养基为加富培养基。

3.根据权利要求2所述的蛹虫草培养方法，其特征在于，所述加富培养基的碳源为大米。

4.根据权利要求2所述的蛹虫草培养方法，其特征在于，所述加富培养基的氮源为有机氮。

5.根据权利要求4所述的蛹虫草培养方法，其特征在于，所述有机氮为赖氨酸或谷氨酸。

6.根据权利要求1所述的蛹虫草培养方法，其特征在于，进行第一子实体培养和/或第二次子实体培养所采用的光照条件为白光和黑暗交替的明暗照射方式，且每天为14～18小时光照，其余时间为黑暗。

7.根据权利要求6所述的蛹虫草培养方法，其特征在于，所述光照条件为18小时光照，6小时黑暗。

8.根据权利要求1所述的蛹虫草培养方法，其特征在于，在进行第一子实体培养和/或第二次子实体培养时，从接种到子实体成熟的培养时间为30～60天。

9.一种蛹虫草菌素提取方法，其特征在于，包括对蛹虫草菌株进行培养直至子实体成熟，然后获取菌丝体并制作为粉末，在超声波条件下通过提取剂对所述粉末进行提取，其中，培养条件采用如权利要求1～8中任意一项所述的蛹虫草培养方法确定。

10.根据权利要求9所述的蛹虫草菌素提取方法，其特征在于，经过超声波提取后，离心并过滤收集滤液，优选地，通过液相色谱柱提纯，更优选地，液相色谱条件如下：

色谱条件Spheriorb C18柱，4.6mm×150mm，5μm；柱温30℃；流动相为甲醇-乙酸铵溶液，乙醇胺的浓度为0.02mol·L^-1，甲醇和乙醇胺体积比为85:15；流速1.0mL·min^-1；进样量10μL。