CN101250492A - 一株农杆菌及其用于制备左旋内酯化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株专一性水解右旋内酯的农杆菌(Agrobacterium radiobacter)及其在制备D－(－)－泛解酸内酯等左旋内酯化合物中的应用。所说的酶产生菌为农杆菌(Agrobacterium radiobacter)，保藏编号为CGMCC 2371。以该细菌的菌体或其固定化衍生物为生物催化剂，直接将泛解酸内酯外消旋混合物中不需要的右旋体水解成(－)－羟基酸，而保留有用的左旋D－(－)－泛解酸内酯，后者被广泛用于生产饲料及日化工业上非常有用的D－泛酸钙和D－泛醇。

Description

一株农杆菌及其用于制备左旋内酯化合物的方法

技术领域

本发明涉及一株高选择性右旋内酯水解酶产生菌、培养发法以及利用该菌株制备左旋内酯化合物或相应手性羟基酸的应用。

技术背景

羟基酸是与氨基酸类似的天然产物，在生物体的生理活动中扮演着非常重要的作用。羟基酸及其衍生物也是许多药物合成的中间体。羟基酸通过简单的酸化处理就可以形成内酯，目前有关商业用途的光学纯的羟基酸或内酯的制备方法有许多报道，前人利用化学拆分的手段分离得到(R)-α-羟基-β，β-二甲基-γ-丁内酯，即D-(-)-泛解酸内酯。D-泛解酸内酯，是制备D-泛酸钙和D-泛醇的重要合成中间体。D-泛酸钙(又称维生素B5)是重要的维生素之一，广泛用于医药、饲料和食品行业中。最近生物催化制备手性内酯或羟基酸的方法已经有不少报道，许多生物酶已被作为有潜力的催化剂应用于手性内酯合成或降解反应。合成或降解这些化合物的酶可能与这些内酯系列化合物的天然构型有着相互的关系。

Glnzer等(Enzyme Microb Technol，1988，10：689～690)使用脂肪酶对O-乙酰泛解酸内酯进行拆分，Adam等(Synthesis，1988，5：373～375)则使用腈水解酶制备了(-)-泛解酸内酯，也有报道(Appl.Microbiol，1974，27(1)：130～134；Enzyme Microb Technol，1987，9(7)：411～416；Agric Biol Chem，1987，51：289～290；Agric Biol Chem，1987，51：3011～3016；Tetrahedron：Asymmetry，1994，5(8)：1419～1423)尝试利用氧化还原酶通过不对称氧化还原反应制备(-)-泛解酸内酯；1994年日本京都大学Shimizu等(Appl.Microbiol.Biotechnol，1995，44：333～338)使用Fusarium oxysporum AKU3702催化拆分消旋泛解酸内酯；2002年我国江南大学孙志浩等人(Process Biochem，2002，38：545～549)使用Fusarium moniliforme SW-902酶法拆分泛解酸内酯，均得到光学纯度较高的D-(-)-泛解酸内酯。

一般来说，产内酯酶的微生物菌株分布比较广泛，有报道(J.Biotechnol，2001，92：187～194)称产D(-)-泛解酸内酯酶的微生物一般存在于丝状真菌中，而细菌则倾向于优先催化水解L(+)-泛解酸内酯。1987年Kamata(JP62294092，JP62294096)分别利用SporidiobolusJohnsonii和Rhodotorula minuta培养后离心收集的细胞泥，在水溶液中水解DL-泛解酸内酯，得到D-泛解酸内酯。1992年，Takero等(JP04234995)用Arthrobacter radiobacter IFO12664，在含有DL-泛解酸内酯的溶液中反应得到D-泛解酸内酯。2002年，Maria Kesseler等(Adv.Synth.Catal，2002，344(10)：1103-1110)从965株细菌和霉菌中筛选出一株新的L-泛解酸内酯水解酶Agrobacterium tumefaciens Lu681。它能专一性水解L(+)-泛解酸内酯为L(-)-泛解酸，所得D(+)-泛解酸内酯的对映体过量值(ee)超过95％。2002年，BASF公司在不同国家申请了相关的专利(CN1384880A，DE10029194，DE19952501，PL355487)，内容涉及具有L-泛解酸内酯水解活性的蛋白，以及编码这些蛋白的核酸、核酸构建体、载体、遗传改造的微生物，使得通过基因改造后的L-泛解酸内酯水解酶在pH 4～10范围内活力稳定，最佳pH 7.2～7.7，最适温度为70～75℃，EDTA不抑制其活性。然后利用分子改造后的L-泛解酸内酯水解酶催化外消旋的泛解酸内酯转化为L-泛解酸和D-泛解酸内酯的混合物。缺点是底物泛解酸内酯浓度较低，仅为30％(w/v)，到目前为止还未见工业化生产的报道。

现有工业生物催化过程中所采用的D-内酯酶不对称水解DL-泛解酸内酯的路线，需要先将未被水解的L-泛解酸内酯通过多次溶剂萃取分离除去，然后将剩余水相中的酶促反应产物D-泛解酸盐转化为D-泛解酸内酯，最后再经多次溶剂萃取及结晶才能获得最终的产品。整个过程需耗费大量的酸碱和有机溶剂，因此不符合环保和经济性的要求。如果能使用右旋的内酯水解酶，直接将不需要的对映体L(+)-泛解酸内酯选择性催化水解为L-泛解酸，那么只需经过一轮简单的溶剂萃取即可直接提取得到未被酶水解的左旋体D(-)-泛解酸内酯。与D-内酯酶的工艺路线相比，大大简化了反应后的分离提取步骤，更符合经济和环保的要求。

本发明主要针对现有技术的上述局限，公开了一株新的高活性、高选择性、同时兼具高稳定性的L(+)-内酯水解酶产生菌株-农杆菌(Agrobacterium radiobacter)，以及利用该农杆菌菌体将L(+)-泛解酸内酯专一性水解为L-泛解酸，可直接回收得到未被酶水解的左旋体D(-)-泛解酸内酯。L-泛解酸可以进行消旋化处理，并重新转化为DL-泛解酸内酯后循环使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种右旋内酯酶产生菌-农杆菌(Agrobacterium radiobacter)CGMCC 2371；

本发明的另一目的是提供一种上述右旋内酯酶产生菌-农杆菌CGMCC 2371的应用方法。

本发明的右旋内酯酶产生菌-农杆菌CGMCC 2371是最近从土壤中新分离到的一株专一性L(+)-内酯水解酶产生菌，该菌株已在2008年2月21日保藏在中国普通微生物菌种保藏中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC 2371。

本发明菌株的分离筛选方法简述如下：

采集了不同环境条件下400份土壤样品，分别使用γ-丁内酯，DL-泛解酸内酯，DL-泛解酸钠，或L-泛解酸内酯等为唯一碳源进行富集培养，有水解活性的菌株在加有溴酚蓝指示剂的平板培养基上产生水解圈，菌落周围的培养基由蓝色变为黄色，经进一步分离纯化获得单菌落。将有活性的单菌落培养后，水解底物DL-泛解酸内酯从而筛选L(+)-内酯水解酶产生菌。通过多轮反复筛选，分离得到一株产专一性L(+)-内酯水解酶的农杆菌株(Agrobacterium radiobacter)CGMCC2371。

所述的农杆菌CGMCC 2371是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，具有如下微生物学特征：

呈杆状，大小约为(0.6～1.0)×(1.5～3.0)μm，具有1～6根纤毛，具有运动性，无孢子形成，菌落生长外观呈白色，外形呈凸形状，表面略呈圆凸状，平滑，且无内含色素。

适合生长环境：

嗜温性菌，适合生长温度为25～28℃左右，生长温度范围为20～34℃，pH值范围为6.0～7.1左右。

生化特性：

革兰氏阴性菌，好氧，可利用许多种的碳水化合物，但不能利用纤维素、淀粉或角质素。葡萄糖只在有氧的状况下，才会被分解产生酸；是含碳物质的强发酵菌，且不具有果胶分解的能力。

本发明所公开的农杆菌CGMCC 2371可以用于制备手性内酯或羟基酸，包括如下步骤：

(1)将所说的农杆菌CGMCC 2371在包含碳、氮、磷及其它无机盐的培养基中进行发酵，获得培养物；

所说的培养基的组成和浓度(g/L)如下：

糊精10～30，甘油5～20，蛋白胨1～20，酵母膏1～20，pH 6～9，温度25～37℃，基于发酵培养基体积的接种量为1～10％(v/v)，培养时间12～48h。

(2)将催化剂与需要拆分的手性内酯化合物接触，进行对映选择性催化水解反应，然后从反应产物中收集未被水解的D(-)-内酯和由L(+)-内酯水解生成的L(-)-羟基酸；

内酯底物的浓度为1～40％(w/v)，基于内酯底物重量的催化剂使用量为0.5～10克细胞/克内酯或0.1～75U/克内酯，反应温度为25～40℃，pH 4.0～9.0，反应时间为0.1～24h。

选用泛解酸内酯作为内酯水解酶活力测定的底物，采用如下方法测定内酯水解酶的活力：

在10mL含有2％(w/v)泛解酸内酯的水相反应体系中，加入一定量的生物催化剂，在30℃，磁力搅拌条件下滴加0.1M的NaOH，维持反应液pH为7.0，测定消耗100μl NaOH溶液所需的时间。酶活单位(U)的定义为：在上述条件下，每分钟催化1μmol泛解酸内酯水解为对应羟基酸所需的催化剂(酶)量。

所说的生物催化剂是下列形式中的任意一种：

(1)将农杆菌CGMCC 2371进行液体或固体培养后通过离心收集到的菌体；

(2)采用超声破碎/高压匀浆等方法将菌体破碎，再用水或缓冲液抽提所得的无细胞提取液；

(3)用戊二醛交联固定化的细胞或酶。

所说的内酯底物包括但不限于：β-丁内酯，α-羟基-γ-丁内酯，α-羟基-β，β-二甲基-γ-丁内酯(俗称泛解酸内酯)，β-羟基-γ-丁内酯，维生素C等。

优选的内酯底物为DL(±)-泛解酸内酯。

本发明的菌株产酶稳定、立体选择性好，可以直接用发酵获得的菌体作为酶源，水解拆分外消旋内酯得到高光学纯度的手性羟基酸和剩余内酯。

使用本发明公开的酶促拆分工艺，能简单方便地获得各种类型的高光学纯度手性内酯和羟基酸，是一种具有广泛应用前景的生产方法，可以满足迅速发展的医药、食品及饲料工业的需要。以下通过具体实施例对本发明的技术内容作进一步的描述。

附图说明

图1为固定化菌体催化的多批次水解拆分反应的结果。

图2为固定化酶催化的多批次水解拆分反应的结果。

具体实施方式

        实施例1农杆菌CGMCC 2371的筛选

采集了不同环境条件下400份土壤样品，分别使用γ-丁内酯，DL-泛解酸内酯，DL-泛解酸钠，或L-泛解酸内酯等为唯一碳源进行富集培养，筛选L(+)-内酯水解酶产生菌。

(1)将土样置于试管中，加入2mL富集培养基A(g/L)(底物1.0，NaNO₃ 4.0，KH₂PO₄ 4.0，MgSO₄ 0.1，KCl 0.5，ZnSO₄·7H₂O 0.1，CuSO₄·5H₂O 0.05)，在30℃，200r/min富集培养1天，保留有明显微生物生长迹象的试管，每管取0.2mL富集培养液，加入装有1.8mL已灭菌的富集培养基B(g/L)(底物5.0，NaNO₃ 4.0，KH₂PO₄ 4.0，MgSO₄0.1，KCl 0.5，ZnSO₄·7H₂O 0.1，CuSO₄·5H₂O 0.05)，在30℃，200r/min培养1～2天，每管取0.1mL富集培养液涂布于加有溴酚蓝指示剂的平板培养基C(g/L)(底物5.0，甘油10，酵母膏7.5，蛋白胨7.5，琼脂20)上，30℃培养2～3天。有水解活性的菌株在平板培养基C上产生水解圈，菌落周围的培养基由蓝色变为黄色，经进一步分离纯化获得单菌落。

(2)将单菌落接种到100mL丰富培养基D(甘油10，酵母膏7.5，蛋白胨7.5)，30℃，160r/min培养2～3天。经过抽滤或者离心得到湿菌体，加入10mL磷酸钾缓冲液(100mM，pH 7.0)和1％(w/v)的底物DL-泛解酸内酯，在30℃，160r/min反应12h。加入乙酸乙酯萃取未水解的D-泛解酸内酯，将剩余水相中的L-泛解酸内酯化后用乙酸乙酯萃取，分析水解产物羟基酸和剩余底物内酯的光学纯度。

(3)通过多轮反复筛选，分离得到一株产专一性L(+)-内酯水解酶的农杆菌株(Agrobacterium radiobacter)CGMCC 2371。

        实施例2农杆菌CGMCC 2371的发酵培养

斜面及平板培养基(g/L)：甘油30，酵母膏7.5，蛋白胨7.5，琼脂20。在121℃灭菌15分钟，灭菌后冷却、制成平板、接种，30℃培养1天。发酵培养基(g/L)：糊精20；甘油10；蛋白胨10；酵母膏10；pH 7.0。121℃灭菌15分钟，灭菌后冷却、接种，接种量2％，在30℃，转速160r/min的条件下进行发酵，培养36h菌体干重达到5.2g/L，产酶可达366U/L以上，比活为70U/g。

     实施例3农杆菌CGMCC 2371细胞的固定化

1)取农杆菌CGMCC 2371的湿菌体5g，加入戊二醛15mM，在30℃交联3h后离心即得固定化细胞。细胞经固定化之后酶的活力回收率一般在90％以上。

2)以下列表1中的一系列内酯为底物，底物浓度为100mM，反应体积10mL，投入1g固定化细胞，在30℃、磁力搅拌下反应0.1～0.5h后测定催化活力。表2列出了不同内酯水解时，固定化细胞所表现出来的相对活力。以γ-丁内酯的活力为100％，固定化细胞对结构比较复杂的内酯(比如说维生素C)的水解效果不是很明显。当底物为β-丁内酯时，固定化细胞的活力最大，为γ-丁内酯活力的17倍之多。以D(-)-泛解酸内酯和L(+)-泛解酸内酯为例，固定化细胞活力分别为为γ-丁内酯活力的1和8倍。

表1.固定化农杆菌CGMCC 2371对一系列内酯化合物的催化活性

实施例号

底物

结构式

相对活性(％)

实施例12固定化农杆菌CGMCC 2371催化拆分DL-泛解酸内酯

以CGMCC 2371细胞为催化剂，DL(±)-泛解酸内酯为底物，反应体积20mL，底物浓度为20％(W/V)，投入实施例3所述的农杆菌CGMCC 2371的固定化细胞5g，反应温度为30℃，滴加3M氨水维持反应液pH恒定在7.0，反应至转化率为30％时，通过离心分离除去细胞，然后加入乙酸乙酯进行溶剂萃取，收集有机相，如此重复多次。萃取相中含有大量未被水解的D(-)-泛解酸内酯和少量反应残余的L(+)-泛解酸内酯，旋蒸后称重2.7g，加入农杆菌湿菌体(5g)继续反应。最终反应转化率为48％，所得D(-)-泛解酸的光学纯度约为90％ee，而L(+)-泛解酸内酯的光学纯度为95％ee左右，经过重结晶后可达到98％ ee以上。

    实施例13固定化农杆菌菌体催化的多批次拆分反应

在底物(±)-泛解酸内酯浓度为10％w/v的10mL反应体系中，加入戊二醛交联固定化的农杆菌CGMCC 2371的细胞6g，在30℃、120rpm的条件下反应9h，加入氨水调节控制反应的pH在6.5～7.0。重复操作15次，以游离细胞为对照。结果如图1所示，固定化催化剂可反复使用15次以上，而且均达到了令人满意的拆分效果，具有潜在的工业应用价值。

实施例14固定化酶催化拆分高浓度(40％w/v)DL-泛解酸内酯。

1)固定化酶的制备：取2L农杆菌CGMCC 2371发酵液，使用高压匀浆机在压力为800Pa，4℃条件下进行细胞破壁，4℃、12,000rpm离心5min，上清液为细胞抽提液，沉淀为细胞碎片。室温下在200mL农杆菌CGMCC 2371的细胞粗提液中加入20mM戊二醛交联4h，于4℃、14,000rpm离心15min，并以生理盐水洗涤2次。2)在底物DL(±)-泛解酸内酯浓度为3M(40％w/v)的10mL反应体系中，加入戊二醛交联的固定化酶约295U，在30℃、120rpm的条件下反应12～14h，加入氨水调节控制反应的pH在6.5～7.0。重复操作5次，结果如图2所示，固定化酶可反复使用5次以上，所得D(-)-泛解酸内酯的光学纯度约为90～95％ee，经过重结晶后可达到98％ee以上。

Claims (8)

1.一株产右旋内酯水解酶的农杆菌(Agrobacterium radiobacter)，保藏号为CGMCC 2371。

2.一种如权利要求1所述的农杆菌CGMCC 2371在制备手性羟基酸中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征是包括如下步骤：

(1)将所述的农杆菌CGMCC 2371在含有碳、氮、磷及无机盐的培养基中进行发酵，获得培养物；

(2)将细胞培养物直接或经过处理后作为催化剂，对映选择性催化外消旋内酯中右旋体的水解，然后通过常规的有机溶剂萃取等方法分离提取未被水解的左旋内酯以及右旋内酯水解后所生成的左旋羟基酸；

所述的内酯底物是β-丁内酯、α-羟基-γ-丁内酯、α-羟基-β，β-二甲基-γ-丁内酯或β-羟基-γ-丁内酯中的任一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的培养基的组成和浓度(g/L)如下：糊精10～30、甘油5～20、蛋白胨1～20和酵母膏1～20。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，培养条件为：

pH 6～9，温度25～37℃，基于发酵培养基体积的接种量为1～10％(v/v)，培养时间12～48h。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的内酯底物的浓度为1～40％(w/v)，基于内酯底物重量的催化剂使用量为0.5～10克细胞/克内酯或0.1～75U/克内酯，反应温度为25～40℃，pH 4.0～9.0，反应时间为0.1～24h；

所述的内酯酶活力单位(U)是：在10mL含有2％(w/v)泛解酸内酯的水相反应体系中，加入生物催化剂，在30℃，磁力搅拌条件下滴加0.1M的NaOH，维持反应液pH为7.0，测定消耗100μl NaOH溶液所需的时间；在上述条件下，每分钟催化1μmol泛解酸内酯水解为对应羟基酸所需的催化剂(酶)量定义为1个活力单位(U)。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的内酯底物为(±)-泛解酸内酯。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的催化剂为下列形式中的任意一种：

(1)将农杆菌CGMCC 2317进行液体或固体培养后通过离心收集到的菌体；

(2)采用超声破碎/高压匀浆等方法将菌体破碎，再用水或缓冲液抽提所得的无细胞提取液；

(3)固定化的细胞或固定化的酶。

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