CN101701246B - 一种筛选高产d-泛解酸内酯水解酶菌种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选高产D-泛解酸内酯水解酶菌种的方法，包括初筛、复筛以及测定旋光值步骤，本发明所述方法筛选出的菌种产酶量高达0.5-10U/l，所产泛解酸内酯水解酶专一性强，可选择性不对称水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，水解率高达24％-39.1％，水解产物的光学纯度达到85％e.e.以上，具有广泛的工业应用前景。

Description

一种筛选高产D-泛解酸内酯水解酶菌种的方法

技术领域

本发明属生物酶催化领域，具体涉及一种筛选高产D-泛解酸内酯水解酶菌种的方法。

背景技术

D-泛酸属于B族维生素类物质，D-泛酸有100％的生理活性，L-泛酸无活性。由于D-泛酸对热、碱、酸均不稳定，多以DL-泛酸钙形式存在。生产DL-泛酸钙的传统方法是采用Stiller法即异丁醛-甲醛-氢化钠法或者乙醛酸-异丁醛法，先合成泛解酸内酯，再将β-丙氨酸钙与泛解酸内酯直接缩合得到DL-泛酸钙。

生产D-泛酸的关键是拆分DL-泛酸钙。DL-泛酸钙的拆分有化学法、物理法和生物法。

化学法是通过用手性拆分剂如手性胺、奎宁化合物、二甲马钱子碱等拆分由DL-泛酸钙合成的中间体DL-泛解酸内酯，得到D-泛解酸内酯，化学法拆分缺点是拆分剂贵、成本高、分离困难，还带来严重的环境污染问题。

物理法主要通过诱导结晶拆分DL泛酸钙，在DL-泛酸钙的甲醇溶液中加入D-泛酸钙晶种，诱导溶液中的D-泛酸钙结晶。但诱导结晶工艺收率低、光学纯度差、成本高、生产量小，并且该方法只可以生产泛酸钙，无法用于其他泛酸衍生物如泛醇、D-泛硫乙胺等泛酸衍生物的生产。

生物法主要有直接发酵法和微生物酶法。报道较多的是微生物酶法，即将合成的中间体DL-泛解酸内酯或其类似物，用微生物产生的酶进行转化拆分，得到D-泛解酸内酯，再进一步用于合成D-泛酸钙和D-泛醇，具有环境污染和毒性少等突出的优点。已报道酶法拆分有多种技术路线，主要有以下几种：

1、用微生物彻底分解DL-泛解酸内酯中的L-泛解酸内酯，得到未分解的D-构型泛解酸内酯(参见日本专利JPA 47-19745)。此方法的缺点是至少损失一半的DL-泛解酸内酯原料。

2、用微生物氧化DL-泛解酸内酯中的L-构型泛解酸内酯生成酮基泛解酸内酯，再不对称还原转化为D-泛解酸内酯(JPA47-19745、JPA 61-293386、JPB61-14797)，由于基质浓度低、反应速率低，几乎没有实际意义。

3、用微生物选择性不对称水解DL-泛解酸内酯中的L-泛解酸内酯，得到未水解的D-泛解酸内酯(JPA 57-152895)。此法基质浓度、反应速率也较低，并且只有L-构型的内酯水解得非常彻底才能得到高光学纯度的D-泛解酸内酯，反应时间长，产品光学纯度低。

4、微生物选择性不对称水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯得到D-泛解酸，再将D-泛解酸进行内酯化生成D-泛解酸内酯(US Patent 5275949，1994)。本方法虽水解率不高，但未水解L-泛解酸内酯可消旋后再利用。该方法被广泛采用。

在用上述第4种方案拆分DL-泛解酸内酯的过程中发现，不同微生物产D-泛解酸内酯水解酶的效果不同，甚至同一种微生物不同菌株其产酶量、产酶特性也有相当大的差别，因此，筛选出高产D-泛解酸内酯水解酶的菌种，再对其进行培养、繁殖或工业化生产，可以节省大量人力、物力，节约资源，避免浪费。

发明内容

本发明针对不同菌种的产酶效果不同，提供一种筛选方法，目的在于更快速有效从多个菌种中筛选出适合工业生产的高产D-泛解酸内酯水解酶的菌种。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种筛选高产D-泛解酸内酯水解酶的菌种的方法，包含以下步骤：

(1)取待筛选菌种接种于初筛培养基进行培养，筛选透明图的圈径比大于1的菌种备用，所述初筛培养基组成为：葡萄糖5～25g/l、蛋白胨2～8g/L、酵母膏2～8g/l、琼脂1～2g/L，花生油5～20g/L，调PH值为6～8；

(2)取步骤(1)所得菌种接种于复筛培养基进行发酵，将发酵液抽滤后取抽滤清液备用，所述复筛培养基组成为：葡萄糖5～60g/L、尿素0.5～3g/L、磷酸二氢钾0.2～1.5g/l、氯化钙0.02～0.5g/L、蛋白胨3～8g/L、酵母膏3～8g/L，调PH值为7～8；

(3)取步骤(2)所得抽滤清液加入到D-泛解酸内酯的水溶液中，抽滤清液质量以克计与D-泛解酸内酯水溶液的体积以毫升计之比为6∶100，用氨水控制PH值在7.0，1h后测定旋光值，选取旋光值大于0.05的菌种。

所述初筛培养基组分蛋白胨是微生物培养基的主要基础成分，由蛋白质经酶、酸、碱水解而获得的一种眎、胨、肽、氨基酸组成的水溶性混合物，其主要作用提供氮源，还可以提供碳源和生长因子。

所述酵母膏是膏状的酵母抽提物，是以酵母为原料，采用自溶法或加酶水解法工艺，经分离、脱色而制成的，含氨基酸、肽、多肽及酵母细胞水溶性成分的膏状的产品，符合酵母抽提物标准QB 2582-2003。

优选所述菌种来源于链孢霉属Fusarium、柱孢属Cylindrocarpon、赤霉属Gibberella、曲霉属Aspergillus Volutella和粘帚霉属Gliocladium。

优选地，步骤(1)所述培养为25℃-30℃培养5～10天。步骤(2)所述发酵优选为摇床转速150～300r/min、25℃-30℃条件下发酵3～7天。

更优选地，步骤(1)所述初筛培养基组成为葡萄糖29g/l、蛋白胨6g/L、酵母膏6g/l、琼脂2g/L，花生油10g/L，PH值为7.0。

更优选地，步骤(2)所述复筛培养基组成为葡萄糖30g/L、尿素2g/L、磷酸二氢钾1.0g/l、氯化钙0.1g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L，PH值为7.0。

步骤(3)所述D-泛解酸内酯的水溶液优选D-泛解酸内酯的质量体积浓度以g/ml计为10％～40％。

D-泛解酸内酯水解生成D-泛解酸后，其旋光发生了反转，由D-(-)-泛解酸内酯的左旋转变为D-(+)-泛解酸的右旋。酶水解液中剩下未反应的L-(+)-泛解酸内酯也是右旋的，因此酶水解反应液应是富右旋的。酶的水解效果越好，酶水解液旋光值越高。测定酶反应滤清液中的旋光大小，可以表示酶水解反应程度。

与现有技术相比，本发明所述方法具有以下优点：筛选出的菌种产酶量高达0.5-10U/L，所产泛解酸内酯水解酶专一性强，可选择性不对称水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，反应24小时，水解率高达24-39.1％，所制备的D-型泛解酸光学纯度达到85％e.e以上，具有广泛的应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步阐述本发明，但本发明的保护范围并不限于实施例。

实施例1：产D-泛解酸内酯水解酶菌种初筛

从济南植物园内油污土壤、东营市河口区屠宰场下水道口土壤、黄河口国家森林公园内油污土壤、东营基地采油区土壤、东营炼油厂油污土壤、六户镇田庄农田等地方土壤中采样加入无菌水放在摇床上180rpm，28℃震荡30分钟，静置后取上清液稀释并分别编号为XFF-1，XFF-2，XFF-3......XFF-7，并涂布于初筛培养基上，进行产酶菌种的初步筛选。

初筛培养基的配方为：葡萄糖25g/l、蛋白胨8g/L、酵母膏8g/l、PH值为8.0、琼脂2.0g/L，并加入花生油20g/L；在温度30℃下培养10天，挑选透明圈大的菌种。结果列在表1。水解圈直径愈大，表示该菌种产脂肪酶能力愈强，将其中水解圈直径与菌落直径差值大于1的挑选出来备用。

表1初筛培养结果

菌种编号	菌落半径	透明圈半径	圈径比	透明圈亮度	菌体形态描述
						XFF-1	4mm	8mm	2.0	+	表面粗糙，菌落边缘缺刻，乳白色
XFF-2	2mm	2.4mm	1.20	++	边缘整齐、表面光滑、凸起，珍珠色
						XFF-3	10mm	15mm	1.5	+	菌落较疏松，呈绒毛状、
XFF-4	10mm	15mm	1.50	+	菌落较疏松，絮状
						XFF-5	10mm	8mm	0.8	+	菌落较疏松，蜘蛛网状
XFF-6	12mm	24mm	2.0	+	菌落较疏松，絮状
						XFF-7	11mm	22mm	2.0	++	菌落初期为白色，老熟后褐色

实施例2：产D-泛解酸内酯水解酶菌种复筛及旋光度测定

将初筛挑选出来的菌种XFF-1，XFF-2，XFF-3、XFF-4、XFF-6和XFF-7，接种入复筛培养基中。复筛培养基的组成为：葡萄糖60g/L、尿素3g/L、磷酸二氢钾1.5g/l、氯化钙0.5g/L、蛋白胨8g/L、酵母膏8g/L，PH值为8。在25-30℃，摇床转速300r/min条件下，培养7天，将发酵液抽滤后取抽滤清液作为酶源，然后测定旋光度。对于霉菌和放线菌，发酵结束后，取100ml发酵液，倒入放有两层滤纸的布氏漏斗中进行抽滤，所得到的抽滤清液作为酶源即粗酶。对于细菌，发酵结束后，取100ml发酵液，8000rpm离心5分钟。所得到离心上清液作为酶源即粗酶。

取40％泛解酸内酯150mL.加入抽滤清液9克，不断滴加5％的氨水，反应一小时。将反应液抽滤，取清液测定旋光度。具体方法可参见专著《生物催化工艺学》(化工出版社，2004年)。旋光度越大，表明酶活越高，将旋光度大于0.05的菌种挑选出来供进一步实验。结果见表2。对符合条件的编号为XFF-2，XFF-3、XFF-4的菌种进行鉴定，其分别属于柱孢属Cylindrocarpon、赤霉属Gibberella和粘帚霉属Gliocladium。

表2复筛后菌种的旋光度测定

菌种编号	旋光度
		XFF-1	+0.022
XFF-2	+0.130
		XFF-3	+0.069
XFF-4	+0.087
		XFF-6	+0.024
XFF-7	+0.017

实施例3：产D-泛解酸内酯水解酶菌种初筛

称取从济南植物园内油污土壤、东营市河口区屠宰场下水道口土壤、黄河口国家森林公园内油污土壤、东营基地采油区土壤、东营炼油厂油污土壤、六户镇田庄农田等地方土壤中采样的土样各10g放入250ml三角瓶，加入无菌水100ml。放在摇床上180rpm，28℃震荡30分钟。静置后取上清液稀释后分别编号。取稀释液0.2ml涂布于初筛培养基上，其组成为葡萄糖5g/l、蛋白胨2g/L、酵母膏2g/l、PH值6.0、琼脂2.0g/L，并加入花生油5g/L；在温度28℃下培养5天，观察透明圈与菌体直径比(即圈径比)大于1的菌种，根据挑选的顺序依次进行编号为XFF-8，XFF-9，XFF-10...XFF-400，部分结果列在表3。

表3初筛菌种培养结果

菌种编号	菌落半径	透明圈半径	圈径比	透明圈亮度	菌体形态描述
						XFF-8	5mm	12mm	2.40	+	表面粗糙，菌落边缘缺刻，乳白色
XFF-9	1mm	1.4mm	1.40	++	边缘整齐、表面光滑、凸起，珍珠色
						XFF-10	12mm	15mm	1.25	+	菌落较疏松，呈绒毛状、
XFF-11	10mm	15mm	1.50	+	菌落较疏松，蜘蛛网状
						XFF-12	10mm	14mm	1.40	+	菌落较疏松，絮状
XFF-13	14mm	18mm	1.29	++	菌落初期为白色，老熟后褐色

实施例4：产D-泛解酸内酯水解酶菌种复筛及旋光度测定

将初筛挑选出来的部分菌种XFF-8、XFF-31、XFF-42、XFF-66、XFF-91、XFF-93、XFF-95、XFF-120、XFF-153、XFF-210、XFF-211、XFF-370接入复筛培养基中。复筛培养基的组成为：葡萄糖5g/L、尿素0.5g/L、磷酸二氢钾0.2g/l、氯化钙0.02g/L、蛋白胨3g/L、酵母膏3g/L  PH值7的复筛培养基中，在28℃，摇床转速180r/min条件下，培养3天。发酵结束后，取100ml发酵液，倒入放有两层滤纸的布氏漏斗中进行抽滤。所得到的抽滤清液作为酶源即粗酶。取质量体积浓度为10％泛解酸内酯150mL(即含泛解酸内酯15g).加入菌体9克(与溶液的质量体积百分比为6％)，不断滴加5％的氨水，反应一小时。将反应液抽滤，取清液测定旋光度。结果列在表4。选取旋光值大于0.05的菌种即XFF-31、XFF-66、XFF-95、XFF-120、XFF-153、XFF-211、XFF-370备用。

表4复筛后菌种旋光度测定

菌种编号	旋光度	菌种编号	菌种编号	旋光度
					XFF-8	+0.012	13	XFF-95	+0.081
XFF-31	+0.110	14	XFF-120	+0.096
					XFF-42	+0.049	15	XFF-153	+0.130
XFF-66	+0.077	16	XFF-210	+0.030
					XFF-91	+0.014	17	XFF-211	+0.073
XFF-93	+0.007	18	XFF-370	+0.081

实施例5：D-泛解酸内酯水解酶酶活性测定及水解率测定方法

方法：取10％泛解酸内酯150mL.加入实施例2及实施例4制备的抽滤清液9克，不断滴加5％的氨水，反应24小时。抽滤除去菌体，反应液用高压液相色谱分析(HPLC)测定D-泛解酸。

酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟水解1umol/LD-(-)-泛解酸内酯成D-(+)-泛解酸的酶量定义为1个酶活力单位(IU)。

用HPLC分析测定泛解酸的生成量，并计算每升发酵液或每克干细胞的酶活力单位(IU/L或IU/g)。

泛解酸内酯和D-泛解酸的色谱测定条件：固定相：ODS(C18)粒度5u m。柱长：150mm、内径3.9mm不锈钢柱。移动相：磷酸缓冲液(称取3.12g磷酸二氢钠溶于1L去离子水，用氢氧化钠溶液0.1mol/L调节至PH值5.5，通过0.45um滤膜过滤脱气备用)。流速：1.0ml/min；温度：室温。紫外检测波长为215nm。D-泛解酸内酯的光学纯度通过气相色谱进行测定。

酶水解率％＝(底物DL-泛解酸内酯的含量-未水解的泛解酸内酯的含量)/底物DL-泛解酸内酯的含量×100％

以培养后的菌丝体作为酶源，以DL-泛解酸内酯为底物，底物浓度为10％～40％，加酶量为0.1-5U/g底物，酶反应温度为20～40℃，酶解时间为3～30小时。在此条件下所得的DL-泛解酸内酯酶解液进行高压液相色谱分析及比旋光测定已酶解的主要组分是否为D-泛解酸。

实施例6：产D-泛解酸内酯水解酶菌种产酶培养

将实施例4挑选出来的菌种XFF-31、XFF-66、XFF-95、XFF-120、XFF-153、XFF-211、XFF-370接种入产酶培养基在28℃，摇床转速180r/min条件下，发酵3天。产酶培养基的组成为：葡萄糖5g/L、尿素0.5g/L、磷酸二氢钾0.2g/l、氯化钙0.02g/L、蛋白胨3g/L、酵母膏3g/L，PH值7。发酵结束后，取100ml发酵液，倒入放有两层滤纸的布氏漏斗中进行抽滤。所得到的抽滤清液作为酶源即粗酶。参照实施例5所述方法，取10％泛解酸内酯150mL.加入菌体9克，不断滴加5％的氨水，反应24小时，将反应液抽滤，反应液通过高效液相色谱(ODS(C18)粒度5u m。柱长150mm、内径3.9mm不锈钢柱，洗涤液为磷酸缓冲液)来确定酯的分解和酸的形成。高压液相色谱分析及比旋光测定表明，已酶解的主要组分为D-泛解酸。菌种产酶活性、水解率及水解产物的光学纯度结果见表5。

表5、本发明所述方法筛选的菌种产酶结果

菌种编号	酶活(U/l)	水解率(％)	光学纯度(％e.e)
				XFF-31	10	38	98
XFF-66	0.5	26	89
				XFF-95	2.2	26.5	91
XFF-120	2.5	29	93
				XFF-153	9.5	39.1	98
XFF-211	2.0	25	89
				XFF-370	1.8	24	88

从上表看出，利用本发明所述方法筛选的菌种产酶的酶活性高，专一性强，水解率高达24-39.1％，水解产物的光学纯度达到88-99％e.e.。

实施例7：产D-泛解酸内酯水解酶菌种鉴定

将实施例4挑选出来的菌种进行菌种鉴定，XFF-31和XFF-153属于链孢霉属Fusarium，XFF-66属于柱孢属Cylindrocarpon，XFF-95属于赤霉属Gibberella、XFF-211属于粘帚霉属Gliocladium，XFF-120和XFF-370属于曲霉属Aspergillus，详见表6。

表6、本发明所述方法筛选的菌种鉴定

菌种编号	分类
		XFF-31	链孢霉属Fusarium
XFF-66	柱孢属Cylindrocarpon
		XFF-95	赤霉属Gibberella、

XFF-120	曲霉属Aspergillus
		XFF-153	链孢霉属Fusarium
XFF-211	粘帚霉属Gliocladium
		XFF-370	曲霉属Aspergillus

实施例8：特定属菌种的筛选及产酶培养

将来源于中国普通微生物菌种保藏中心的链孢霉属的大刀镰孢Fusariumculmorum 3.4283、球孢镰刀菌Fusarium sphaerosporum 3.4488，柱孢属的Cylindrocarpon sp.3.3591、Cylindrocarpon sp.3.3592，曲霉属的黑曲霉Aspergillus niger3.6477、泡盛曲霉Aspergillus awamori3.6481、黄柄曲霉Aspergillus flavipes 3.6519，粘帚霉属的粉红粘帚霉3.3657、链孢粘帚霉Gliocladium catenulatum3.3655，赤霉属的藤仓赤霉串珠变种Gibberellafujikuroi3.1775、Gibberella baccata3.1787接种入初筛培养基中。初筛培养基的组成为：葡萄糖29g/l、蛋白胨6g/L、酵母膏6g/l、琼脂2.0g/L，花生油10g/L，PH值为7.0。，在28℃，培养8天。将其中水解圈直径与菌落直径差值大于1的挑选出来接种在复筛培养基，在摇床转速200r/min、28℃条件下发酵5天进行复筛。所述复筛培养基组成为葡萄糖30g/L、尿素2g/L、磷酸二氢钾1.0g/l、氯化钙0.1g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L，PH值为7。发酵结束后，取100ml发酵液，倒入放有两层滤纸的布氏漏斗中进行抽滤。所得到抽滤清液作为酶源即粗酶。取抽滤清液加入到D-泛解酸内酯的水溶液中，用氨水控制PH值在7.0，1h后测定旋光值，选取旋光值大于0.05的菌种。参照实施例5所述方法对上述菌种进行酶活性以及产物光学纯度测定，结果如表7所示。

表7、本发明所述方法筛选的菌种产酶效果

菌种编号	种名	旋光度	酶活U/l	光学纯度(％e.e)
					3.4283	Fusarium culmorum	+0.012	0.3	71
3.4488	Fusarium sphaerosporum	+0.110	2.1	95
					3.3591	Cylindrocarpon sp.	+0.079	1.3	93
3.3592	Cylindrocarpon sp.	+0.047	0.4	62
					3.6477	Aspergillus niger	+0.014	0.25	76
3.6481	Aspergillus awamori	+0.053	0.77	89
					3.6519	Aspergillus flavipes	+0.022	0.41	75
3.3657	Gliocladium roseum	+0.140	2.54	88

3.3655	Gliocladium catenulatum	+0.059	0.66	88
					3.1787	Gibberella baccata	+0.067	0.51	86
3.1775	Gibberella fujikuroi	+0.019	0.64	86

以上结果表明，本发明所述方法筛选旋光值大于0.05的菌种酶活性达0.5U/l以上，所述酶的水解产物光学纯度达85％e.e.以上，与旋光值小于0.05的菌种相比具有显著的差异。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种筛选高产D-泛解酸内酯水解酶菌种的方法，包含以下步骤：

(1)取待筛选菌种接种于初筛培养基，在28℃条件下培养8天，所述初筛培养基组成为：葡萄糖29g/L、蛋白胨6g/L、酵母膏6g/L、琼脂2g/L，花生油10g/L，PH值为7.0；所述待筛选菌种为来源于中国普通微生物菌种保藏中心的链孢霉属的大刀镰孢Fusarium culmorum 3.4283、球孢镰刀菌Fusarium sphaerosporum 3.4488，柱孢属的Cylindrocarpon sp.3.3591、Cylindrocarpon sp.3.3592，曲霉属的黑曲霉Aspergillus niger3.6477、泡盛曲霉Aspergillus awamori3.6481、黄柄曲霉Aspergillus flavipes 3.6519，粘帚霉属的粉红粘帚霉3.3657、链孢粘帚霉Gliocladium catenulatum3.3655，赤霉属的藤仓赤霉串珠变种Gibberella fujikuroi3.1775、Gibberella baccata3.1787；

(2)取步骤(1)所得菌种中透明圈的圈径比大于1的挑选出来接种于复筛培养基，在摇床转速200r/min、28℃条件下发酵5天，将发酵液抽滤后取抽滤清液备用，所述复筛培养基组成为：葡萄糖30g/L、尿素2g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、氯化钙0.1g/L、蛋白胨5g/L、酵母膏5g/L，PH值为7；

(3)取步骤(2)所得抽滤清液加入到D-泛解酸内酯的水溶液中，抽滤清液质量以克计与D-泛解酸内酯水溶液的体积以毫升计之比为6∶100，用氨水控制PH值在7.0，1h后测定旋光值，选取旋光值大于0.05的菌种。