CN117568233B - 一种降低丙酮酸含量提高耐盐性能的黄原胶制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种降低丙酮酸含量提高耐盐性能的黄原胶制备方法，属于微生物发酵技术领域，本发明使用保藏编号为GDMCC No：63427的野油菜黄单胞菌，采用发酵的方法制取黄原胶，且在发酵过程中，所用到的发酵培养基包括如下重量百分比的组分：玉米淀粉4.0~8.0%、工业硫酸铵0.5~2.5%、硫酸亚铁0.3~0.7%、磷酸氢二钾0.1~0.2%、磷酸二氢钾0.1~0.2%。本发明解决了现有技术生产的黄原胶存在丙酮酸含量和耐盐性能不理想的问题，改善了黄原胶的产品性能；同时，本发明还有效提高了产胶率，实现了黄原胶的低成本生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种降低丙酮酸含量提高耐盐性能的黄原胶制备方法。
背景技术
黄原胶（Xanthan gum）是一种由野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）以碳水化合物为主要原料经好氧发酵产生的一种水溶性微生物胞外多糖，又称黄胶、汉生胶，是目前世界上生产规模最大的微生物多糖。黄原胶由糖类经黄单胞菌好氧发酵，切断1,6-糖苷键，打开支链后，按1,4-键合成直链组成的一种酸性胞外杂多糖。1963年在美国农业部的北方区域研究中心发现黄原胶是由野油菜黄单胞菌NRRL B-1459合成的多糖B-1459，1964年初开始大批量商业生产。
黄原胶由于其大分子特殊结构和胶体特性，具有优良的理化特性，例如悬浮性、乳化性、增稠性、假塑性、热稳定性等，可作为增稠剂、乳化剂、稳定剂、凝胶剂、浸润剂、膜成型剂等广泛应用于各个领域，是性能最为优越的生物胶之一。黄原胶具有长链高分子的一般性能，但它比一般高分子含有较多的官能团，在特定条件下会显示独特性能。黄原胶的分子侧链末端含有丙酮酸基团的多少，对其性能有很大影响。在工业生产中，利用野油菜黄单胞菌进行有氧发酵，将发酵液进行沉淀、离心、洗涤、分离、干燥、磨粉、分装等工艺最终得到黄原胶产品。菌种在发酵产业中是一个十分重要的问题，目前较为常见的工业生产菌株为黄单胞菌发酵制备黄原胶，通过菌株进行发酵，将产物分泌胞外，对发酵液进行处理提取获得目的产物。
然而，现有的发酵技术生产的黄原胶，其丙酮酸含量和耐盐性能均不够理想（丙酮酸含量较高、耐盐性能较差），而这也是评价黄原胶产品性能的其中两个重要指标。因此，有必要开发一种新的发酵技术来改善黄原胶的产品性能。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降低丙酮酸含量提高耐盐性能的黄原胶制备方法，以解决现有技术生产的黄原胶存在丙酮酸含量和耐盐性能不理想的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种降低丙酮酸含量提高耐盐性能的黄原胶制备方法，使用野油菜黄单胞菌，采用发酵的方法制取黄原胶；所述野油菜黄单胞菌为Xanthomonas campestris F417，分类学名称为Xanthomonas campestris，并于2023年05月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63427，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；并且在发酵过程中，所用到的发酵培养基包括如下重量百分比的组分：玉米淀粉4.0~8.0%、工业硫酸铵0.5~2.5%、硫酸亚铁0.3~0.7%、磷酸氢二钾0.1~0.2%、磷酸二氢钾0.1~0.2%。
进一步地，所述的制备方法包括如下步骤：
（1）菌种活化：将含有保藏编号为GDMCC No：63427的野油菜黄单胞菌的保藏菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至液体种子培养基中，发酵温度30℃，180r/min恒温摇床培养24 h，进行传代2次，使野油菜黄单胞菌恢复原有活性；
（2）液体种子培养：将活化完成的野油菜黄单胞菌按1%接种量接种至液体种子培养基中，发酵温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，完成液体种子培养；
（3）发酵培养：将生长至对数期的液体种子以5~20%的接种量接种至发酵培养基中，发酵温度35~40℃，180 r/min摇床恒温培养96h，其中，发酵培养基的pH值为7.0；
（4）采用乙醇沉淀法提取发酵液中的黄原胶。
更进一步地，步骤（1）和步骤（2）中，所述液体种子培养基中均包括如下重量百分比的组分：葡萄糖2%、工业硫酸铵0.5%、磷酸二氢钾0.3%和氯化钠0.2%，且液体种子培养基的pH值为7.0。
更进一步地，步骤（3）中的接种量为10%。
更进一步地，步骤（3）中的发酵温度为40℃。
更进一步地，所述发酵培养基中玉米淀粉的重量百分比为6%。
更进一步地，所述发酵培养基中工业硫酸铵的重量百分比为1.5%。
更进一步地，所述发酵培养基中硫酸亚铁的重量百分比为0.4%。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明在多次研究和验证中发现利用野油菜黄单胞菌（保藏编号为GDMCC No：63427），结合所设计的发酵培养基，通过发酵的方法制备得到黄原胶，可以使黄原胶具有丙酮酸含量低、耐盐性能好、结构不受影响的优点，不仅改善了黄原胶的产品性能，而且还有效提高了产胶率，实现了黄原胶的低成本生产。
附图说明
图1为保藏编号为GDMCC No：63427的野油菜黄单胞菌的生长曲线图；
图2为乙醇沉淀法提取发酵液中的黄原胶的实物图；
图3为发酵培养阶段的接种量优化结果图；
图4为发酵培养阶段的装液量优化结果图；
图5为发酵培养阶段的发酵温度优化结果图；
图6为发酵培养阶段的pH值优化结果图；
图7为发酵培养阶段的发酵时间优化结果图；
图8为发酵培养阶段的玉米淀粉含量优化结果图；
图9为发酵培养阶段的工业硫酸铵含量优化结果图；
图10为发酵培养阶段的硫酸亚铁含量优化结果图；
图11为最优发酵条件所得黄原胶的SEM分析图。
具体实施方式
下面结合各实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
本实施例利用保藏编号为GDMCC No：63427的野油菜黄单胞菌，按照如下步骤进行黄原胶的生产：
1、生产过程
1.1菌种活化
将含有保藏编号为GDMCC No：63427的野油菜黄单胞菌（以下简称“保藏菌株”）的保藏菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至装有100 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养，进行传代2次，使保藏菌株恢复原有活性。
上述步骤中，所述液体种子培养基中包括如下重量百分比的组分：葡萄糖2%、工业硫酸铵0.5%、磷酸二氢钾0.3%和氯化钠0.2%，且液体种子培养基的pH值为7.0。
1.2液体种子培养
将重复传代2-3次的保藏菌株的菌液按1%接种量接种到100 ml液体种子培养基（同1.1）中，温度30℃，180 r/min摇床恒温培养，测定接种0 h的种子培养基在600 nm波长处的吸光值，后续每隔2h取一次样，测定保藏菌株在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h、30h、36 h、48 h、54 h、60 h和72 h的OD600值，记录数据绘制生长曲线，如图1所示：保藏菌株的发酵周期大致为36-72 h，在36 h之前主要是菌体的生长和富集，在36 h之后进入产胶期，保藏菌株的生长曲线符合“S”型曲线，符合微生物正常生长繁殖的特征。在0-8 h为菌种的生长延迟期，在8-24 h内菌种以指数形式迅速增长，在24 h时OD600达到0.813，此时为菌种的对数生长期，随后持续增长但生长速率降低，至36-48 h之间达到峰值，为菌种的生长稳定期，且在之后的培养中进入衰亡期，其 OD600缓慢减小，菌种衰亡使培养基中分菌体数量减少，可见液体种子培养以24小时为宜。
1.3发酵培养
当液体种子的OD600值为0.8时，将生长至对数期的液体种子接种至装有100 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，温度30℃，180 r/min摇床恒温培养72 h；
发酵培养基包括如下重量百分比的组分：玉米淀粉6%、工业硫酸铵1.5%、硫酸亚铁0.4%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且pH值为7.0。
1.4黄原胶的提取
采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水进行稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000 r/min离心15 min（如图2所示），弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀1-2次，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到发酵产物黄原胶，称重。
1.5计算产胶率
将提取的黄原胶的质量除以发酵液的质量，即为黄原胶的产胶率。
2、优化生产条件
2.1 接种量优化
对保藏菌株进行接种量优化，将培养至对数生长期的液体种子按接种比例为5%、10%、15% 20%和25%分别接种至初始发酵培养基中，培养温度为30℃，摇床转速为180 r/min，发酵培养时间为72 h。发酵结束后，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000 r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀1-2次，在60℃烘箱里烘干，磨碎，称重，计算黄原胶产胶率。每组3个平行实验。
如图3所示，随着接种量的不断提高，保藏菌株的产胶率呈现先上升后降低的趋势。在接种量低于10.0%时，黄原胶产胶率逐渐增加，在10.0%接种量时达到峰值4.892%，当接种量大于10.0%后产胶率呈现降低趋势，发酵过程缓慢，在指定发酵时间内的产胶率较低。过大的接种量可以缩短菌株生长周期，但却会使培养基中的营养物质被提早利用，致使后期菌种合成黄原胶所需要的底物不足，使黄原胶合成减少。因此，选择10.0%的接种量最为合适。
2.2 装液量优化
对保藏菌株进行装液量优化，将培养至对数生长期的种子液按2.1优化后的最适接种量分别接种至装液量为25 mL、50 mL、75 mL、100 mL和125 mL初始发酵培养基的250mL锥形瓶内，培养温度为30℃，摇床转速为180 r/min，发酵培养时间为72 h。发酵结束后，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000 r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀1-2次，在60℃烘箱里烘干，磨碎，称重，计算黄原胶产胶率。每组3个平行实验。
如图4所示，随着装液量的不断提高，保藏菌株的产胶率呈现先上升后降低的趋势。较低的装液量会使菌种能利用的营养物质有所减少，黄原胶产量不高，而较高的装液量会使发酵环境内的溶氧量过低，空气不易流通，不利于菌体的生长，使黄原胶产量降低。在装液量低于75 mL时，黄原胶产胶率逐渐增加，在75 mL装液量时产胶率达到最高值为4.976%，当装液量大于75 mL时，产胶率逐渐呈现降低趋势，因此，最适装液量应为75 mL。
2.3发酵温度优化
对保藏菌株进行发酵温度优化，将培养至对数生长期的种子液按2.1优化后的最适接种量接种至初始发酵培养基中，按发酵温度为25、30、35、40、45和50℃分别进行摇瓶发酵，发酵时间为2.5优化后的最适发酵时间，摇床转速为180 r/min。发酵结束后，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000 r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀1-2次，在60℃烘箱里烘干，磨碎，称重，计算黄原胶产胶率。每组3个平行实验。
对于保藏菌株而言，其最适生长温度和黄原胶最适生物合成温度不同，最适生长温度为30℃，菌体浓度增长迅速，而黄原胶生物合成的最适发酵温度为 35-40℃。由图5可知，随着温度的升高，保藏菌株的产胶率呈现先增加后降低的趋势，在发酵温度为40℃时达到峰值4.862%，待发酵温度持续升高，产胶率逐渐减小，这可能是由于发酵温度过高，培养基内部温度无法传递出来，导致菌种正常的生长代谢过程受到影响，进而使得黄原胶的产量降低。因此确定保藏菌株的最佳发酵温度为40℃。
2.4初始pH值条件优化
对保藏菌株进行初始pH值优化，将发酵培养基的pH值调节6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，将培养至对数生长期的种子液按2.1优化后的最适接种量分别接种至不同pH值的初始发酵培养基中，发酵时间为2.5优化后的最适发酵时间，发酵温度为2.3优化后的最适发酵温度，摇床转速为180 r/min。发酵结束后，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000 r/min离心15min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀1-2次，在60℃烘箱里烘干，磨碎，称重，计算黄原胶产胶率。每组3个平行实验。
如图6所示，培养基初始的pH值对发酵过程影响极大，pH会影响发酵中的代谢途径，也会影响黄原胶的活性。适当的 pH 会促进发酵，因此发酵过程中选择合适的 pH 值极为重要。初始pH值对保藏菌株产胶率的影响如图6所示。由图6可知，发酵培养基的初始pH值在7.0时，保藏菌株的产胶率达到最高，为4.919%，随着pH值逐渐提高，产胶率逐渐降低，因此确定保藏菌株的最佳发酵pH值为7.0。
2.5 发酵时间优化
对保藏菌株进行发酵时间优化，将培养至对数生长期的种子液按2.1优化后的最适接种量接种至初始发酵培养基中，按发酵时间为48 h、72 h、96 h、120 h和144 h分别进行摇瓶发酵，培养温度为30℃，摇床转速为180 r/min。发酵结束后，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀1-2次，在60℃烘箱里烘干，磨碎，称重，计算黄原胶产胶率。每组3个平行实验。
发酵时间的长短对于野油菜黄单胞菌生产黄原胶来说也是较为重要的影响因素之一。保藏菌株在发酵前期主要进行菌体的生长和积累，待菌体的生长曲线达到稳定期之后开始合成分泌胞外多糖黄原胶。发酵时间对保藏菌株产胶率的影响如图7所示。通过图7可以看出，当发酵时间小于96 h时保藏菌株的产胶率随着发酵时间的增加也逐渐增加，在96 h时达到峰值，为 4.938%，当发酵时间大于96 h时产胶率出现下降趋势。在发酵前期野油菜黄单胞菌保藏菌株处于积累合成黄原胶的过程，随着发酵时间的增长产量增加；但当发酵时间过长时，培养基中的碳源被利用完全，保藏菌株为了生存便将黄原胶作为新的碳源加以利用，导致在发酵时间达到 96 h时黄原胶的产胶率呈现下降趋势。因此，选择96 h为发酵产黄原胶的最适发酵时间。
3、发酵培养基成分优化
3.1 玉米淀粉浓度优化
对玉米淀粉添加量进行优化。在初始发酵培养基中分别添加4.0%、5.0%、6.0%、7.0%和8.0%的玉米淀粉，工业硫酸铵添加量为1%，硫酸亚铁添加量为0.5%，其他成分不变，在2确定的最适发酵条件下进行摇瓶发酵。发酵结束后，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000 r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀1-2次，在60℃烘箱里烘干，磨碎，称重，计算黄原胶产胶率。每组3个平行实验。
不同玉米淀粉浓度下保藏菌株的产胶率结果如图8所示。野油菜黄单胞菌生产黄原胶的过程中需要较高的 C/N 比。由图8可知，随着可溶性淀粉含量的增加，保藏菌株的产胶率不断提高，在含量为6.0%时，产胶率达到最高值为5.065%，随后产胶率开始下降，当可溶性淀粉过高时，发酵环境内的溶氧量不足，培养基内部的渗透压过高，保藏菌株则在渗透作用下失水进而发生质壁分离，影响菌种的正常生长进程，导致产胶率降低。发酵过程中，可溶性淀粉含量不足同样会影响保藏菌株的正常生长，从而影响产胶率。因此在实际生产中既要保证产胶率的最大化，又要控制成本，确定可溶性淀粉的最佳浓度为6.0%。
3.2 工业硫酸铵浓度优化
对工业硫酸铵添加量进行优化。在初始发酵培养基中分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的工业硫酸铵，玉米淀粉按照3.1确定的最优浓度进行添加，硫酸亚铁添加量为0.5%，其他成分不变，在2确定的最适发酵条件下进行摇瓶发酵。发酵结束后，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000 r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀1-2次，在60℃烘箱里烘干，磨碎，称重，计算黄原胶产胶率。每组3个平行实验。
不同工业硫酸铵浓度下保藏菌株的产胶率结果如图9所示。氮源是微生物生长过程中必不可少的元素，在培养基内氮元素含量过大时影响发酵过程中的C/N 比，抑制菌种的生长。由图9可知，工业硫酸铵的添加量在0.5-1.5%范围内，保藏菌株的产胶率呈上升趋势，当工业硫酸铵浓度达到1.5%时产胶率达到峰值，为5.172%，随着工业硫酸铵浓度不断增加，产胶率出现下降趋势，可能是由于培养基内的氮含量超过了保藏菌株正常生长所需要的量，C/N 比失衡，渗透压增大，进一步影响保藏菌株的产胶率。因此确定工业硫酸铵的最佳添加量为1.5%。
3.3 硫酸亚铁浓度优化
对硫酸亚铁添加量进行优化。在初始发酵培养基中分别添加0.3%、0.4%、0.5%、0.6%和0.7%的硫酸亚铁，玉米淀粉按照3.1确定的最优浓度进行添加，工业硫酸铵按照3.2确定的最优浓度进行添加，其他成分不变，在2确定的最适发酵条件下进行摇瓶发酵。发酵结束后，向发酵液中加入3倍体积去离子水稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000 r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀1-2次，在60℃烘箱里烘干，磨碎，称重，计算黄原胶产胶率。每组3个平行实验。
不同硫酸亚铁浓度下保藏菌株的产胶率结果如图10所示。无机盐是微生物在发酵过程中必不可少的营养物质，其主要作用有：构成菌体细胞成分，调节培养基的 pH、渗透压，是酶的重要组成部分等。尽管无机盐在培养基中的含量很少，但却在一定程度上影响着发酵菌体的生长和代谢产物的合成。由图10可知，随着硫酸亚铁浓度的不断增加，保藏菌株的产胶率也逐渐增大，在添加量为 0.4%时产胶率达到峰值，为5.227%，随着硫酸亚铁浓度不断增加，产胶率出现下降趋势，可能是由于培养基内渗透压升高，其内部环境不再适宜菌种生长繁殖，从而使得产胶率下降。因此确定硫酸亚铁的最佳添加量应为0.4%。
4、黄原胶丙酮酸含量的探究
按照上述优化的发酵培养基和培养条件，制备得到的黄原胶（产胶率5.227%）为实验组，以相同量的大豆蛋白替换本实施例最优发酵条件中的工业硫酸铵所得的黄原胶为对照组1；并按同样的发酵条件和相同的发酵培养基，发酵野油菜黄单胞菌1（拉丁文名称为Xanthomonas campestris Y-11，分类学名称为Xanthomonas campestris，并于2023年05月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63460，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼）、野油菜黄单胞菌2（拉丁文名称为Xanthomonascampestris F417-6，分类学名称为Xanthomonas campestris，并于2023年05月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63459，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼），所得的黄原胶为作为对照组2和对照组3。
黄原胶丙酮酸含量测定：精确称取丙酮酸钠62.5 mg溶于100 mL的0.1mol/L H2SO4溶液中；称取100 mg 2,4-二硝基苯肼，溶于100 mL 2 mol/L 的盐酸溶液中，称取 50 mg发酵产物黄原胶，加入 25mL的0.1mol/L H2SO4溶液，水解 3 h，使黄原胶侧链基团中的丙酮酸水解释放。取100 μL的水解液，加入900 μL的去离子水，加入1 mL 0.1%的2,4- 二硝基苯肼溶液，摇匀，于室温静置10 min，以去离子水作为空白对照，在520 nm波长处测定吸光值。以吸光度值为纵坐标，丙酮酸溶液作为标准物制定标准曲线。
黄原胶中丙酮酸含量的多少会影响到胶黏度，丙酮酸含量越低，胶黏度值越小，丙酮酸含量提高，有利于在相同浓度下黄原胶黏度值的提高，耐酸性、兼容性的增强，水合速率的增大等。由表1可知，保藏菌株在确定最佳发酵条件后的产胶率为5.227%，发酵所得黄原胶在5.0 g/L质量浓度下的黏度值仅为97.10 mPa·s，丙酮酸含量为1.43%，而野油菜黄单胞菌1、野油菜黄单胞菌2的实验结果相对较差，说明本实施例探究的最优条件仅适用于本实施例提供的保藏菌株；大豆蛋白发酵产生的丙酮酸含量还略高于实验组，产量却低于实验组。
表1 产胶参数
5、黄原胶耐盐性能的探究
按照上述优化的发酵培养基和培养条件，制备得到黄原胶（产胶率5.227%）。
黄原胶耐盐性能测定：向1000 mL质量浓度为5.0 g/L的产物黄原胶溶液分别添加0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 g的NaCl，搅拌至完全溶解，25℃稳定1 h，测定不同氯化钠浓度下溶液的黏度。打开NDJ-5S黏度计，选择1号转子设置转速6 r/min，按OK键开始测定，当转子结束转动时屏幕上出现读数则表示测定结束，每组3个平行实验，记录不同氯化钠浓度下的产品黄原胶溶液的黏度值，单位为mPa·s。
将上述得到的黄原胶（产胶率5.227%）作为实验组，并按同样的发酵培养基和相同的发酵条件，将野油菜黄单胞菌1（保藏编号为GDMCC No：63460）发酵所得的黄原胶为作为对照组。
质量浓度为5.0 g/L的黄原胶水溶液在氯化钠浓度0.1-0.5 g/L下的黏度变化如表2所示。加入氯化钠后实验组黄原胶水溶液浓度的黏度值在97.10 mPa·s到75.15 mPa·s之间，对照组黄原胶水溶液浓度的黏度值在179.54 mPa·s到44.61 mPa·s之间。随着氯化钠浓度不断增加，对照组黄原胶水溶液黏度的下降幅度高于实验组，说明实验组发酵产物黄原胶拥有较好的耐盐性。盐浓度对黄原胶溶液的黏度有一定影响，在浓度较低时，少量氯化钠的加入可使黄原胶黏度略微下降，这主要是由分子间电荷力的降低造成的，氯化钠的加入降低了黄原胶分子间的胶连程度，黄原胶结构骨架被氯化钠攻击、切断后，会丧失其增稠能力，使黄原胶水溶液黏度降低。
表2 耐盐性测定结果
6、黄原胶微观结构分析
按照上述优化的发酵培养基和培养条件，制备得到黄原胶（产胶率5.227%）。
观察微观形貌：将发酵黄原胶研磨成粉末，使用场发射扫描电镜（S-3400N 型，日本HITACHI公司）观察黄原胶样品的表面形貌。取少量发酵所得黄原胶样品于导电胶上，均匀喷金，然后置于仪器上进行扫描。测试电压为20 kV。
黄原胶的二级结构是侧链绕主链骨架反向缠绕，通过氢键维系形成棒状双螺旋结构；黄原胶的三级结构是棒状双螺旋结构间靠微弱的非极性共价键结合形成的螺旋复合体。由图11可知，保藏菌株发酵所得黄原胶均呈褶皱和结节状形态，具有纤维状特征，表明在产生过程中其结构未受到破坏。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种降低丙酮酸含量提高耐盐性能的黄原胶制备方法，其特征在于，使用野油菜黄单胞菌，采用发酵的方法制取黄原胶；所述野油菜黄单胞菌为Xanthomonas campestrisF417，于2023年05月08日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63427，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；并且在发酵过程中，所用到的发酵培养基包括如下重量百分比的组分：玉米淀粉4.0~8.0%、工业硫酸铵0.5~2.5%、硫酸亚铁0.3~0.7%、磷酸氢二钾0.1~0.2%、磷酸二氢钾0.1~0.2%。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌种活化：将含有权利要求1所述的野油菜黄单胞菌的保藏菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至液体种子培养基中，发酵温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代2次，使野油菜黄单胞菌恢复原有活性；
（2）液体种子培养：将活化完成的野油菜黄单胞菌按1%接种量接种至液体种子培养基中，发酵温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，完成液体种子培养；
（3）发酵培养：将生长至对数期的液体种子以5~20%的接种量接种至发酵培养基中，发酵温度35~40℃，180 r/min摇床恒温培养96h，其中，发酵培养基的pH值为7.0；
（4）采用乙醇沉淀法提取发酵液中的黄原胶。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中，所述液体种子培养基中均包括如下重量百分比的组分：葡萄糖2%、工业硫酸铵0.5%、磷酸二氢钾0.3%和氯化钠0.2%，且液体种子培养基的pH值为7.0。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的接种量为10%。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的发酵温度为40℃。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基中玉米淀粉的重量百分比为6%。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基中工业硫酸铵的重量百分比为1.5%。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基中硫酸亚铁的重量百分比为0.4%。
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