CN117568232A - 一株高产耐温速溶型黄原胶的野油菜黄单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株高产耐温速溶型黄原胶的野油菜黄单胞菌及其应用，属于微生物技术领域，该野油菜黄单胞菌为Xanthomonas campestris Y‑11，于2023年05月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63460。本发明提供的野油菜黄单胞菌，黄原胶产胶率相比于原始菌株提升10%~20%，发酵所得黄原胶溶解速度快、不易结团并耐高温等特性，适用于耐温速溶型黄原胶的发酵生产中；同时，对野油菜黄单胞菌进行遗传稳定性分析，进行连续传代培养，每隔2次传代测定黄原胶的产胶率，在连续传代12次后的黄原胶产胶率和胶品质变化幅度不显著，证明其稳定性良好，可以作为工业生产菌株进行耐温速溶型黄原胶的放大化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产耐温速溶型黄原胶的野油菜黄单胞菌及其应用。
背景技术
黄原胶（Xanthan gum）是一种由野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）以碳水化合物为主要原料经好氧发酵产生的一种水溶性微生物胞外多糖，又称黄胶、汉生胶，是目前世界上生产规模最大的微生物多糖。黄原胶由糖类经黄单胞菌好氧发酵，切断1,6-糖苷键，打开支链后，按1,4-键合成直链组成的一种酸性胞外杂多糖。1963年在美国农业部的北方区域研究中心发现黄原胶是由野油菜黄单胞菌NRRL B-1459合成的多糖B-1459，1964年初开始大批量商业生产。黄原胶由于其大分子特殊结构和胶体特性，具有优良的理化特性，例如悬浮性、乳化性、增稠性、假塑性、热稳定性等，可作为增稠剂、乳化剂、稳定剂、凝胶剂、浸润剂、膜成型剂等广泛应用于各个领域，是性能最为优越的生物胶之一。黄原胶具有长链高分子的一般性能，但它比一般高分子含有较多的官能团，在特定条件下会显示独特性能。黄原胶的分子侧链末端含有丙酮酸基团的多少，对其性能有很大影响。在工业生产中，利用野油菜黄单胞菌进行有氧发酵，将发酵液进行沉淀、离心、洗涤、分离、干燥、磨粉、分装等工艺最终得到黄原胶产品。
菌种在发酵产业中是一个十分重要的问题，目前较为常见的工业生产菌株为黄单胞菌发酵制备黄原胶，通过菌株进行发酵，将产物分泌胞外，对发酵液进行处理提取获得目的产物，然而现有的菌株随着菌株传代次数不断增加而导致的菌种退化直接影响了黄原胶的工业化生产，且生产的黄原胶产品性能单一，耐高温性能和溶解性不理想，不满足部分应用场景。因此，寻求好的菌株，对于黄原胶工业进一步提高产胶率和改善发酵所得黄原胶的性能以扩大应用场景是极为重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一株高产耐温速溶型黄原胶的野油菜黄单胞菌及其应用，以解决现有黄原胶工业产胶率较低、生产的黄原胶耐高温性能和溶解性不理想的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一株高产耐温速溶型黄原胶的野油菜黄单胞菌，所述野油菜黄单胞菌为Xanthomonas campestris Y-11，分类学名称为：Xanthomonas campestris，并于2023年05月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63460，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
具体地，其筛选过程如下：
（1）将原始菌株（保藏编号为CICC No：10258）的保藏菌液解冻，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至液体种子培养基中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代2次，使原始菌恢复原有活性；
（2）将活化完成的原始菌株按1%接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，完成液体种子培养；
（3）取生长至对数期的原始菌株的菌液，用涡旋仪混匀成均一的菌悬液；将制备好的菌悬液取1mL在35mm辐照小皿中，用封口膜密封好，利用12C6+离子束进行辐照诱变，该离子束的引出能量为80 MeV/u，LET为35.5 keV /mm；诱变剂量选取0 Gy、20Gy、40 Gy、60Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy、140 Gy、160 Gy、180 Gy、200 Gy共11个剂量进行辐照；
（4）观察不同辐照剂量下菌落的形态和大小，分别挑取较大较光滑透亮的菌落点种到筛选培养基上，并进行编号，37℃恒温培养72 h；待菌落长出后，在筛选培养基上滴加卢戈氏碘液，观测菌落周围透明圈；测量菌落直径C和透明圈直径H，计算H/C值；H/C值较大的菌株接入液体培养基，30℃、180 r/min恒温摇床培养72 h，这些菌种为初筛菌种；
（5）将初筛菌种进行编号，培养至对数期后按10%接种量分别接入75 mL发酵培养基中，37℃、180 r/min恒温摇床培养96 h，发酵结束后，测定其产胶率和发酵产物黄原胶水溶液的透光率；比较初筛菌株的产胶率和水溶液透光率，选择最优菌株，为复筛菌株，并对复筛菌株进行遗传稳定性测试，最终选取产胶率和水溶液透光率以及遗传稳定性测试最好的菌株为目标菌株。
本发明还提供了上述野油菜黄单胞菌在作为发酵菌种发酵制备黄原胶中的应用。
进一步地，上述应用包括以下步骤：
（1）菌种活化：将含有保藏编号为GDMCC No：63460的野油菜黄单胞菌的保藏菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至液体种子培养基中，发酵温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代2次，使GDMCC63460恢复原有活性；
（2）液体种子培养：将活化完成的野油菜黄单胞菌按1%接种量接种至液体种子培养基中，发酵温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，完成液体种子培养；
（3）发酵培养：将生长至对数期的液体种子以5~20%的接种量接种至发酵培养基中，发酵温度30~40℃，180 r/min摇床恒温培养96h；
（4）采用乙醇沉淀法提取发酵液中的黄原胶。
进一步地，步骤（1）中所述平板培养基包括如下重量百分比的组分：可溶性淀粉0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%、琼脂2%，平板培养基的pH为6.5-7.0，灭菌温度为115℃，灭菌时间为30 min，平板培养时间为72 h。
进一步地，步骤（1）和步骤（2）中，所述液体种子培养基中均包括如下重量百分比的组分：可溶性淀粉2.0%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.3%、氯化钠0.2%，液体种子培养基的pH值为7.0。
进一步地，步骤（3）中的接种量为15%。
进一步地，步骤（3）中的发酵温度为40℃。
进一步地，步骤（3）中的发酵培养基包括如下重量百分比的组分：可溶性淀粉4.5%、葡萄糖0.5%、大豆蛋白1.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且发酵培养基的pH值为7.0。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的野油菜黄单胞菌（保藏编号为GDMCC No：63460），黄原胶产胶率相比于原始菌株提升10%~20%，发酵所得黄原胶溶解速度快、不易结团并耐高温等特性，适用于耐温速溶型黄原胶的发酵生产中。
2、本发明对保藏编号为GDMCC No：63460的野油菜黄单胞菌进行遗传稳定性分析，进行连续传代培养，每隔 2 次传代测定黄原胶的产胶率，可以看出，该野油菜黄单胞菌在连续传代12次后的黄原胶产胶率和胶品质变化幅度不显著，证明其稳定性良好，可以作为工业生产菌株进行耐温速溶型黄原胶的放大化生产。
附图说明
图 1为原始菌株（保藏编号为CICC No：10258）的生长曲线图；
图2为原始菌株（保藏编号为CICC No：10258）的致死率与辐照剂量的关系折线图；
图3为原始菌株（保藏编号为CICC No：10258）的正突变率与辐照剂量的关系折线图；
图4为初筛菌株产胶率柱状分析图；
图5为复筛菌株产胶率柱状分析图；
图6为野油菜黄单胞菌（保藏编号为GDMCC No：63460）与原始菌株（保藏编号为CICC No：10258）产胶率遗传稳定性柱状分析图；
图7为野油菜黄单胞菌（保藏编号为GDMCC No：63460）与原始菌株（保藏编号为CICC No：10258）发酵产物黄原胶在1%质量浓度下的完全溶解时间柱状分析图；
图8为野油菜黄单胞菌（保藏编号为GDMCC No：63460）与原始菌株（保藏编号为CICC No：10258）发酵产物黄原胶耐温性测定折线图。
具体实施方式
下面结合各实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
本发明所得野油菜黄单胞菌（保藏编号为GDMCC No：63460）通过重离子束辐照诱变技术，对原始菌株野油菜黄单胞菌（保藏编号为CICC No：10258，以下简称“原始菌株”）进行辐照诱变，再通过筛选选育得到，其诱变技术筛选过程如下：
1、菌种培养
将原始菌株的菌液解冻，用接种环蘸取少量菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，接种至液体种子培养基中，温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，按1%接种量接种至装有100 mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代2次，使其恢复原有活性。
平板培养基为可溶性淀粉0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%、琼脂2%。平板培养基的pH为6.5-7.0，灭菌温度为115℃，灭菌时间为30 min。
2、液体种子培养
将活化完成的原始菌株按1%接种量接种至装有100mL液体种子培养基的250 mL锥形瓶中，30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，完成液体种子培养。
液体种子培养基为可溶性淀粉2.0%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.3%、氯化钠0.2%。液体种子培养基的pH为7.0。装液量为100mL/250mL。
3、生长曲线测定
将重复传代2-3次的原始菌株的菌液按1%接种量接种到100 ml液体种子培养基中，温度30℃，180 r/min摇床恒温培养，测定接种0 h的种子培养基在600 nm波长处的吸光值，后续每隔2 h取一次样，测定原始菌株在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36h、48 h、54 h、60 h和72 h的OD600值，记录数据绘制生长曲线。
野油菜黄单胞菌属于革兰氏阴性病原菌，专性好氧，通常为杆状，带有一根极性鞭毛，适宜生长温度区间在25-30℃，野油菜黄单胞菌分泌的胞外多糖被称为黄原胶，是一种性能优越的生物胶，能够广泛应用于多个行业，市场前景巨大。原始菌株在液体培养基中的生长曲线如图1所示。由图1可知，原始菌株的生长曲线符合“S”型曲线，符合微生物正常生长繁殖的特征。在0-8 h为菌种的生长延迟期，在12-30 h内菌种以指数形式迅速增长，在24h时OD600达到1.175，此时为菌种的对数生长期，这个时段的菌种生长速率最快、代谢最为旺盛。随后持续增长但生长速率降低，至 30-36 h之间达到峰值，为菌种的生长稳定期，且在之后的培养中进入衰亡期，其 OD600缓慢减小，菌种衰亡使培养基中分菌体数量减少。
4、重离子辐照诱变
取生长至对数期的原始菌株的菌液，用涡旋仪混匀成均一的菌悬液。将制备好的菌悬液取1mL在35mm辐照小皿中，用封口膜密封好，利用兰州重离子诱变研究装置（HIRFL）产生的12C6+离子束进行辐照诱变，该离子束的引出能量为80 MeV/u，LET为35.5 keV /mm。诱变剂量选取0 Gy、20Gy、40 Gy、60Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy、140 Gy、160 Gy、180 Gy、200Gy共11个剂量进行辐照。
5、计算致死率
将辐照剂量为0 Gy、20 Gy、40 Gy、60 Gy、80 Gy、100 Gy、120 Gy、140 Gy、160 Gy、180 Gy、200 Gy的菌液进行梯度稀释后取40 μL菌悬液涂布在固体培养基上。
此处需要确定最佳稀释梯度，确定最佳稀释梯度实验是为了观察野油菜黄单胞菌的单菌落，防止细菌生长密度过高，将菌落处于最佳稀释梯度下培养能将细胞分散开，固体平板上菌落个数在50-200之间有利于更好地观察细菌单菌落。由表1可知当稀释梯度为10-5梯度时，平板上菌落个数小于200个，即10-5梯度为最佳稀释梯度。
表1 稀释梯度
| 稀释梯度 | 菌落个数 |
| 10-1 | ∞ |
| 10-2 | ∞ |
| 10-3 | ∞ |
| 10-4 | 500+ |
| 10-5 | ＜200 |
| 10-6 | ＜30 |
温度37℃、180 r/min恒温摇床培养96 h，每组3个平行实验，然后记录不同辐照剂量时平板上的活菌数量，辐照后的菌落数除以空白对照的菌落数，计算得到致死率，以辐照剂量为横坐标，致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。
本试验重离子束流控制在稳定范围内，以相对辐照剂量为横坐标，致死率为纵坐标，计算致死率，制作致死率曲线，不同辐照剂量下原始菌株的致死率如图 2 所示。由图2可以看出在辐照剂量增加的情况下，原始菌株的致死率总体为先升高再降低趋势，为典型的“马鞍形”趋势。160 Gy下菌株的致死率最高，为86.67%。0-60Gy诱变剂量内，细菌的致死率逐渐升高，60-120 Gy诱变剂量内，致死率趋于平稳，120-160 Gy诱变剂量内致死率呈上升趋势，180Gy致死率稍微下降，200 Gy辐照剂量下，细菌致死率又有提升。当细胞受到辐照，细胞结构会被破坏，细菌死亡数量增加，致死率提高，后期，细菌会将一些受到损伤的细胞进行修复，致死率略微升高，所以致死率曲线呈增长又减少又增长的趋势。
6、计算正突变率
将不同辐照剂量下诱变处理的原始菌株的菌悬液进行适当稀释，吸取0.1mL涂布于固体培养基上，37℃培养48 h，观察不同辐照剂量下菌落的形态和大小，分别挑取较大的菌落点种到筛选培养基上，37℃恒温培养72 h。待菌落长出后，在筛选培养基上滴加卢戈氏碘液，观测菌落周围透明圈。测量菌落直径（C）和透明圈直径（H），按照下方的公式计算正突变率。以辐照时间为横坐标，正突变率为纵坐标，绘制正突变率曲线。选取菌落周围透明圈较大的菌株接入液体培养基，37℃、180 r/min恒温摇床培养24 h后进行保存，以备下一步发酵筛选。
根据透明圈直径与菌落直径之比计算原始菌株诱变的正突变率，以相对辐照剂量为横坐标，正突变率为纵坐标，计算正突变率，制作正突变率曲线，不同辐照剂量下野油菜黄单胞菌的正突变率如图 3所示。通过观察图3，在辐照剂量增加的情况下，原始菌株的正突变率呈增高再降低再增高再降低再增高的趋势，可以看出当辐照剂量为80 Gy时，正突变率为44.00%，达到最高，即诱变在辐照剂量为80 Gy的情况下有利于筛选出正向突变的菌株。在高辐照剂量下，细胞内部结构，如DNA和蛋白质等物质的结构被破坏，遗传信息发生变异，细菌越容易发生突变，因此，正突变也极易发生，这有利于在诱变菌株中筛选出更高产的菌株。
7、诱变菌株的初筛
观察不同辐照剂量下菌落的形态和大小，分别挑取较大较光滑透亮的菌落点种到筛选培养基上，并进行编号，37℃恒温培养72 h。待菌落长出后，在筛选培养基上滴加卢戈氏碘液，观测菌落周围透明圈。测量菌落直径（C）和透明圈直径（H），计算H/C值。H/C值较大的菌株接入液体培养基，温度30℃、180 r/min恒温摇床培养72 h，这些菌种为初筛菌种。
在上述步骤种选出H/C值较大的16株菌株进行培养，命名为Y-1、Y-2、Y-3、Y-4、Y-5、Y-6、Y-7、Y-8、Y-9、Y-10、Y-11、Y-12、Y-13、Y-14、Y-15、Y-16。待初筛的16株诱变菌株培养至对数期，接种至发酵培养基中培养，一段时间后提取黄原胶，测出产胶率，筛选出高产菌株。
其中菌株黄原胶的提取、产胶率的计算过程为：
黄原胶的提取：当液体种子的OD600值为0.8时，将生长至对数期的目标菌株种子液以15%的接种量接种至装有100 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，40℃，180 r/min摇床恒温培养96h，采用乙醇沉淀法，向发酵液中加入3倍体积去离子水进行稀释发酵液，再加入3倍体积无水乙醇用于沉淀黄原胶，8000 r/min离心15 min，弃上清，留取沉淀，再用无水乙醇洗涤沉淀2次，在60℃烘箱里烘干，磨碎，即得到发酵产物黄原胶，称重。
发酵培养基为可溶性淀粉4.5%、葡萄糖0.5%、大豆蛋白1.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%；发酵培养基的pH为7.0。装液量为75 mL/250mL。
计算产胶率：将提取的黄原胶的质量除以发酵液的质量，即为黄原胶的产胶率。
由图4可以筛选出Y-1、Y-4、Y-8、Y-9、Y-11、Y-14六株相对高产的诱变菌株，其中产胶率最高的是Y-11，为4.11%。说明利用重离子束对原始菌株进行诱变可以得到产胶率更高的生产黄原胶的菌株，诱变菌株发生正突变。筛选出的这六株高产菌株产黄原胶的能力强，比出发菌株生产效果好，将这六株诱变菌株单菌落进行菌种保藏，以便于下一步的筛选及其他性质的测定。
8、诱变菌株的复筛
将初筛菌种进行编号，培养至对数期后按10%接种量分别接入75 mL发酵培养基中，37℃、180 r/min恒温摇床培养96 h，发酵结束后，测定其产胶率和发酵产物黄原胶水溶液的透光率。比较初筛菌株的产胶率和水溶液透光率，选择最优菌株，为复筛菌株，并对复筛菌株进行遗传稳定性测试。
将上述步骤中初筛出的六株诱变菌株接种至发酵培养基培养，提取黄原胶测其产胶率。由图5看出，六株诱变菌株中Y-11的产胶率明显比其他诱变剂量辐照下的菌株产胶率高，为4.22%。确定Y-11相对于其他诱变菌株而言为最优菌株。
9、遗传稳定性测定
对筛选到的诱变菌株进行遗传性能稳定性测试，在相同的培养条件下连续传代培养12次，观察其传代后的黄原胶产胶率和水溶液透光率，确定其是否具有遗传稳定性。
将高产菌株Y-11和原始菌株在相同条件下连续传代培养12次，每隔两代接种至发酵培养基中，测定其产胶率，结果如图6所示。在标准偏差的分析下，其产胶率的差异不大。说明这株高产菌株Y-11遗传性能稳定，本实验采用重离子诱变的物理诱变手段进行人工育种，可以得到性能稳定、不易发生恢复且高产的Y-11诱变菌株。对诱变菌株Y-11进行保藏，保藏编号为GDMCC No：63460（以下简称“诱变菌株”），分类学名称为：Xanthomonascampestris，于2023年05月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
10、产品溶解性测定
将筛选到的诱变菌株与原始菌株的发酵产物黄原胶配制成1%质量浓度的水溶液，600 r/min搅拌至完全溶解，测定在1%质量浓度下黄原胶完全溶解的时间，每组3个平行实验，记录数据。
由图7可以看出，原始菌株发酵产物黄原胶在1%质量浓度下的完全溶解时间为13.95min，诱变菌株发酵产物黄原胶配制成1%质量浓度的水溶液，600 r/min搅拌至完全溶解，测定在1%质量浓度下黄原胶完全溶解的时间为8.67 min，相比于原始菌株降低了60.90%。说明诱变菌株发酵产物黄原胶以1%的质量浓度加入至去离子水溶液中，在10 min内能够完全溶解。
11、产品耐温性测定
将筛选到的诱变菌株与原始菌株发酵所得黄原胶研磨成粉末，将1000 mL质量浓度为1%的产物黄原胶溶液置于水浴锅中加热，分别设置温度为10、20、30、40、50、60、70和80℃，产物黄原胶水溶液在每种温度下稳定1 h，打开NDJ-5S旋转式黏度计，设定转速为6 r/min，记录不同温度下产品黄原胶溶液的黏度值，每组3个平行实验，单位为mPa·s。
由图8可以看出，诱变菌株发酵所得的黄原胶水溶液在10-80℃温度范围内黏度值呈现先升高后降低的趋势。黄原胶水溶液在20℃下的黏度最高，为180.34 mPa·s，随着温度的逐渐升高，黄原胶水溶液的黏度逐渐降低，在80℃下的黏度为117.06 mPa·s，整个温度区间内的黏度变化不太明显，黏度适中，无结团生成，黄原胶水溶液在10-80℃的温度范围内黏度变化相比于原始菌株发酵产黄原胶的水溶液变化不显著，原始菌株发酵所得的黄原胶水溶液在10-80℃温度范围内黏度值呈现逐渐降低的趋势，在10℃下的黏度151.43mPa·s，升温至80℃时的黄原胶水溶液黏度达到最低值27.66 mPa·s，黏度变化较为明显。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一株高产耐温速溶型黄原胶的野油菜黄单胞菌，其特征在于，所述野油菜黄单胞菌为Xanthomonas campestris Y-11，并于2023年05月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：63460，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
2.如权利要求1所述的野油菜黄单胞菌在作为发酵菌种发酵制备黄原胶中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种活化：将含有权利要求1所述的野油菜黄单胞菌的保藏菌液解冻后，用接种环蘸取保藏菌液在平板培养基上划线，待长出单个菌落后挑取单菌落，按1%接种量接种至液体种子培养基中，发酵温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，进行传代2次，使野油菜黄单胞菌恢复原有活性；
（2）液体种子培养：将活化完成的野油菜黄单胞菌按1%接种量接种至液体种子培养基中，发酵温度30℃，180 r/min恒温摇床培养24 h，完成液体种子培养；
（3）发酵培养：将生长至对数期的液体种子以5~20%的接种量接种至发酵培养基中，发酵温度30~40℃，180 r/min摇床恒温培养96h；
（4）采用乙醇沉淀法提取发酵液中的黄原胶。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中所述平板培养基包括如下重量百分比的组分：可溶性淀粉0.5%、蛋白胨1%、牛肉膏0.3%、氯化钠0.5%、琼脂2%，平板培养基的pH为6.5-7.0，灭菌温度为115℃，灭菌时间为30 min，平板培养时间为72 h。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）中，所述液体种子培养基中均包括如下重量百分比的组分：可溶性淀粉2.0%、蛋白胨0.5%、磷酸二氢钾0.3%、氯化钠0.2%，液体种子培养基的pH值为7.0。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中的接种量为15%。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中的发酵温度为40℃。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中的发酵培养基包括如下重量百分比的组分：可溶性淀粉4.5%、葡萄糖0.5%、大豆蛋白1.0%、七水硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.1%，且发酵培养基的pH值为7.0。
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