CN111909886B - 一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过金藻发酵高效生产水溶性β‑1,3‑葡聚糖的方法，该方法以高含水溶性β‑1,3‑葡聚糖的金藻为发酵培养的微生物，生产水溶性β‑1,3‑葡聚糖的金藻藻种；其包括在发酵基础培养基中接种金藻藻种，发酵培养过程中流加补料培养基；通过调控发酵培养基中氮源种类、发酵培养基中C/N比、发酵培养基中葡萄糖浓度维持在一定范围的方式来调控金藻细胞生长速度和细胞密度，以获得高生物量浓度和高细胞密度的金藻发酵培养液，从而提高金藻细胞水溶性中β‑1,3‑葡聚糖的产量。本发明一方面解决现有β‑1,3‑葡聚糖来源中β‑1,3‑葡聚糖含量低、提取成本高、大多为水不溶性的问题；还解决现有限氮或缺氮方式提高微藻细胞中储存性多糖含量时细胞生长受到抑制的问题。

Description

一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法

技术领域

本发明属于微藻培养领域，涉及一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法。

背景技术

β-1,3-葡聚糖是一类广泛存在于微生物、植物和动物体内的大分子多糖，主链结构由β-1,3-糖苷键连接，通常因来源不同而含有不同比例和大小的β-1,3、β-1,4或β-1,6键连接的支链，主要以细胞结构成分如细胞壁的形式存在。β-1,3-葡聚糖是一种活性强、毒副作用低的高效生物应答物，不仅有免疫促进作用，而且具有抗肿瘤、抗感染等活性。在饲料行业，水溶性酵母β-1,3-葡聚糖可作为饲料添加剂，能起到提高动物非特异性和特异性免疫的作用。目前，β-葡聚糖主要来源是从香菇、酵母、燕麦、青稞中提取获得。一方面，这些原料中β-葡聚糖含量低，使得提取过程复杂、生产成本高；另外β-1,3-葡聚糖产量受这些原料生产规模、生产周期的限制，通过这种方式生产的β-葡聚糖产量和品质难以满足市场需求。此外，目前大多数β-1,3-葡聚糖(包括裸藻副淀粉在内的)具有水不溶性、黏度大的特征，其活性较低。因此，如何能够高效且经济地生产制备水溶性β-1,3-葡聚糖，将能够有效推进β-1,3-葡聚糖在医药、动物饲料等方面的应用。

朱顺妮、王亚杰、黄伟等人文章(ShunniZhu,YajieWang,WeiHuang,JinXu,ZhongmingWang,JingliangXu,ZhenhongYuan.EnhancedaccumulationofcarbohydrateandstarchinChlorellazofingiensisinducedbynitrogenstarvation.AppliedBiochemistryandBiotechnology,2014,174:2435–2445.)采用氮饥饿诱导方式提高小球藻胞内碳水化合物和多糖淀粉的含量，研究结果表明氮饥饿能快速诱导小球藻胞内碳水化合物尤其是淀粉的积累，氮饥饿诱导1天小球藻胞内碳水化合物和淀粉含量分别增加了37％和4倍。氮饥饿诱导条件下胞内最高碳水化合物含量占细胞干重的66.9％，碳水化合物中66.7％为淀粉。但是，缺氮培养下小球藻的细胞比生长速度和生物量浓度明显下降，缺氮诱导下小球藻的比生长速度为0.48d^-1，远低于富氮培养条件下的比生长速度(1.02d^-1)。由此可见氮饥饿诱导虽然可提高小球藻胞内碳水化合物和多糖淀粉的含量，但同时需要以严重牺牲生长速度和生物量为代价。在提高微藻细胞多糖含量方面，现有的限氮或氮饥饿诱导方式提高微藻细胞中储存性多糖(如淀粉)含量下细胞生长受到抑制，多糖产量难以提高，不适宜工业生产。

发明内容

(一)要解决的技术问题

鉴于现有技术的上述缺点、不足，本发明提供一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法，能够经济、高效地生产水溶性β-1,3-葡聚糖。

(二)技术方案

为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：

第一方面，本发明实施例提供一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法，以高含水溶性β-1,3-葡聚糖的金藻为发酵培养的微生物，生产水溶性β-1,3-葡聚糖的金藻藻种；其包括：

在发酵基础培养基中接种金藻藻种，发酵培养过程中流加补料培养基，补料培养基加到发酵体系中构成发酵培养基；通过调控发酵培养基中氮源种类、发酵培养基中C/N比、发酵培养基中葡萄糖浓度维持在一定范围的方式来调控金藻细胞生长速度和细胞密度，以获得高生物量浓度、高细胞密度的金藻发酵培养液，从而提高金藻细胞水溶性中β-1,3-葡聚糖的产量。

根据本发明的较佳实施例，其中，所述发酵基础培养基和补料培养基中均含有碳源和氮源，所述碳源为葡萄糖，所述氮源为有机氮源或采用有机氮源和无机氮源的混合氮源；所述发酵基础培养基中葡萄糖浓度为5-15g/L，所述发酵基础培养基和补料培养基中C/N＝4:1-40:1；

监控发酵体系中发酵培养基的葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度较初始浓度下降0.5-3g/L时，使用速度可调的蠕动泵流加补料培养基进行流加培养，并适时监控测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适时调节补料速度，控制整个流加培养过程中发酵培养基的葡萄糖浓度为1-10g/L；控制发酵过程中发酵培养基C/N＝4:1-40:1；

当连续两次取样样品发酵干重不变或开始下降时，发酵结束。

根据本发明的较佳实施例，其中，所述有机氮源为酵母粉、肝浸粉和蛋白胨中的一种或几种；所述混合氮源为尿素/NH₄Cl，与酵母粉、肝浸粉和蛋白胨中的一种或几种混合而成的氮源。例如为尿素与酵母粉、肝浸粉和蛋白胨中的一种或几种混合，或者为NH₄Cl与酵母粉、肝浸粉和蛋白胨中的一种或几种混合。

根据本发明的较佳实施例，其中，发酵培养过程中，培养温度25-32℃，通风比为0.5-2:1(vvm)，培养过程中搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧控制在5-80％；控制发酵培养基的pH为4-8。

根据本发明的较佳实施例，其中，pH采用3MNaOH或1M HCl调控至pH＝4-8。

根据本发明的较佳实施例，其中，所述发酵基础培养基中含有：葡萄糖5-15g/L、酵母粉0.1-5g/L、肝浸粉0.1-5g/L、KH₂PO₄ 0.1-0.5g/L、NH₄Cl 0-2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g/L、FeCl₃+EDTA母液0.1-1mL/L、CaCl₂母液0.1-1mL/L、微量元素母液0.1-1mL/L、维生素B1 0.1-5mg/L和维生素B12 0.1-5mg/L、调pH4-8；所述微量元素母液含有硼、锌、锰、钼、钴的金属阳离子或金属酸根离子。

根据本发明的较佳实施例，其中，所述补料培养基中含有：葡萄糖200-500g/L、酵母粉10-50g/L、肝浸粉10-50g/L、KH₂PO₄ 5-50g/L、NH₄Cl 0-50g/L、MgSO₄·7H₂O 5-50g/L、FeCl₃+EDTA母液10-50mL/L、CaCl₂·2H₂O母液10-50mL/L，微量元素母液10-50mL/L、维生素B1 0.1-50mg/L；维生素B12 0.1-50mg/L。

根据本发明的较佳实施例，其中，FeCl₃+EDTA母液含有3.7～3.8g/L的FeCl₃、和8.5-9g/L的Na₂-EDTA；CaCl₂母液含108-115g/L的CaCl₂；微量元素母液含1.9-2.0g/L的H₃BO₃、0.02-0.024g/L的ZnSO₄、0.2-0.24g/L的MnCl₂、0.009-0.012g/L的Na₂MoO₄和0.014-0.016g/L的Co(NO₃)₂。

根据本发明的较佳实施例，其中，所述发酵培养金藻的步骤如下：

S1:摇瓶种子培养

在无菌环境下，将经摇瓶活化后的金藻细胞以2-10％接种量(v/v)接种于摇瓶中进行振荡暗培养，培养温度25-32℃，转速120-220rpm，培养时间2-5天；

S2:将培养好的摇瓶种子液以5-10％(v/v)接种量接种于发酵罐的发酵基础培养基中，保持培养温度25-32℃，通风比为0.5-2:1(vvm)，培养过程中搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧控制在5-80％；控制发酵培养基的pH为4-8；

发酵基础培养基含有碳源和氮源，所述碳源为葡萄糖，所述氮源为有机氮源或采用有机氮源和无机氮源的混合氮源；所述发酵基础培养基中葡萄糖浓度为5-15g/L，所述发酵基础培养基和补料培养基中C/N＝4:1-40:1；

S3:监控发酵体系中发酵培养基的葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度较初始浓度下降0.5-3g/L时，使用速度可调的蠕动泵流加补料培养基进行流加培养，并适时监控测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适时调节补料速度，控制整个流加培养过程中发酵培养基的葡萄糖浓度为1-10g/L；控制发酵过程中发酵培养基C/N＝4:1-40:1；

当连续两次取样点样品发酵干重不变或者开始下降时，发酵结束。

根据本发明的较佳实施例，所述金藻为棕鞭金藻PoterioochromonasmalhamensisCMBB-01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNO.1162，保藏时间：2015年12月2日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。除此之外，本发明还可使用除棕鞭金藻Poterioochromonasmalhamensis CMBB-01之外的其他同样可在细胞内积累水溶性β-1,3-葡聚糖的微藻藻株(例如湛江等边金藻、三角褐指藻等)。

(三)有益效果

(1)本发明利用金藻异养高密度培养生产β-1,3-葡聚糖，可解决现有香菇、酵母、燕麦、青稞原料中β-葡聚糖含量低、提取过程复杂、生产成本高、原料生产规模和生产周期受限制问题。

(2)本发明中β-1,3-葡聚糖为水溶性葡聚糖，提取简单，无需进行修饰。目前大多数β-1,3-葡聚糖为水不溶性葡聚糖，需要通过化学修饰和降解才能转化成水溶性葡聚糖。

(3)本发明通过调控氮源种类的方式调节多糖含量和细胞生长，在提高胞内多糖含量的同时，细胞生长也不会受到影响，细胞内水溶性β-1,3-葡聚糖产量也同时得到大幅提升。反观目前所报道的提高微藻胞内多糖的方法下细胞生长会受到严重抑制，本发明的金藻发酵培养方法具有显著的技术突破。

(4)实验表明，本发明的方法不仅显著提高了金藻的生物量浓度、获得高细胞密度的金藻发酵培养液，同时还显著地提高了金藻细胞中β-葡聚糖的干重百分比，由于这些因素的叠加增益作用，使得人们可从金藻细胞中获得大量水溶性β-1,3-葡聚糖，为产业化生产水溶性β-1,3-葡聚糖奠定技术基础。

附图说明

图1为本发明实验组和两组对照组生物量浓度随时间变化比较。

图2为本发明实验组和两组对照组细胞数量随时间变化比较。

具体实施方式

为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。

本发明实施例提出的一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法，该方法是以高含水溶性β-1,3-葡聚糖的金藻为发酵培养的微生物，通过对发酵基础培养基和补料培养基中碳源浓度的调节、有机氮源和无机氮源的混配，以及C/N比调节等，以获得高细胞密度、高生物量浓度的金藻，收获金藻并从金藻细胞中获得水溶性β-1,3-葡聚糖。本发明的方法，一方面解决香菇、酵母、燕麦、青稞等现有β-1,3-葡聚糖来源中β-1,3-葡聚糖含量低、提取成本高、提取的β-1,3-葡聚糖大多为水不溶性的问题；另一方面解决现有限氮或缺氮方式提高微藻细胞中储存性多糖(如淀粉)含量时细胞生长受到抑制、多糖产量难以提高的技术缺陷，为利用微藻高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖提供参考。

本发明的主要创新点包括：通过改变氮源种类调节金藻细胞生长、和胞内β-1,3-葡聚糖含量的微藻高密度培养；培养过程中先后或同时补充有机氮源和无机氮源的混合氮源；在控制总C/N保持在一定范围(4:1-40:1)内时，混合氮源中有机氮和无机氮之间比例可调；对整个发酵罐培养过程中的葡萄糖浓度变化范围进行了限定，控制整个发酵培养过程中发酵体系的葡萄糖浓度在1-10g/L；整个金藻发酵培养条件，即：培养温度25-32℃，通风比为0.5-2:1(vvm)，培养过程中搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧控制在5-80％；发酵过程控制pH于4-8。

本发明金藻培养过程包括如下2个阶段：

(1)摇瓶种子培养

在无菌环境下，将经摇瓶活化后的金藻细胞以2-10％接种量(v/v)接种于1000mL摇瓶(装液量300mL)中进行振荡暗培养，培养温度25-32℃，转速120-220rpm，培养时间2-5天。

(2)发酵罐培养

①接种：将培养好的摇瓶种子液以5-10％(v/v)接种量接种于7.5L发酵罐中。

②发酵：培养温度25-32℃，通风比为0.5-2:1(vvm)，培养过程中搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧控制在5-80％；发酵过程中用3MNaOH或1M HCl控制pH于4-8。

③发酵基础培养基和补料培养基中碳源为葡萄糖，氮源采用有机氮源(酵母粉、肝浸粉和蛋白胨中的一种或几种)或采用有机+无机混合氮源(尿素+NH4Cl与酵母粉、肝浸粉和蛋白胨中的一种或几种)，发酵基础培养基和补料培养基中C/N＝4:1-40:1，而发酵基础培养基的初始葡萄糖浓度为5-15g/L。

④当发酵过程中，监控到葡萄糖浓度较初始浓度下降0.5-3g/L时，开始使用速度可调的蠕动泵流加发酵补料培养基进行流加培养，并适时监控测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适时调节补料速度，控制整个流加培养过程中，发酵体系中发酵培养基(发酵罐中的培养基)的葡萄糖浓度稳定在1-10g/L，而C/N保持在4:1-40:1。当连续两次取样点样品发酵干重不变或者开始下降时，发酵结束。

以下为本发明的具体实施例。

实验材料的准备

准备藻株：棕鞭金藻(PoterioochromonasmalhamensisCMBB-01)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNO.1162，保藏时间：2015年12月2日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

配制摇瓶培养基：葡萄糖5-15g/L；酵母粉0.5-3g/L；肝浸粉0.2-5g/L；KH₂PO₄ 0.1-0.5g/L；MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g/L；调pH 4-8。

配制发酵基础培养基：葡萄糖5-15g/L；酵母粉0.1-5g/L；肝浸粉0.1-5g/L；KH₂PO₄0.4g/L；NH₄Cl 0-2g/L；MgSO₄·7H₂O 0.3g/L，FeCl₃+EDTA母液0.5mL/L；CaCl₂·2H₂O母液0.5mL/L，微量元素母液0.5mL/L；VB1 2.5mg/L；VB12 2.5mg/L；调pH＝6。

配制发酵补料培养基：葡萄糖200-500g/L；酵母粉10-50g/L；肝浸粉10-50g/L；KH₂PO₄ 40g/L；NH₄Cl 0-50g/L；MgSO₄·7H₂O 30g/L，FeCl₃+EDTA母液25mL/L；CaCl₂·2H₂O母液：25mL/L，微量元素母液：25mL/L，VB1 25mg/L；VB12 25mg/L，调pH＝6-7。

基础培养基和发酵培养基中，三种母液的配制浓度如下：

按照上述条件分别设置1个实验组和2个对照组。实验组和对照组的主要发酵性能指标参见表1。

表1本发明实验组和对照主要发酵性能指标比较

图1和2分别比较了3种不同实验条件下金藻生物量浓度和细胞数随时间的变化情况。在实验组、对照组1和对照组2中，将发酵罐内培养基中葡萄糖浓度始终控制在几乎相同的水平，稳定在1-5g/L之间。

其中：对照组1中，发酵基础培养基和补料培养基以无机氮源氯化铵作为氮源，发酵基础培养基和补料培养基中碳氮比为16:1。

对照组2中，发酵基础培养基和补料培养基均以有机氮源酵母粉和肝浸粉(N元素的质量浓度为1:1)作为氮源，发酵基础培养基和补料培养基中碳氮比为16:1。

实验组中，发酵基础培养基和补料培养基采用混合氮源，无机氮源为氯化铵、有机氮源为酵母粉和肝浸粉(三种氮源所含N元素的质量浓度为1:0.5:0.5)作为氮源，发酵基础培养基和补料培养基中碳氮比为16:1。

实验结果如图1-图2所示：

如图1所示，实验组中生物量浓度随着发酵时间不断快速增长，在发酵8d时，金藻的生物量浓度达到37g/L，而对照组1在发酵约7d时几乎停止增长，生物量浓度达到其最高值，仅约21g/L，对照组2在发酵约7d时几乎停止增长，生物量浓度达到其最高值，仅约17g/L。实验组在发酵6d时，实验组中生物量浓度已超过30g/L。由此说明，发酵基础培养基和补料培养基采用混合氮源最有利于金藻生物量浓度的快速增长，其次是无机氮源的对照组1；而仅采用有机氮源的对照组2，最不利于金藻生物量浓度的增长。

如图2所示，实验组中细胞密度随着发酵时间不断快速增长，在发酵7d时，金藻细胞密度超过2000×10⁵个/mL以上，而对照组1发酵7d时金藻细胞密度仅刚刚超过1000×10⁵个/mL。对照组2在发酵6d时，金藻细胞密度约为1600×10⁵个/mL；实验组在发酵6d时金藻细胞密度约为1900×10⁵个/mL，对照组1在发酵6d时金藻细胞密度约1000×10⁵个/mL。由此说明，发酵基础培养基和补料培养基采用混合氮源最有利于金藻细胞数量的快速增长，其次是有机氮源的对照组2；而仅采用无机氮源的对照组1，最不利于金藻细胞数量的增长。

由图1及图2的结论基本一致可以说明，本发明的发酵培养方法不仅可以提高发酵培养液中生物量的浓度，对细胞数量的增长也没有抑制作用。综上所述，本发明通过调控氮源种类的方式调节多糖含量和细胞生长，在提高胞内多糖含量的同时，细胞生长不会受到影响，细胞内水溶性β-1,3-葡聚糖产量也同时得到大幅提升。反观目前所报道的提高微藻胞内多糖的方法下细胞生长会受到严重抑制，本发明的金藻发酵培养方法具有显著的技术突破。本发明通过优化高含水溶性β-1,3-葡聚糖的金藻异养高密度、高生物量浓度的培养方法，以收获大量金藻细胞。

再由表1可知，β-葡聚糖为金藻生物质干重(％，dwt)的16.2～32.2％。其中，对照组1为28.6，实验组为32.2％，对照组2仅为16.2％。由此说明，实验组不仅获得了最高的生物量浓度，同时还获得β-葡聚糖的最大干重百分比，由于这两种因素的叠加增益，因而可从金藻细胞中获得大量水溶性β-1,3-葡聚糖，为产业化生产水溶性β-1,3-葡聚糖奠定技术基础。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (1)

1.一种通过金藻发酵高效生产水溶性β-1,3-葡聚糖的方法，其特征在于，以高含水溶性β-1,3-葡聚糖的金藻为发酵培养的微生物，生产水溶性β-1,3-葡聚糖的金藻藻种；所述金藻为棕鞭金藻Poterioochromonas malhamensis CMBB-01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNO.11620，保藏时间：2015年12月2日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

所述方法包括如下步骤：

S1:摇瓶种子培养

在无菌环境下，将经摇瓶活化后的金藻细胞以2-10%接种量（v/v）接种于摇瓶中进行振荡暗培养，培养温度25-32℃，转速120-220rpm，培养时间2-5天；

S2:将培养好的摇瓶种子液以5-10%（v/v）接种量接种于发酵罐的发酵基础培养基中，保持培养温度25-32℃，通风比为0.5-2:1(vvm)，培养过程中搅拌速度和溶解氧偶联控制，溶解氧控制在5-80%；采用3MNaOH或1M HCl控制发酵培养基的pH为4-8；

发酵基础培养基含有碳源和氮源，所述碳源为葡萄糖，所述氮源为有机氮源和无机氮源的混合氮源；所述发酵基础培养基中葡萄糖浓度为5-15g/L，所述发酵基础培养基和补料培养基中C/N=16:1；

所述发酵基础培养基中含有：葡萄糖5-15g/L、酵母粉0.1-5g/L、肝浸粉0.1-5g/L、KH₂PO₄ 0.1-0.5g/L、NH₄Cl 0-2g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1-0.5g/L、FeCl₃+EDTA母液0.1-1mL/L、CaCl₂母液0.1-1mL/L、微量元素母液0.1-1mL/L、维生素B1 0.1-5mg/L和维生素B12 0.1-5mg/L、调pH4-8；所述微量元素母液含有硼、锌、锰、钼、钴的金属阳离子或金属酸根离子；

所述补料培养基中含有：葡萄糖200-500g/L、酵母粉10-50g/L、肝浸粉10-50g/L、KH₂PO₄ 5-50g/L、NH₄Cl 0-50g/L、MgSO₄·7H₂O 5-50g/L、FeCl₃+EDTA母液10-50mL/L、CaCl₂·2H₂O母液10-50mL/L，微量元素母液10-50mL/L、维生素B1 0.1-50mg/L；维生素B12 0.1-50mg/L；

FeCl₃+EDTA母液含有3.7~3.8g/L的FeCl₃、和8.5-9g/L的Na₂-EDTA；CaCl₂母液含108-115g/L的CaCl₂；微量元素母液含1.9-2.0g/L的H₃BO₃、0.02-0.024g/L的ZnSO₄、0.2-0.24g/L的MnCl₂、0.009-0.012g/L的Na₂MoO₄和0.014-0.016g/L的Co(NO₃)₂；

S3:监控发酵体系中发酵培养基的葡萄糖浓度，当葡萄糖浓度较初始浓度下降0.5-3g/L时，使用速度可调的蠕动泵流加补料培养基进行流加培养，并适时监控测定葡萄糖浓度，根据葡萄糖浓度的变化适时调节补料速度，控制整个流加培养过程中发酵培养基的葡萄糖浓度为1-10g/L；控制发酵过程中发酵培养基C/N=16:1；

其中，发酵基础培养基和补料培养基采用混合氮源，无机氮源为氯化铵、有机氮源为酵母粉和肝浸粉，三种氮源所含N元素的质量配比为1:0.5:0.5；

当连续两次取样点样品发酵干重不变或者开始下降时，发酵结束。

Images