CN109112168B - 一种利用黄丝藻综合炼制生物产品、生物柴油和生物材料的方法 - Google Patents

一种利用黄丝藻综合炼制生物产品、生物柴油和生物材料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种利用黄丝藻综合炼制生物产品、生物柴油和生物材料的方法。本发明首次提出利用丝状微藻‑黄丝藻的同一种生物质原料联合生产棕榈油酸、金藻昆布糖、生物柴油和纳米纤维素。微藻生物质资源的全方位利用使得微藻产业中生物产品、生物能源和生物纳米材料更好的耦合，有效地增加经济效应。本发明首次建立一条高效的、合理的黄丝藻生物质资源的生物炼制技术路线，即先用稀酸处理微藻生物质，提取胞内多糖，且使得细胞壁结构疏松，更有利于下一步的油脂抽提，而最后的剩余藻渣也被充分利用起来。该技术路线显著降低了生产成本，提高了微藻生物质的利用效率，具有明显的补偿效应。

Description

一种利用黄丝藻综合炼制生物产品、生物柴油和生物材料的 方法
技术领域
本发明专利涉及丝状微藻-黄丝藻(Tribonema sp.)生物质资源的综合炼制，先后从黄丝藻同一生物质原料中提取分离金藻昆布糖、棕榈油酸等活性物质，以及利用提取的油脂和剩余的藻渣分别制备生物柴油和纳米纤维素的技术方法，属于微藻天然产物的分离纯化、生物柴油和生物纳米材料制备等领域，包括提取、色谱柱层析、尿素包埋、酸碱催化甲酯化、酸解等相关技术。
背景技术
目前，微藻生物燃料被认为是最有可能替代传统化石燃料的一种新型的、可再生、可持续的清洁能源。但是，由于技术的局限，主要集中于上游工艺中高油脂产率的优质藻株筛选、高效的微藻规模化培养及节能的采收技术，使得生产成本远高于当前的化石燃料产品，制约了第三代微藻生物能源的商业化发展。
近年来，越来越多的研究者意识到仅仅依靠微藻细胞中油脂或者淀粉组分来实现微藻生物能源大规模的经济化生产是不现实的。微藻，作为一个能将无机物高效转化为有机物的“光合工厂”，除了能够积累油脂、淀粉和蛋白质外，还能够合成一些高附加值的活性物质，如不饱和脂肪酸、活性多糖、类胡萝卜素等。所以，有研究者提出建立微藻生物能源和高附加值生物产品的耦合生产工艺，通过充分挖掘和多角度的利用微藻生物质资源，或许是打通微藻生物能源经济可行性的一条重要途径。因此，生物炼制的概念开始被引入到微藻生物质资源的综合加工过程中，通过生物炼制的方法生产出一系列高价值生物产品去补偿生物能源的生产成本。尽管如此，实现微藻生物炼制经济最大化的前提是要选择优质的藻株和建立合理的炼制工艺。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用黄丝藻综合炼制金藻昆布糖、棕榈油酸、生物柴油及纳米纤维素的方法。其炼制路线如图1所示。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种利用黄丝藻综合炼制金藻昆布糖、棕榈油酸、生物柴油及纳米纤维素的方法，包括以下步骤：
步骤1、黄丝藻的培养：将黄丝藻接种于柱状光生物反应器(或平板光反应器)中，采用mBG-11液体培养基培养，当黄丝藻的生物量浓度达到5.5～6.5g/L时，通过筛绢过滤收获湿藻泥(即生物质)，湿藻泥经真空冷冻干燥或低温烘干后获得干藻粉；
步骤2、稀酸预处理和提取金藻昆布糖：将步骤1的黄丝藻干藻粉先用稀硫酸处理，一方面用于提取微藻细胞内的可溶性多糖----金藻昆布糖，另一方面改变细胞壁的结构，有利于下一步的油脂提取；再分离残留藻体和稀酸提取液上清；稀酸提取液上清通过醇沉、去蛋白、柱层析等分离过程后，获得的精制多糖即为金藻昆布糖；残留藻体水洗后烘干获得提糖后的藻渣，用于总脂的提取；
步骤3、总脂的提取：将步骤2获得的提糖后的藻渣与正己烷和乙醇混合后，先经过超声预处理，然后50℃～60℃水浴恒温搅拌提取油脂；该过程至少重复三次，直到藻渣变成灰白色；而收获的上清合并后，除去正己烷和乙醇，即得到总脂提取物；收获的藻渣为脱脂藻渣；
步骤4、棕榈油酸的分离浓缩：将步骤3中的总脂提取物皂化处理后，通过低温冷冻沉淀法使饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸分离；低温静置后，抽滤所产生滤液(富含不饱和脂肪酸盐)，通过酸解和尿素包埋等过程后获得了高浓度的棕榈油酸；
步骤5、生物柴油的制备：将步骤4中抽滤所获得的不溶物，即饱和脂肪酸盐，先通过酸解获得游离的脂肪酸，然后再通过酸碱两步法催化制备生物柴油；
步骤6、纳米纤维素的制备：将步骤3产生的脱脂藻渣，先通过碱处理和漂白处理获得纤维素，然后再通过浓硫酸酸解获得纳米纤维素。
步骤1中所述的筛绢为300目～500目筛绢，其孔径是30μm～48μm；优选为300目筛绢，其孔径是48μm。
步骤1中所述的mBG-11液体培养基：0.5～1.5g/L NaNO3，0.02～0.06g/LK2HPO4，0.075～0.15g/L MgSO4·7H2O，0.036g/L CaCl2·2H2O，0.006g/L柠檬酸，0.006g/L FeCl3·6H2O，0.001g/L EDTA，0.02g/L Na2CO3，2.860g/L H3BO3，1.810g/L MnCl2·4H2O，0.391g/LNa2MoO4·2H2O，0.079g/L CuSO4·5H2O，0.220g/L ZnSO4·7H2O，1L去离子水，121℃、20min高温灭菌处理；
优选的，所述的mBG-11液体培养基：1.5g/L NaNO3，0.04g/L K2HPO4，0.075g/LMgSO4·7H2O，0.036g/L CaCl2·2H2O，0.006g/L柠檬酸，0.006g/LFeCl3·6H2O，0.001g/LEDTA，0.02g/L Na2CO3，2.860g/L H3BO3，1.810g/LMnCl2·4H2O，0.391g/L Na2MoO4·2H2O，0.079g/L CuSO4·5H2O，0.220g/LZnSO4·7H2O，1L去离子水，121℃、20min高温灭菌处理；
步骤2中所述的稀硫酸处理的过程如下：
称取一定质量的干藻粉，然后悬浮于50～60mM稀硫酸中，置于70～80℃条件下，以150～250rpm转速搅拌提取3～4h；提取结束后，通过筛绢(300目～500目，孔径30μm～48μm)过滤分离残留藻体和上清，其中残留藻体再重复提取1次；合并上清液得稀酸提取液上清；
优选的，所述的稀硫酸处理的过程如下：
称取一定质量的干藻粉，然后悬浮于50mM稀硫酸中，置于80℃条件下，以200rpm转速搅拌提取4h；提取结束后，通过筛绢(300目，孔径48μm)过滤分离残留藻体和上清，其中残留藻体再重复提取1次；合并上清液得稀酸提取液上清；
步骤2中所述的醇沉、去蛋白、柱层析的过程如下：
(1)醇沉：将稀酸提取液上清按照v/v＝1:4～1:6比例加入95％乙醇在4℃～10℃醇沉10～16h；
(2)去蛋白：醇沉的沉淀通过7500rpm的离心10min获得，分别用乙醇、丙酮，乙醚洗涤脱水后冷冻干燥获得粗多糖；获得的粗多糖溶于去离子水中，加入木瓜蛋白酶，60℃恒温水浴磁力搅拌1h，然后温度升到90℃，持续30min，使蛋白酶失活；该反应溶液经7500rpm离心10min后，与正丁醇：氯仿(v/v＝4:1)混合液等体积混合，常温剧烈震荡20min，然后分相，其中上清液继续与正丁醇：氯仿(v/v＝4:1)混合液等体积混合去除蛋白，此过程重复6～8次，直到中间无白色蛋白层物质出现；获得的上清液装入透析袋(MW＝1000Da)中，在流水中持续透析至无正丁醇气味，然后真空冷冻干燥即为脱蛋白多糖；
(3)柱层析：称取一定质量的脱蛋白粗多糖溶于去离子水中，然后进行DEAE-52阴离子交换柱柱层析分离；流动相采用0.1mol/L，0.3mol/L，0.5mol/L的氯化钠溶液，持续梯度洗脱，流速控制0.5mL/min，每5mL洗脱液收集为一管，采用硫酸-苯酚法检测多糖的浓度，即0.1mL洗脱液和1mL 6％苯酚溶液及2mL的浓硫酸混合30min后，测定OD490吸光值，绘制洗脱曲线；将同一个波峰中处于峰肩以上洗脱液合并编号，经流水透析48h后，进行真空冷冻干燥，所得的多糖粉末在利用Sephadex G-200凝胶柱(2×50cm)作进一步的分离；凝胶柱层析前，同样先用0.1mol/L的氯化钠溶液平衡12h，然后上样，流速为0.2mL/min，流动相为0.1mol/L的氯化钠溶液等度洗脱；每2mL洗脱液收集为一管，利用硫酸-苯酚法检测多糖的浓度，合并浓度较高的同一波峰的洗脱液后，流水透析48h后，进行真空冷冻干燥，从而获得金藻昆布糖。
优选的，步骤(1)中，将稀酸提取液上清按照v/v＝1:4比例加入95％乙醇在4℃醇沉12h。
步骤3中所述的总脂的提取的具体步骤如下：
将提糖后的藻渣与95％乙醇：正己烷(v/v＝1:1)按照m/v＝1:25～1:50的比例混合后，置于超声波清洗机中超声处理2～3h；超声处理后，将混合液置于50～60℃的恒温水浴中，持续搅拌(150～250rpm)提取6～8h；提取结束后，通过筛绢过滤剩余藻渣；再次重复上步骤3～4次，直到藻渣变成灰白色，而收获的上清合并后，除去有机试剂，即得到总脂提取物。
优选的，所述的总脂的提取的具体步骤如下：
将提糖后的藻渣与95％乙醇：正己烷(v/v＝1:1)按照m/v＝1:25的比例混合后，置于超声波清洗机中超声处理2h；超声处理后，将混合液置于50℃的恒温水浴中，持续搅拌(200rpm)提取6h；提取结束后，通过筛绢过滤剩余藻渣；再次重复上步骤3～4次，直到藻渣变成灰白色，而收获的上清合并后，除去有机试剂，即得到总脂提取物。
步骤4中所述的棕榈油酸的分离浓缩的具体步骤如下：
称取一定量的总脂提取物与10％KOH-乙醇液体混合，置于70～80℃恒温水浴中磁力搅拌皂化1.0～1.5h；待皂化液冷却至室温后，放入-20℃中静置36～48h；冷冻处理后，分离混合液中的固体相(不溶物)和液体相(滤液)，其中液体相主要为不饱和的脂肪酸盐，则用于棕榈油酸的分离浓缩；上述的液体相加入正己烷反复提取，去除一些色素和未皂化的脂肪酸，然后缓慢加入浓盐酸使得溶液pH＝1～2，不饱和的脂肪酸盐酸解生成游离脂肪酸；通过正己烷萃取及去离子水洗涤后，40℃～50℃真空旋转蒸发获得游离不饱和脂肪酸；称取一定质量的游离不饱和脂肪酸和尿素、95％乙醇混合后，置于50℃恒温水浴中搅拌直至溶液变得澄清，随后放入4℃中尿素包埋36～48h；尿素包埋结束后，同样抽滤得到获得尿素结晶，50℃热水溶解后，并用正己烷萃取；正己烷相经去离子水洗涤后真空旋转蒸发(40℃～50℃)，即得到高浓度的棕榈油酸。
优选的，所述的棕榈油酸的分离浓缩的具体步骤如下：
称取一定量的总脂提取物与10％KOH-乙醇液体混合，置于70℃恒温水浴中磁力搅拌皂化1.0h；待皂化液冷却至室温后，放入-20℃中静置48h；冷冻处理后，分离混合液中的固体相(不溶物)和液体相(滤液)，其中液体相主要为不饱和的脂肪酸盐，则用于棕榈油酸的分离浓缩；上述的液体相加入正己烷反复提取，去除一些色素和未皂化的脂肪酸，然后缓慢加入浓盐酸使得溶液pH＝1～2，不饱和的脂肪酸盐酸解生成游离脂肪酸；通过正己烷萃取及去离子水洗涤后，40℃真空旋转蒸发获得游离不饱和脂肪酸；称取一定质量的游离不饱和脂肪酸和尿素、95％乙醇混合后，置于50℃恒温水浴中搅拌直至溶液变得澄清，随后放入4℃中尿素包埋36h；尿素包埋结束后，同样抽滤得到获得尿素结晶，50℃热水溶解后，并用正己烷萃取；正己烷相经去离子水洗涤后真空旋转蒸发(40℃)，即得到高浓度的棕榈油酸。
步骤5中所述的生物柴油的制备的具体步骤如下：
将步骤4中抽滤所产生的不溶物加入正己烷反复提取，去除一些色素和未皂化的脂肪酸，然后缓慢加入浓盐酸使得溶液pH＝1～2，饱和的脂肪酸盐酸解生成游离脂肪酸；将游离脂肪酸以1％质量比浓硫酸作为催化剂，与甲醇按照1/9的摩尔比混合后，在65℃～80℃的恒温水浴中持续搅拌3h～5h；反应结束后，再加入相同摩尔比的甲醇和1％浓硫酸在65℃～80℃恒温水浴锅里进行继续甲酯化反应2h～3h；反应混合液加入一定体积的热水(70℃～90℃)，经分层后，收集上清，并用去离子水洗涤；随后，利用KOH为催化剂进行酯交换，加入2％的KOH作催化剂，与甲醇按照1/6的摩尔比混合，65℃～80℃恒温水浴锅里持续搅拌反应1.5～3.0h；酯交换结束后，加入等体积的热水反复分层、洗涤、氮气吹干后，获得生物柴油。
优选的，所述的生物柴油的制备的具体步骤如下：
将步骤4中抽滤所产生的不溶物加入正己烷反复提取，去除一些色素和未皂化的脂肪酸，然后缓慢加入浓盐酸使得溶液pH＝1～2，饱和的脂肪酸盐酸解生成游离脂肪酸；将游离脂肪酸以1％质量比浓硫酸作为催化剂，与甲醇按照1/9的摩尔比混合后，在65℃的恒温水浴中持续搅拌3h；反应结束后，再加入相同摩尔比的甲醇和1％浓硫酸在65℃恒温水浴锅里进行继续甲酯化反应2h；反应混合液加入一定体积的热水(70℃)，经分层后，收集上清，并用去离子水洗涤；随后，利用KOH为催化剂进行酯交换，加入2％的KOH作催化剂，与甲醇按照1/6的摩尔比混合，65℃恒温水浴锅里持续搅拌反应2.0h；酯交换结束后，加入等体积的热水反复分层、洗涤、氮气吹干后，获得生物柴油。
步骤6所述的纳米纤维素的制备的具体步骤如下：
将步骤3产生的脱脂藻渣与2％～3％(wt％)NaOH溶液混合后，置于70℃～80℃恒温水浴中持续搅拌2h～3h；碱处理后，5000rpm～7000rpm离心5min～10min去除上清，沉淀用去离子水反复洗涤；干燥后，利用过氧化氢溶液(30wt％)进行漂白处理，即60℃～80℃恒温水浴中持续搅拌漂白2h～3h，此过程重复1～2次，直到藻渣变为白色；1g漂白的藻渣与56～64％硫酸(wt％)混合后，置于45℃～60℃恒温水浴锅内磁力剧烈搅拌45min～60min，然后迅速加入一定体积的去离子水，7000rpm～9000rpm离心10～15min，去除上清；反复加入去离子水离心洗涤，直到上清变得浑浊，即开始收集上清；合并上清浑浊液后，在流水中持续透析直到pH为6～7；透析获得悬浮液超声处理1.0～1.5h，然后进行真空冷冻干燥，即得到纳米纤维素。
优选的，所述的纳米纤维素的制备的具体步骤如下：
将步骤3产生的脱脂藻渣与2％(wt％)NaOH溶液混合后，置于80℃恒温水浴中持续搅拌2h；碱处理后，5000rpm离心5min去除上清，沉淀用去离子水反复洗涤；干燥后，利用过氧化氢溶液(30wt％)进行漂白处理，即80℃恒温水浴中持续搅拌漂白2h，此过程重复1～2次，直到藻渣变为白色；1g漂白的藻渣与60％硫酸(wt％)混合后，置于45℃恒温水浴锅内磁力剧烈搅拌45min，然后迅速加入一定体积的去离子水，8000rpm离心12min，去除上清；反复加入去离子水离心洗涤，直到上清变得浑浊，即开始收集上清；合并上清浑浊液后，在流水中持续透析直到pH为6～7；透析获得悬浮液超声处理1.0h，然后进行真空冷冻干燥，即得到纳米纤维素。
本发明质量控制方法可包括以下含量测定方法中的一种或者几种：
1.生物量测定
准确吸取最后一天的藻液10mL，置于提前称量好的硝酸纤维素滤膜上(0.45um，W1)进行抽滤，得到的含藻滤膜在105℃的烘箱中放置10～12h。待滤膜在干燥器中冷却30min后，精确的称量(W2)，其生物质浓度的计算公式为：生物量(g/L)＝(W2-W1)×100。
2.总脂含量
准确地称取干藻粉M0(60～100mg)，放入带有转子的玻璃离心管中，加入2mL的二甲基亚砜-甲醇(v/v＝1：9)混合液，置于50℃恒温水浴锅内磁力搅拌3h。然后，3500rpm离心5min，取上清放入干净的玻璃小瓶中，再向藻渣加入4mL的正己烷-乙醚溶液(v/v＝1:1)，冰浴条件下继续磁力搅拌2h。3500rpm离心5min后，取上清放入前面的玻璃小瓶中。上述提取过程重复一次，合并的上清液加入4mL的去离子水，静置分层。将上层的有机相转移到新的玻璃离心管中，3500rpm离心5min，取上清置于新的玻璃小瓶中，并用氮气吹干。最后，将吹干的油脂再次转移到预先称重过的EP管中(M1)，氮气吹干后，称重(M2)，即总脂的含量可以通过重量差量法计算得到。计算公式为：总脂含量(wt％)＝(M2-M1)×100％/M0。
3.总碳水化合物的含量
准确称取藻粉10mg，置于带有转子的玻璃离心管中，加入5mL 0.5mol/L的硫酸溶液，然后100℃恒温水浴磁力搅拌4h。3500rpm离心5min后，取上清加入到50mL的容量瓶中，而沉淀再次加入去离子水重复离心洗涤两次。合并上清液，用去离子水定容至50mL。根据葡萄糖的标准曲线，采用苯酚-硫酸法测定总碳水化合物的浓度，即取500μL的提取液和1.5mL的去离子水混合后，再加入1mL 6％的苯酚和5mL的浓硫酸进行显色反应。反应30min后，利用紫外分光光度计测定OD490。
葡萄糖标准曲线的绘制：分别制备0mg/mL，0.01mg/mL，0.02mg/mL，0.03mg/mL，0.04mg/mL，0.05mg/mL，0.06mg/mL，0.07mg/mL，0.08mg/mL，0.09mg/mL的葡萄糖溶液，以葡萄糖浓度为横坐标，OD490为纵坐标，绘制标准曲线。
4.金藻昆布糖含量
准确称取50mg藻粉置于带有转子的玻璃离心管中，加入5mL 50mM的稀硫酸，60℃恒温水浴磁力搅拌提取1h。3500rpm离心5min后，取上清加入到新的玻璃离心管中，而沉淀再次加入5mL的去离子水重复提取一次。合并上清液，用去离子水在容量瓶中定容50mL。取0.4mL的提取液和0.6mL的去离子水混匀后，分别加入1mL 6％的苯酚和5mL的浓硫酸，反应30min后，测定OD490。根据葡萄糖的标准曲线(同上)计算金藻昆布糖的浓度。
5.脂肪酸组成及含量
准确称取藻粉25mg，置于带有转子的玻璃离心管中，加入2mL含有2％硫酸的甲醇-甲苯(v/v＝9:1)混合液及100μL 0.25％的内标(十七烷酸)。80℃恒温水浴磁力搅拌1.5h后，加入1mL的去离子水和1mL的正己烷。3500rpm离心5min后，取200uL的上清置于带有内管的进样瓶中，进行气相色谱检测。通过比较37种脂肪酸甲酯标准品的出峰时间，确定样品中的脂肪酸的组成，而脂肪酸的含量则根据内标峰面积的计算得到。
色谱条件：Aligent 6980气相色谱；火焰离子化检测器；100m×0.25mm×0.25μm毛细管柱；初始进样口的温度和检测器的温度分别为250℃和260℃；柱箱的初始温度设定为140℃，然后升温到240℃；进样体积1μL，氮气作为载气。
本发明的机理是：
黄丝藻，隶属于异鞭藻门、黄藻纲、黄丝藻属，是一种多细胞的丝状微藻。有研究报道，黄丝藻能够积累大量油脂，含量占干重的40％～60％。其中，总脂的主要成分为三酰甘油(TAG)，是适合生物柴油制备的重要原料。而且，该藻还富含多种活性物质，主要包括金藻昆布糖和棕榈油酸。金藻昆布糖，又称β-1,3-葡聚糖，它广泛存在于硅藻、褐藻中，是一类具有特殊生理活性的活性多糖。而棕榈油酸是一种功能性的ω7单不饱和脂肪酸，绝对含量可以高达黄丝藻干重的20％以上。同时，黄丝藻细胞壁中含量大量的纤维素，不含有坚硬的木质素，是酸解制备纳米纤维素的优质原料。除此之外，丝状黄丝藻相比于传统的单细胞产油微藻，由于藻丝较大，其具有易收获、抗污染等优点，明显降低了收获成本。综上所述，黄丝藻是一种适合于生物炼制的重要生物质资源，可应用于生物柴油、生物产品和生物纳米材料的联合生产，显著提高经济效益。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明首次提出利用丝状微藻-黄丝藻的同一种生物质原料联合生产棕榈油酸、金藻昆布糖、生物柴油和纳米纤维素。微藻生物质资源的全方位利用使得微藻产业中生物产品、生物能源和生物纳米材料更好的耦合，有效地增加经济效应。
(2)本发明首次建立一条高效的、合理的黄丝藻生物质资源的生物炼制技术路线，即先用稀酸处理微藻生物质，提取胞内多糖，且使得细胞壁结构疏松，更有利于下一步的油脂抽提，而最后的剩余藻渣也被充分利用起来。该技术路线显著降低了生产成本，提高了微藻生物质的利用效率，具有明显的补偿效应。
附图说明
图1是丝状微藻-黄丝藻生物质的综合炼制路线。
图2是黄丝藻的形态及油脂的尼罗红染色。
图3是黄丝藻中金藻昆布糖的分离与表征；其中，图3A表示阴离子交换柱和；图3B表示凝胶过滤柱；图3C为分离的金藻昆布糖的红外光谱图，895cm-1表明该多糖的主要糖苷键为β-1,3糖苷键；图3D表示通过凝胶色谱法(GPC)测定金藻昆布糖的分子量。
图4是总脂(A)和尿素包埋后(B)脂肪酸组成性分析。
图5是纳米纤维素的表征及粒径分析；其中，图A、B为纳米纤维素的原子力显微镜图；图C、D为纳米纤维素场发射扫描电镜图；图E为纳米纤维素悬浮液的马尔文粒度分析仪结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
所述的丝状微藻-黄丝藻(Tribonema sp.)SAG2178购买于德国哥根廷大学，在藻种库(http://www.uni-goettingen.de/en/45175.html)也可查到。
mBG-11液体培养基：1.5g/L NaNO3，0.04g/L K2HPO4，0.075g/L MgSO4·7H2O，0.036g/L CaCl2·2H2O，0.006g/L柠檬酸，0.006g/L FeCl 3·6H2O，0.001g/L EDTA，0.02g/L Na2CO3，2.860g/L H3BO3，1.810g/L MnCl2·4H2O，0.391g/L Na2MoO4·2H2O，0.079g/LCuSO4·5H 2O，0.220g/L ZnSO4·7H2O，1L去离子水，121℃、20min高温灭菌处理。上述的mBG-11液体培养基在文献“Morphological and spectrometric analyses of lipidsaccumulation in a novel oleaginous microalga,Eustigmatos cf.polyphem(Eustigmatophyceae)[J]Bioprocess and Biosystems Engineering,2013,36:1125-1130.”中公开。
实施例1：丝状微藻-黄丝藻(Tribonema sp.)培养
将保存三角瓶中的丝状微藻-黄丝藻(Tribonema sp.)藻种接种于柱状玻璃光生物反应器(长×内径＝60×6cm)(购自广州根水实验器材有限公司)中扩种培养。培养条件为：mBG-11液体培养基，温度25±1℃，持续单侧白炽灯光照(80～90μmol/m2/s)，含有1％CO2的压缩空气鼓气培养6～7天。扩种培养后，通过筛绢(300目)过滤收获藻体；然后按照0.40～0.50g/L的接种密度接入柱状玻璃光生物反应器(长×内径＝60×6cm)中进行培养，培养基为mBG-11液体培养基，初始硝酸钠浓度分别设置为18mM，持续单侧250μmol/m2/s光照，其他培养条件同上。培养15天后，测定生物量，并通过筛绢(300目，孔径48μm)过滤收获湿藻泥(即生物质)，真空冷冻干燥或低温烘干后获得干藻粉，进行总脂、总碳水化合物和金藻昆布糖含量的测定。
丝状微藻-黄丝藻的生物量为6.21±0.17g/L，总碳水化合物、总脂、金藻昆布糖的含量分别占干重的38.50±1.60％、43.80±0.57％和14.17±0.30％。图2显示为黄丝藻藻丝、藻丝细胞中的油滴。
实施例2：金藻昆布糖的提取分离
称取一定质量的实施例1获得的干藻粉加入烧瓶，然后悬浮于50mM稀硫酸中。烧瓶置于80℃恒温水浴锅内，利用电动搅拌器持续以200rpm转速搅拌提取4h。提取结束后，通过筛绢(300目，孔径48μm)过滤分离残留藻体和上清，其中残留藻体再重复提取1次。合并上清液，按照v/v＝1:4比例加入95％乙醇在4℃醇沉12h。而收获的残留藻体水洗后在60℃烘箱中烘干获得脱糖藻渣，用于总脂的提取。醇沉的沉淀通过7500rpm的离心10min获得，分别用乙醇、丙酮，乙醚洗涤脱水后冷冻干燥获得粗多糖。获得的粗多糖溶于100mL的去离子水中，加入0.5g的木瓜蛋白酶，60℃恒温水浴锅内磁力搅拌1h，然后温度升到90℃，持续30min，使蛋白酶失活。该反应溶液经7500rpm离心10min后，与正丁醇：氯仿(v/v＝4:1)混合液等体积混合，常温剧烈震荡20min，然后在分液漏斗中分相，其中上清液继续与正丁醇：氯仿(v/v＝4:1)混合液等体积混合去除蛋白，此过程重复6～8次，直到中间无白色蛋白层物质出现。获得的上清液装入透析袋(MW＝1000Da)中，在流水中持续透析至无正丁醇气味，然后真空冷冻干燥即为脱蛋白多糖。称取一定质量的脱蛋白粗多糖溶于去离子水中，然后进行DEAE-52阴离子交换柱柱层析分离。流动相采用0.1mol/L，0.3mol/L，0.5mol/L的氯化钠溶液，持续梯度洗脱，流速控制0.5mL/min，每5mL洗脱液收集为一管，采用硫酸-苯酚法检测多糖的浓度，即0.1mL洗脱液和1mL6％苯酚溶液及2mL的浓硫酸混合30min后，测定OD490吸光值，绘制洗脱曲线。将同一个波峰中处于峰肩以上洗脱液合并编号，经流水透析48h后，进行真空冷冻干燥，所得的多糖粉末在利用Sephadex G-200凝胶柱(2×50cm)作进一步的分离。凝胶柱层析前，同样先用0.1mol/L的氯化钠溶液平衡12h，然后上样，流速为0.2mL/min，流动相为0.1mol/L的氯化钠溶液等度洗脱。每2mL洗脱液收集为一管，利用硫酸-苯酚法检测多糖的浓度，合并浓度较高的同一波峰的洗脱液后，流水透析48h后，进行真空冷冻干燥，从而获得金藻昆布糖。
金藻昆布糖的色谱柱层析图如图3A和图3B，分别表示阴离子交换柱和凝胶过滤柱。图3C为分离的金藻昆布糖的红外光谱图，895cm-1表明该多糖的主要糖苷键为β-1,3糖苷键。图3D表示通过凝胶色谱法(GPC)测定金藻昆布糖的分子量，该均一的色谱图表明金藻昆布糖的纯度高，而且根据多种不同分子量右旋糖酐标准品的标准曲线，测定分离的金藻昆布糖的分子量为5.99×103Da。
实施例3：棕榈油酸的提取与富集
(1)总脂的提取：将实施例2获得的提糖后的藻渣与95％乙醇：正己烷(v/v＝1:1)按照m/v＝1:25的比例混合后，置于超声波清洗机中超声处理2h。超声处理后，装有混合液的烧瓶置于50℃的恒温水浴锅，通过电动搅拌器持续搅拌(200rpm)提取6h。提取结束后，通过筛绢过滤剩余藻渣。再次重复上步骤3～4次，直到藻渣变成灰白色，而收获的上清合并后，在旋转蒸发仪中(50℃)除去有机试剂，即得到总脂提取物。经气相色谱检测，总脂中脂肪酸组成主要为豆蔻酸(C14:0)，棕榈酸(C16:0)，棕榈油酸(C16:1)，油酸(C18:1)，二十碳四烯酸(C20:4)和二十碳五烯酸(C20:5)，其中棕榈油酸可以达到干重的18.09±0.65％。
(2)棕榈油酸的浓缩，称取一定量的总脂提取物与10％KOH-乙醇液体混合，置于70℃恒温水浴锅内磁力搅拌皂化1h。待皂化液冷却至室温后，放入-20℃冰箱中静置48h。冷冻处理后，通过布氏漏斗抽滤分离混合液中的固体相(不溶物)和液体相(滤液)，其中固体相主要是饱和的脂肪酸盐，可用于生物柴油的制备，而液体相主要为不饱和的脂肪酸盐，则用于棕榈油酸的分离浓缩。上述的液体相加入正己烷反复提取，去除一些色素和未皂化的脂肪酸，然后缓慢加入浓盐酸使得溶液pH＝1～2，不饱和的脂肪酸盐酸解生成游离脂肪酸。通过正己烷萃取及去离子水洗涤后，40℃真空旋转蒸发获得游离不饱和脂肪酸。称取一定质量的不饱和脂肪酸和尿素、95％乙醇混合后，置于50℃恒温水浴锅内搅拌直至溶液变得澄清，随后放入4℃冰箱中尿素包埋36h。尿素包埋结束后，同样通过布氏漏斗抽滤得到获得尿素结晶，50℃热水溶解后，并用正己烷萃取。正己烷相经去离子水洗涤后真空旋转蒸发(40℃)，即得到高浓度的棕榈油酸，如图4所示，棕榈油酸的含量由原来总脂中的50.95±0.18％提高到80.11±0.09％。
实施例4：生物柴油的制备
棕榈油酸分离过程中饱和脂肪酸盐部分用于生物柴油的制备，即饱和脂肪酸盐经过酸解后得到饱和脂肪酸(同上)。称取3.00g富含饱和脂肪酸的油脂，以1％质量比浓硫酸作为催化剂，与甲醇按照1/9的摩尔比混合后，在65℃的恒温水浴锅里持续搅拌3h。反应结束后，再加入相同摩尔比的甲醇和1％浓硫酸在65℃恒温水浴锅里进行继续甲酯化反应2h。反应混合液加入一定体积的热水(70℃)，经分液漏斗分层后，收集上清，并用去离子水洗涤。随后，利用KOH为催化剂进行酯交换，加入2％的KOH作催化剂，与甲醇按照1/6的摩尔比混合，65℃恒温水浴锅里持续搅拌反应2h。酯交换结束后，加入等体积的热水反复分层、洗涤、氮气吹干后，获得生物柴油，呈淡黄色，澄清，称重2.38g，即生物柴油的转化率达到80％。
实施例5：纳米纤维素的制备
提糖脱脂后的藻渣与2％(wt％)NaOH溶液混合后，置于80℃恒温水浴锅内持续搅拌2h。碱处理后，5000rpm离心5min去除上清，沉淀用去离子水反复洗涤。干燥后，利用过氧化氢溶液(30wt％)进行漂白处理，即80℃恒温水浴锅持续搅拌漂白2h，此过程重复1～2次，直到藻渣变为白色。漂白的藻渣(1g)与60％硫酸(wt％)混合后，置于45℃恒温水浴锅内磁力剧烈搅拌45min，然后迅速加入一定体积的去离子水，8000rpm离心12min，去除上清。反复加入去离子水离心洗涤，直到上清变得浑浊，即开始收集上清。合并上清浑浊液后，在流水中持续透析直到pH为6～7。透析获得悬浮液在超声清洗机里超声处理1h，然后进行真空冷冻干燥，即得到纳米纤维素。
结果如图5显示，纤维素经过强酸处理，非结晶区降解，而保留了呈棒状的、纳米尺寸的结晶区，图A、B为纳米纤维素的原子力显微镜图片，图C、D为纳米纤维素场发射扫描电镜图片。图E是纳米纤维素悬浮液的马尔文粒度分析仪结果，表明酸解制备的纳米纤维素的平均粒径为190.45nm。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种利用黄丝藻综合炼制金藻昆布糖、棕榈油酸、生物柴油及纳米纤维素的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1、黄丝藻的培养：将黄丝藻接种于柱状光生物反应器或平板光反应器中，采用mBG-11液体培养基培养，当黄丝藻的生物量浓度达到5.5～6.5g/L时，通过筛绢过滤收获湿藻泥，湿藻泥经真空冷冻干燥或低温烘干后获得干藻粉；
所述的mBG-11液体培养基：0.5～1.5g/L NaNO3，0.02～0.06g/L K2HPO4，0.075～0.15g/L MgSO4·7H2O，0.036g/L CaCl2·2H2O，0.006g/L柠檬酸，0.006g/L FeCl3·6H2O，0.001g/L EDTA，0.02g/L Na2CO3，2.860g/L H3BO3，1.810g/L MnCl2·4H2O，0.391g/LNa2MoO4·2H2O，0.079g/L CuSO4·5H2O，0.220g/L ZnSO4·7H2O，1L去离子水，121℃、20min高温灭菌处理；
步骤2、稀酸预处理和提取金藻昆布糖：将步骤1的黄丝藻干藻粉先用稀硫酸处理，一方面用于提取微藻细胞内的可溶性多糖----金藻昆布糖，另一方面改变细胞壁的结构，有利于下一步的油脂提取；再分离残留藻体和稀酸提取液上清；稀酸提取液上清通过醇沉、去蛋白、柱层析后，获得的精制多糖即为金藻昆布糖；残留藻体水洗后烘干获得提糖后的藻渣，用于总脂的提取；
步骤3、总脂的提取：将步骤2获得的提糖后的藻渣与正己烷和乙醇混合后，先经过超声预处理，然后50℃～60℃水浴恒温搅拌提取油脂；该过程至少重复三次，直到藻渣变成灰白色；而收获的上清合并后，除去正己烷和乙醇，即得到总脂提取物；收获的藻渣为脱脂藻渣；
步骤4、棕榈油酸的分离浓缩：将步骤3中的总脂提取物皂化处理后，通过低温冷冻沉淀法使饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸分离；低温静置后，抽滤所产生滤液，通过酸解和尿素包埋后获得了高浓度的棕榈油酸；
步骤5、生物柴油的制备：将步骤4中抽滤所获得的不溶物，即饱和脂肪酸盐，先通过酸解获得游离的脂肪酸，然后再通过酸碱两步法催化制备生物柴油；
步骤6、纳米纤维素的制备：将步骤3产生的脱脂藻渣，先通过碱处理和漂白处理获得纤维素，然后再通过浓硫酸酸解获得纳米纤维素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤1中所述的筛绢为300目～500目筛绢，其孔径是30μm～48μm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤2中所述的稀硫酸处理的过程如下：
称取一定质量的干藻粉，然后悬浮于50～60mM稀硫酸中，置于70～80℃条件下，以150～250rpm转速搅拌提取3～4h；提取结束后，通过300目～500目，孔径30μm～48μm的筛绢过滤分离残留藻体和上清，其中残留藻体再重复提取1次；合并上清液得稀酸提取液上清。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤2中所述的醇沉、去蛋白、柱层析的过程如下：
(1)醇沉：将稀酸提取液上清按照v/v＝1:4～1:6比例加入95％乙醇在4℃～10℃醇沉10～16h；
(2)去蛋白：醇沉的沉淀通过7500rpm的离心10min获得，分别用乙醇、丙酮，乙醚洗涤脱水后冷冻干燥获得粗多糖；获得的粗多糖溶于去离子水中，加入木瓜蛋白酶，60℃恒温水浴磁力搅拌1h，然后温度升到90℃，持续30min，使蛋白酶失活；该反应溶液经7500rpm离心10min后，与正丁醇：氯仿v/v＝4:1混合液等体积混合，常温剧烈震荡20min，然后分相，其中上清液继续与正丁醇：氯仿v/v＝4:1混合液等体积混合去除蛋白，此过程重复6～8次，直到中间无白色蛋白层物质出现；获得的上清液装入MW＝1000Da的透析袋中，在流水中持续透析至无正丁醇气味，然后真空冷冻干燥即为脱蛋白多糖；
(3)柱层析：称取一定质量的脱蛋白粗多糖溶于去离子水中，然后进行DEAE-52阴离子交换柱柱层析分离；流动相采用0.1mol/L，0.3mol/L，0.5mol/L的氯化钠溶液，持续梯度洗脱，流速控制0.5mL/min，每5mL洗脱液收集为一管，采用硫酸-苯酚法检测多糖的浓度，即0.1mL洗脱液和1mL 6％苯酚溶液及2mL的浓硫酸混合30min后，测定OD490吸光值，绘制洗脱曲线；将同一个波峰中处于峰肩以上洗脱液合并编号，经流水透析48h后，进行真空冷冻干燥，所得的多糖粉末在利用2×50cm的Sephadex G-200凝胶柱作进一步的分离；凝胶柱层析前，同样先用0.1mol/L的氯化钠溶液平衡12h，然后上样，流速为0.2mL/min，流动相为0.1mol/L的氯化钠溶液等度洗脱；每2mL洗脱液收集为一管，利用硫酸-苯酚法检测多糖的浓度，合并浓度较高的同一波峰的洗脱液后，流水透析48h后，进行真空冷冻干燥，从而获得金藻昆布糖。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中，将稀酸提取液上清按照v/v＝1:4比例加入95％乙醇在4℃醇沉12h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤3中所述的总脂的提取的具体步骤如下：
将提糖后的藻渣与95％乙醇：正己烷v/v＝1:1按照m/v＝1:25～1:50的比例混合后，置于超声波清洗机中超声处理2～3h；超声处理后，将混合液置于50～60℃的恒温水浴中，持续150～250rpm搅拌提取6～8h；提取结束后，通过筛绢过滤剩余藻渣；再次重复上步骤3～4次，直到藻渣变成灰白色，而收获的上清合并后，除去有机试剂，即得到总脂提取物。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤4中所述的棕榈油酸的分离浓缩的具体步骤如下：
称取一定量的总脂提取物与10％KOH-乙醇液体混合，置于70～80℃恒温水浴中磁力搅拌皂化1.0～1.5h；待皂化液冷却至室温后，放入-20℃中静置36～48h；冷冻处理后，分离混合液中的不溶物和滤液，其中滤液主要为不饱和的脂肪酸盐，则用于棕榈油酸的分离浓缩；上述的滤液加入正己烷反复提取，去除一些色素和未皂化的脂肪酸，然后缓慢加入浓盐酸使得溶液pH＝1～2，不饱和的脂肪酸盐酸解生成游离脂肪酸；通过正己烷萃取及去离子水洗涤后，40℃～50℃真空旋转蒸发获得游离不饱和脂肪酸；称取一定质量的游离不饱和脂肪酸和尿素、95％乙醇混合后，置于50℃恒温水浴中搅拌直至溶液变得澄清，随后放入4℃中尿素包埋36～48h；尿素包埋结束后，同样抽滤得到获得尿素结晶，50℃热水溶解后，并用正己烷萃取；正己烷相经去离子水洗涤后40℃～50℃真空旋转蒸发，即得到高浓度的棕榈油酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤5中所述的生物柴油的制备的具体步骤如下：
将步骤4中抽滤所产生的不溶物加入正己烷反复提取，去除一些色素和未皂化的脂肪酸，然后缓慢加入浓盐酸使得溶液pH＝1～2，饱和的脂肪酸盐酸解生成游离脂肪酸；将游离脂肪酸以1％质量比浓硫酸作为催化剂，与甲醇按照1/9的摩尔比混合后，在65℃～80℃的恒温水浴中持续搅拌3h～5h；反应结束后，再加入相同摩尔比的甲醇和1％浓硫酸在65℃～80℃恒温水浴锅里进行继续甲酯化反应2h～3h；反应混合液加入一定体积70℃～90℃的热水，经分层后，收集上清，并用去离子水洗涤；随后，利用KOH为催化剂进行酯交换，加入2％的KOH作催化剂，与甲醇按照1/6的摩尔比混合，65℃～80℃恒温水浴锅里持续搅拌反应1.5～3.0h；酯交换结束后，加入等体积的热水反复分层、洗涤、氮气吹干后，获得生物柴油。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
步骤6所述的纳米纤维素的制备的具体步骤如下：
将步骤3产生的脱脂藻渣与2％～3％NaOH溶液混合后，置于70℃～80℃恒温水浴中持续搅拌2h～3h；碱处理后，5000rpm～7000rpm离心5min～10min去除上清，沉淀用去离子水反复洗涤；干燥后，利用过氧化氢溶液进行漂白处理，即60℃～80℃恒温水浴中持续搅拌漂白2h～3h，此过程重复1～2次，直到藻渣变为白色；1g漂白的藻渣与56～64％硫酸混合后，置于45℃～60℃恒温水浴锅内磁力剧烈搅拌45min～60min，然后迅速加入一定体积的去离子水，7000rpm～9000rpm离心10～15min，去除上清；反复加入去离子水离心洗涤，直到上清变得浑浊，即开始收集上清；合并上清浑浊液后，在流水中持续透析直到pH为6～7；透析获得悬浮液超声处理1.0～1.5h，然后进行真空冷冻干燥，即得到纳米纤维素。
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