CN111925946A - 利用连续流加液体深层发酵生产藨子叶状层菌的工艺 - Google Patents

利用连续流加液体深层发酵生产藨子叶状层菌的工艺 Download PDF

Info

Publication number
CN111925946A
CN111925946A CN202010819134.1A CN202010819134A CN111925946A CN 111925946 A CN111925946 A CN 111925946A CN 202010819134 A CN202010819134 A CN 202010819134A CN 111925946 A CN111925946 A CN 111925946A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
liquid
culture medium
glucose
inoculating
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010819134.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111925946B (zh
Inventor
卢悦
韩卓涛
陈学政
向文良
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong gerun Biotechnology Co.,Ltd.
Original Assignee
Xihua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xihua University filed Critical Xihua University
Priority to CN202010819134.1A priority Critical patent/CN111925946B/zh
Publication of CN111925946A publication Critical patent/CN111925946A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111925946B publication Critical patent/CN111925946B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺，包括将茶藨子叶状层菌菌粉接种于含有固体培养基的无菌平板上分离纯化，挑取单个菌落接种于含有麦麸汁的液体培养基中培养，再在液体培养基中扩大培养后接种于5L发酵罐中进行发酵生产。本发明提出茶藨子叶状层菌的连续流加液体深层发酵生产工艺，提高了茶藨子叶状层菌的产量，也提高了茶藨子叶状层菌中麦角甾醇等活性物质的含量，对提高茶藨子叶状层菌的产量和品质具有重要意义。

Description

利用连续流加液体深层发酵生产藨子叶状层菌的工艺
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，特别涉及利用连续流加液体深层发酵生产藨子叶状层菌的工艺。藨子叶状层菌又名金银花菌，英文名为：Phylloporia fibis(Schumanch.:Fr.)Ryvarden。
背景技术
茶藨子叶状层菌(Phylloporia ribis(Schumach.:Fr.)Ryvarden)，又名金银花菌，为寄生在忍冬科植物忍冬植株上的一种大型真菌。该菌主产于山东平邑，俗称“银花蛾子”，在当地用药历史悠久。该菌经过了长期的民间应用，发现其具有清热、止痛、解毒的功效，常被用来治疗咽喉炎和各种癌症。茶藨子叶状层菌中含有三萜类、多糖类、甾醇类、脂肪酸类等多种活性成分，具有消炎、增强免疫力和抗癌的作用，是与金银花作用相似的珍贵真菌药物资源。
近年来经过对茶藨子叶状层菌的开发利用，市场需要量非常大，人工培养的技术也得到了迅速发展。但固体培养子实体生长缓慢，难以大批量生产，本发明采用液体深层发酵技术批量生产茶藨子叶状层菌，到目前为止，食药用菌的液体深层发酵技术发展非常迅速，利用液体深层发酵技术生产食药用菌菌丝体，提取其中有效成分应用于医药工业取得了很大的发展。本发明生产茶藨子叶状层菌不仅可以提高产菌量，其中的活性成分含量也得到了大幅度提高，有利于该菌的大规模生产和开发利用。
发明内容
为了克服背景技术中固体培养子实体生长缓慢，难以大批量生产等问题，本发明提出茶藨子叶状层菌的连续流加液体深层发酵生产工艺，提高了茶藨子叶状层菌的产量，也提高了茶藨子叶状层菌中麦角甾醇等活性物质的含量，对提高茶藨子叶状层菌的产量和品质具有重要意义。
为了实现上述目的，本发明是按照以下方式实现的：
利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺，包括菌粉划平板分离纯化-液体培养基培养-种子扩大培养-发酵罐发酵生产-菌丝体收集、干燥、活性成分检测和真空包装。
液体发酵培养基由以下物质按重量百分含量配制：蛋白胨2％，无水葡萄糖2.5％，KH2PO40.05％,MgSO4·7H2O 0.025％，麦麸汁的体积百分含量为12.5％，余量为蒸馏水。培养基在121℃下进行高压灭菌20min。
用接种环无菌操作将少量菌粉接种于含有固体培养基无菌平板上，固体培养基格外添加2％的琼脂。发酵罐培养条件：装样量80％，通气量为1vvm，初始搅拌速度为100rpm，维持pH为6.0，温度29℃，培养12h时，提高转速至200rpm并培养至14h，再提高转速至400rpm，培养至36h时通过蠕动泵进行补料；培养48h时将转速提高至800rpm，直至培养96h发酵结束。其中每隔12h取样1次，每次取2份，每份25mL，进行发酵液中生物量和葡萄糖含量的检测。中途补料成分为600mL麦麸汁中加入120g无水葡萄糖和96g蛋白胨，在121℃下进行高压灭菌20min，于超净工作台中冷却至室温后倒入发酵罐的补料瓶中，通过蠕动泵以0.25mL/min的速度进行补料。
发酵结束时通过收集到的干菌量反映最终生物量可达25.45g/L。
本发明方法对发酵生产的茶藨子叶状层菌菌丝体中麦角甾醇含量通过高效液相进行了检测，含量为3.073±0.009mg/g。
本发明的有益效果：
1.调整搅拌转速对发酵生产的影响
茶藨子叶状层菌为好氧菌，在发酵生产过程中适当调整搅拌转速可以使发酵液中的溶氧量(DO值)保持在一个较高水平，从而更有利于菌的生长。在本发明方法产菌过程中，初始搅拌转速为100rpm，按照当发酵液中DO值降至10％以下从而将转速提高1倍思路来调整搅拌转速。
在发酵培养的中后期，由于生物量的进一步增长，发酵液的粘稠度增大，使得在通气量保持在1vvm(通气量÷时间÷发酵液的体积＝1)的情况下，DO值仍会迅速下降，因此还需进一步提高搅拌转速从而提高DO值，使得菌处于一个较好的生长条件。前36h葡萄糖消耗速率约为0.67g/L/h,生物量由最初的1.22g/L增长到10.99g/L。
本发明中对搅拌转速的调整以及调整时间均是在之前多个批次发酵的基础上确立的，通过本发明中对转速的调整，可以使得DO值在发酵生产的大部分过程(约占总发酵时间的2/3)中基本上保持在10％以上。
2.中途补料对发酵生产的影响
36h时的葡萄糖含量已经很低，如果此时发酵结束，按照36h一个批次进行生产的话，批次培养时间太短，就会导致各个批次之间原材料的准备和发酵液的后处理消耗更多的时间，占用大量的人力。通过中途补料可以适当延长发酵培养时间，提高最终产量。
培养36h时，通过补料可以为菌提供充足的能源物质，但由于受到菌的生长速度以及其对能源物质的利用效率等影响，需根据对补料液的成分配比、补料的速度进行合理安排。原则上补料液的浓度越大越好，这样可以减少补料的次数，降低人力成本，并且不会对发酵液的体积产生较大影响。补料成分配比和补料速度确定方法：发酵液中主要的成分为葡萄糖、蛋白胨和麦麸汁，初步补料思路是将与发酵液配制时相同量的葡萄糖、蛋白胨和麦麸汁配制成浓缩液，灭菌后以一定的速度补入发酵罐，使葡萄糖的补入速度略大于前36h葡萄糖的消耗速度，其中前36h葡萄糖消耗速度约为0.67g/L/h。由于在发酵培养过程中会有少部分水分通过冷凝管散失以及定时取样，培养36h时发酵液体积已降至约3.5L，并且由于发酵后期菌的进一步生长以及搅拌转速的进一步提高，对葡萄糖的消耗速度也会增大，因此葡萄糖的补入速度应大于前36h葡萄糖消耗速度，且应增大补料体积，从而适当延长发酵时间。通过几批发酵的测试，最终确定补料方案为36h开始补料，根据发酵液初始配制时葡萄糖、蛋白胨和麦麸汁的配比确定补料液的配比为：120g无水葡萄糖、96g蛋白胨和600mL麦麸汁，补料速度为0.25mL/min。这样补料结束需要约40h，葡萄糖补入速度约为0.85g/L/h。
通过本发明中对搅拌转速、补料成分浓度和补料速度的安排，最终生物量增加到25.45g/L,并且在培养的36h-96h之间，发酵液中的葡萄糖含量均保持在10g/L以下，发酵结束时葡萄糖含量仅为3.31g/L。通过补料加入的葡萄糖得到了有效的利用，补料加入的速度和菌对其消耗的速度基本能够保持在同一水平上，未造成葡萄糖大量的累积和浪费，也避免出现在葡萄糖大量累积或富营养情况下会对菌产生抑制或不利的影响。
3.真空冷冻干燥对菌粉产品的影响
采用真空冷冻干燥，获得的菌丝体呈灰白色，颜色上不会有显著改变，其中的活性成分物质等也不会由于高温等条件遭到破坏。
目前常见的干燥方法还有室内或室外晾干以及采用仪器高温烘干等，采用晾干进行除水干燥，所需时间较长，中途经常会出现霉变等现象；经过滤并用清水清洗后的菌丝体中仍然会残留少量的发酵液成分，采用高温烘干时，会使得菌丝体出现黄褐色的硬结，影响菌丝体的外观和品质。
发酵结束时通过收集到的干菌量反映最终生物量可达25.45g/L。
本发明方法对发酵生产的茶藨子叶状层菌菌丝体中麦角甾醇含量通过高效液相进行了检测，含量为3.073±0.009mg/g，原厂家菌粉中麦角甾醇含量为0.185±0.087mg/g。
附图说明
图1(a)-图1(d)为葡萄糖和蛋白胨含量优化实验过程中葡萄糖消耗和最终生物量图；
图2为本发明的生产工艺流程图；
图3为5L发酵罐发酵生产过程中茶藨子叶状层菌生物量与葡萄糖消耗量变化图；
图4为5L发酵罐发酵生产过程中溶氧量与补料说明图。
图5(a)-图5(c)分别为本方法参数范围内实施例1、实施例2与实施例3的葡萄糖消耗、转速调整和最终生物量的对比图(图5(a)-图5(c)中，实施例3未补料、实施例2在36h补料，补料成分为500mL麦麸汁，100g葡萄糖，80g蛋白胨，补料速度为0.75mL/min)。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚、明白，下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。
实施例1
如图2所示，利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺，包括如下步骤：
培养基的配制和灭菌：液体发酵培养基由以下物质按重量百分含量配制：蛋白胨2％，无水葡萄糖2.5％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O 0.025％，麦麸汁的体积百分含量12.5％，余量为蒸馏水。液体培养基在121℃下进行高压灭菌20min。
菌粉活化和扩大培养：用接种环无菌操作将少量菌粉接种于含有固体培养基无菌平板，经分离纯化后挑选取单个菌落接种于50mL液体培养基中，在避光、29℃、150rpm条件下培养3d，然后将50mL液体无菌操作整体接种于400mL液体培养基中，在避光、29℃、150rpm条件下培养3d。
如图3-4所示，5L发酵罐发酵培养：发酵罐装样量80％，配备4个流加补料瓶，分别为装有2mol/L NaOH溶液的碱液瓶、2mol/L H2SO4溶液的酸液瓶、稀释10倍的食品级消泡剂的消泡瓶和中途用于补料的补料瓶。确保发酵罐完全密封后，将整个发酵系统置于灭菌锅内于121℃下进行高压灭菌20min，待灭菌结束冷却至室温后将其从灭菌锅中取出连接上发酵罐配套的控制系统。调整通气量为1vvm，初始搅拌转速为100rpm，维持pH为6.0，温度29℃。将400mL种子菌液以火焰接种法通过接菌口接种于发酵罐的培养基中进行发酵培养。培养12h时，提高转速至200rpm并培养至14h，然后提高转速至400rpm，培养至36h时通过蠕动泵进行补料，补料成分为600mL麦麸汁中加入120g葡萄糖和96g蛋白胨，在121℃下进行高压灭菌20min冷却至室温后于超净工作台中倒入发酵罐的补料瓶中，通过蠕动泵以0.25mL/min的速度进行补料；培养至48h将转速提高至800rpm，直至培养至96h发酵结束。其中每隔12h取样1次，每次取2份，每份25mL，通过干重法反映发酵液中生物量，通过DNS法测定发酵液中葡萄糖含量。
发酵结束后发酵液用500目滤布过滤收集菌丝体，用3倍发酵液体积的蒸馏水混匀清洗后再次用500目滤布过滤，以除去菌丝体中残留的发酵液中的杂质成分。收集到的菌丝体在-50℃下冰冻24h后置于真空冷冻干燥机内干燥处理24h除去水分。
将干燥处理后的菌丝体用小型打粉机粉碎2min制成菌粉，取一小部分菌粉用来检测其中蛋白质、多糖含量以及麦角甾醇、总三萜等活性物质的含量，其余菌粉用真空密封袋抽真空制成产品。
本发明通过5L发酵罐生产茶藨子叶状层菌，共添加无水葡萄糖220g，消耗无水葡萄糖约206.76g，产菌101.8g(干重)。葡萄糖生物质转化效率约为49.24％。
实施例2
如图2所示，利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺，包括如下步骤：
培养基的配制和灭菌：液体发酵培养基由以下物质按重量百分含量配制：蛋白胨2％，无水葡萄糖2.5％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O 0.025％，麦麸汁的体积百分含量12.5％，余量为蒸馏水。液体培养基在121℃下进行高压灭菌20min。
菌粉活化和扩大培养：用接种环无菌操作将少量菌粉接种于含有固体培养基无菌平板，经分离纯化后挑选取单个菌落接种于50mL液体培养基中，在避光、29℃、150rpm条件下培养3d，然后将50mL液体无菌操作整体接种于400mL液体培养基中，在避光、29℃、150rpm条件下培养3d。
5L发酵罐发酵培养：发酵罐装样量80％，配备4个流加补料瓶，分别为装有2mol/LNaOH溶液的碱液瓶、2mol/L H2SO4溶液的酸液瓶、稀释10倍的食品级消泡剂的消泡瓶和中途用于补料的补料瓶。确保发酵罐完全密封后，将整个发酵系统置于灭菌锅内于121℃下进行高压灭菌20min，待灭菌结束冷却至室温后将其从灭菌锅中取出连接上发酵罐配套的控制系统。调整通气量为1vvm，初始搅拌转速为100rpm，维持pH为6.0，温度29℃。将400mL种子菌液以火焰接种法通过接菌口接种于发酵罐的培养基中进行发酵培养。培养12h时，提高转速至200rpm并培养至14h，然后提高转速至400rpm，培养至36h时通过蠕动泵进行补料，补料成分为500mL麦麸汁中、加入100g葡萄糖和80g蛋白胨，在121℃下进行高压灭菌20min冷却至室温后于超净工作台中倒入发酵罐的补料瓶中，通过蠕动泵以0.75mL/min的速度进行补料；培养至84h将转速提高至800rpm，直至培养96h发酵结束。其中每隔12h取样1次，每次取2份，每份25mL，通过干重法反映发酵液中生物量，通过DNS法测定发酵液中葡萄糖含量。
发酵结束后发酵液用500目滤布过滤收集菌丝体，用3倍发酵液体积的蒸馏水混匀清洗后再次用500目滤布过滤，以除去菌丝体中残留的发酵液中的杂质成分。收集到的菌丝体在-50℃下冰冻24h后置于真空冷冻干燥机内干燥处理24h除去水分。
将干燥处理后的菌丝体用小型打粉机粉碎2min制成菌粉，用真空密封袋抽真空制成产品。
本实施例中共添加无水葡萄糖200g，消耗无水葡萄糖约163.92g，产菌约82.2g(干重)，葡萄糖生物质转化效率约为50.15％。
实施例3
如图2所示，利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺，包括如下步骤：
培养基的配制和灭菌：液体发酵培养基由以下物质按重量百分含量配制：蛋白胨2％，无水葡萄糖2.5％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O 0.025％，麦麸汁的体积百分含量12.5％，余量为蒸馏水。液体培养基在121℃下进行高压灭菌20min。
菌粉活化和扩大培养：用接种环无菌操作将少量菌粉接种于含有固体培养基无菌平板，经分离纯化后挑选取单个菌落接种于50mL液体培养基中，在避光、29℃、150rpm条件下培养3d，然后将50mL液体无菌操作整体接种于400mL液体培养基中，在避光、29℃、150rpm条件下培养3d。
5L发酵罐发酵培养：发酵罐装样量80％，配备4个流加补料瓶，分别为装有2mol/LNaOH溶液的碱液瓶、2mol/L H2SO4溶液的酸液瓶、稀释10倍的食品级消泡剂的消泡瓶和中途用于补料的补料瓶。确保发酵罐完全密封后，将整个发酵系统置于灭菌锅内于121℃下进行高压灭菌20min，待灭菌结束冷却至室温后将其从灭菌锅中取出连接上发酵罐配套的控制系统。调整通气量为1vvm，初始搅拌转速为100rpm，维持pH为6.0，温度29℃。将400mL种子菌液以火焰接种法通过接菌口接种于发酵罐的培养基中进行发酵培养。培养84h时将转速提高到200rpm，直至培养至96h发酵结束，中途未进行补料。其中每隔12h取样1次，每次取2份，每份25mL，通过干重法反映发酵液中生物量，通过DNS法测定发酵液中葡萄糖含量。
发酵结束后发酵液用500目滤布过滤收集菌丝体，用3倍发酵液体积的蒸馏水混匀清洗后再次用500目滤布过滤，以除去菌丝体中残留的发酵液中的杂质成分。收集到的菌丝体在-50℃下冰冻24h后置于真空冷冻干燥机内干燥处理24h除去水分。
将干燥处理后的菌丝体用小型打粉机粉碎2min制成菌粉，用真空密封袋抽真空制成产品。
本实施例中共添加无水葡萄糖100g，消耗无水葡萄糖约48.92g，产菌约50.9g(干重)，葡萄糖生物质转化效率约为104.05％。
如图5(a)-图5(c)所示，实施例1与实施例2、实施例3的对比结果图，可见补料后的发酵罐生产茶藨子叶状层菌产量较未补料的高，且中途适当地调整转速可以加快菌对葡萄糖的消耗，提高菌的生长速度。
实施例4
如图1(a)-图1(b)所示，研究在葡萄糖不同添加量下的产菌情况，包括如下步骤：
菌粉活化液的配制和灭菌：菌粉活化液培养基由以下物质按重量百分含量配制：蛋白胨2％，无水葡萄糖2.5％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O 0.025％，麦麸汁的体积百分含量12.5％，余量为蒸馏水。在121℃下进行高压灭菌20min。
菌粉活化培养：用接种环无菌操作将少量菌粉接种于含有固体培养基无菌平板，经分离纯化后挑选取单个菌落接种于100mL液体培养基中，在避光、29℃、150rpm条件下培养3d。
葡萄糖添加量对产菌影响的实验：按照蛋白胨2％(重量百分比)，麦麸汁12.5％(体积百分比)配制1000mL培养基，用磷酸缓冲溶液将pH调至6.0-6.5后平均分装到10个250mL锥形瓶中，各100mL。将2个锥形瓶设为一组，按照0％、0.5％、1％、2％和4％重量百分比添加葡萄糖，混匀密封后在121℃下进行高压灭菌20min。灭菌结束后置于超净工作台中，待冷却至室温后以无菌操作在每个锥形瓶中加入2mL培养3d的活化液，在避光、29℃、150rpm条件下培养5d。每隔24h取样一次，每次取样5mL，通过干重法反映培养液中生物量，通过DNS法测定培养液中葡萄糖含量。
发酵结束后发酵液通过布氏漏斗抽滤收集菌丝体，用3倍发酵液体积的蒸馏水混匀清洗后再次用布氏漏斗抽滤，以除去菌丝体中残留的发酵液中的杂质成分。收集到的菌丝体在-50℃下冰冻24h后置于真空冷冻干燥机内干燥处理24h除去水分。
将干燥处理后的菌丝体充分研磨后通过高效液相检测各组菌丝体中麦角甾醇含量。
实施例5
如图1(c)-图1(d)所示，研究在蛋白胨不同添加量下的产菌情况，包括如下步骤：
菌粉活化液的配制和灭菌：菌粉活化液培养基由以下物质按重量百分含量配制：蛋白胨2％，无水葡萄糖2.5％，KH2PO40.05％，MgSO4·7H2O 0.025％，麦麸汁的体积百分含量12.5％，余量为蒸馏水。在121℃下进行高压灭菌20min。
菌粉活化培养：用接种环无菌操作将少量菌粉接种于含有固体培养基无菌平板，经分离纯化后挑选取单个菌落接种于100mL液体培养基中，在避光、29℃、150rpm条件下培养3d。
蛋白胨添加量对产菌影响的实验：按照葡萄糖2.5％(重量百分比)，麦麸汁12.5％(体积百分比)配制1000mL培养基，用磷酸缓冲溶液将pH调至6.0-6.5后平均分装到10个250mL锥形瓶中，各100mL。将2个锥形瓶设为一组，按照0％、0.01％、0.2％、1％和2％重量百分比添加蛋白胨，混匀密封后在121℃下进行高压灭菌20min。灭菌结束后置于超净工作台中，待冷却至室温后以无菌操作在每个锥形瓶中加入2mL培养3d的活化液，在避光、29℃、150rpm条件下培养5d。每隔24h取样一次，每次取样5mL，通过干重法反映培养液中生物量，通过DNS法测定培养液中葡萄糖含量。
发酵结束后发酵液通过布氏漏斗抽滤收集菌丝体，用3倍发酵液体积的蒸馏水混匀清洗后再次用布氏漏斗抽滤，以除去菌丝体中残留的发酵液中的杂质成分。收集到的菌丝体在-50℃下冰冻24h后置于真空冷冻干燥机内干燥处理24h除去水分。
将干燥处理后的菌丝体充分研磨后通过高效液相检测各组菌丝体中麦角甾醇含量
实施例4中，通过高效液相法测定了不同葡萄糖添加量下各组菌丝体中麦角甾醇的含量，发现0％、0.5％、1％、2％和4％葡萄糖添加量下生产的菌丝体中麦角甾醇含量分别约为4.980mg/g、0.276mg/g、2.316mg/g、1.234mg/g和1.228mg/g。
实施例5中，通过高效液相法测定了不同蛋白胨添加量下各组菌丝体中麦角甾醇的含量，发现0％、0.01％、0.2％、1％和2％蛋白胨添加量下生产的菌丝体中麦角甾醇含量分别约为2.231mg/g、1.745mg/g、2.602mg/g、2.931mg/g和1.927mg/g。
通过图1(a)-图1(d)中培养了5天的实验，获得了葡萄糖消耗情况、最终生物量数据，验证了适量添加葡萄糖及蛋白胨均能够有效提高液体发酵中茶藨子叶状层菌的产量。
实施例1中，通过高效液相法测定了本方法生产的茶藨子叶状层菌菌丝体中麦角甾醇的含量。菌粉先由石油醚索氏抽提6h，挥发掉石油醚后以无水乙醇定容至5mL，再利用0.45um滤头过滤后装于1.5mL进样瓶中待上机检测。结果发现以Waters2695高效液相色谱仪，Agilent Eclipse Plus C18(4.6*150mm5um)色谱柱，柱温：30℃，流动相：甲醇；流速：1.0mL·min-1；检测波长：282nm；柱温：30℃；进样量：20uL。
标准曲线在0.1-1.0mg/L内线性良好，R2＝0.9993。经过本发明生产的茶藨子叶状层菌麦角甾醇含量为3.073±0.009mg/g。
以齐墩果酸为标准品，以三萜类物质经氯仿提取后在香草醛-浓硫酸作用下生成显色物质原理通过紫外分光光度计测定了经发酵罐生产的茶藨子叶状层菌中总三萜的含量。结果发现齐墩果酸标准曲线在0-0.057mg/mL内线性良好，R2＝0.9969。经过本方法生产的茶藨子叶状层菌总三萜含量约为46.4mg/g。
以凯氏定氮法，通过海能自动凯氏定氮仪对本方法生产的茶藨子叶状层菌菌丝体中蛋白质含量进行了测定，发现经过本方法生产的茶藨子叶状层菌中蛋白质含量约为28.38％，总氮含量约为4.54％。
以苯酚-硫酸法，通过紫外分光光度计在490nm波长处测定了本发明方法生产的茶藨子叶状层均菌丝体中多糖含量为7.9％。
本发明调整搅拌转速会使得发酵液中溶氧值保持在一个较高的水平、提高菌的生长速度和菌对葡萄糖等的消耗速度。
本发明中途补料可以适当延长整体的发酵培养时间，减少各个批次时间原材料准备和发酵液后续处理的次数，避免更多人力的消耗，同时也可以为菌的生长提供较为充足的能源物质，提高菌的生长速度从而提高最终产量。
本发明搅拌速度和补料成分配比以及补料速度的合理安排可以使得葡萄糖等能源物质的补入速度与菌对其的消耗速度保持在同一水平，避免了葡萄糖的大量累计和浪费，也避免出现在葡萄糖大量累积或富营养情况下会对菌产生抑制或不利的影响。
本发明采用真空冷冻干燥获得菌丝体呈灰白色，品质较好。
最后说明的是，以上所述为本发明的优选实施方式，尽管通过上述优选实施例，已经对本发明进行了详细的说明，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种改变，而不偏离本发明的权利要求书所要求的范围。

Claims (3)

1.利用连续流加液体深层发酵生产藨子叶状层菌的工艺，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1.培养基的配制和灭菌
配制好的液体培养基中，各物质的重量百分含量是：蛋白胨0-2％，无水葡萄糖0-4％，KH2PO40.05％,MgSO4·7H2O 0.025％，麦麸汁的体积百分含量是12.5％，余量为蒸馏水，将制备好的液体培养基在121℃下进行高压灭菌20min；
步骤2.菌粉活化和扩大培养
用接种环无菌操作将少量菌粉接种于含有固体培养基无菌平板上，经分离纯化后挑取单个菌落接种于50mL液体培养基中，在避光、29℃、150rpm条件下培养3d，然后将50mL液体无菌操作整体接种于400mL液体培养基中，在避光、29℃、150rpm条件下培养3d；
步骤3.发酵罐发酵培养：
发酵罐装样量80％，确保发酵罐完全密封后，将整个发酵罐置于灭菌锅内于121℃下进行高压灭菌20min，待灭菌结束冷却至室温后将其从灭菌锅中取出连接上发酵罐配套的控制系统；调整通气量为1vvm，初始搅拌转速为100rpm,维持pH为6.0-6.5，温度29℃-30℃；
将步骤2中400mL种子菌液以火焰接种法通过接菌口接种于发酵罐的培养基中进行发酵培养，将搅拌转速与溶氧值联合，按照溶氧值降至10％以下时将转速提高1倍调整搅拌转速，每隔12h取样1次，每次取样时取2份，2份的平均值作为最终结果，各取20-25mL，通过干重法测得发酵液中生物量，通过DNS法测定发酵液中葡萄糖含量，当发酵液中葡萄糖含量低于5g/L时，开始补料，补料液为一定浓度的麦麸汁、无水葡萄糖和蛋白胨的混合液体，体积维持在500-700mL，无水葡萄糖和蛋白胨的比例维持在5:2至5:4，补料液混匀后在121℃下进行高压灭菌20min，冷却至室温后于超净工作台中倒入发酵罐的补料瓶中，通过蠕动泵泵入发酵罐中，补料速度维持在0.25-0.75mL/min，待补料结束，发酵液中葡萄糖含量降低至3g/L及以下时，结束发酵；
步骤4.收集菌丝
发酵结束后发酵液用500目滤布过滤收集菌丝体，用3倍发酵液体积的蒸馏水混匀清洗后再次用500目滤布过滤，以除去菌丝体中残留的发酵液中的杂质成分，收集到的菌丝体在-50℃下冰冻24h后置于真空冷冻干燥机内干燥处理24h除去水分；
步骤5.菌丝制品
将干燥处理后的菌丝体用小型打粉机粉碎2min制成菌粉，取一小部分菌粉用来检测其中蛋白质、多糖含量以及麦角甾醇、总三萜活性物质的含量，其余菌粉用真空密封袋抽真空制成产品。
2.根据权利要求1所述的利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺，其特征在于，步骤1中麦麸汁是按照每升蒸馏水中加入160g麦麸煮30min，过滤、离心后取上清液所得。
3.根据权利要求1所述的利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺，其特征在于，步骤2中，固体培养基格外添加2％的琼脂。
CN202010819134.1A 2020-08-14 2020-08-14 利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺 Active CN111925946B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010819134.1A CN111925946B (zh) 2020-08-14 2020-08-14 利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010819134.1A CN111925946B (zh) 2020-08-14 2020-08-14 利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111925946A true CN111925946A (zh) 2020-11-13
CN111925946B CN111925946B (zh) 2021-09-14

Family

ID=73312065

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010819134.1A Active CN111925946B (zh) 2020-08-14 2020-08-14 利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111925946B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112841356A (zh) * 2021-03-19 2021-05-28 厦门惠尔康食品有限公司 一种谢瓦氏曲霉液态发酵制备金花菌发酵茶饮的工艺方法
CN115340952A (zh) * 2021-05-14 2022-11-15 中国医学科学院药用植物研究所 一种忍冬茎提取物提高茶藨子叶状层菌发酵菌丝体质量的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191183A (zh) * 2010-12-09 2011-09-21 徐凌川 金银花菌深层发酵生产工艺
CN106036305A (zh) * 2015-09-15 2016-10-26 廉士文 茶藨子叶状层菌深层发酵液加工制成饮料制备方法
CN106165811A (zh) * 2015-12-07 2016-11-30 廉正 一种金银花菌深层发酵液加工制成饮料制备工艺

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191183A (zh) * 2010-12-09 2011-09-21 徐凌川 金银花菌深层发酵生产工艺
CN106036305A (zh) * 2015-09-15 2016-10-26 廉士文 茶藨子叶状层菌深层发酵液加工制成饮料制备方法
CN106165811A (zh) * 2015-12-07 2016-11-30 廉正 一种金银花菌深层发酵液加工制成饮料制备工艺

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
秦国培: "茶藨子叶状层菌的深层发酵及其菌丝质量标准研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
陈蒙蒙等: "茶藨子叶状层菌固体培养特性", 《食用菌学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112841356A (zh) * 2021-03-19 2021-05-28 厦门惠尔康食品有限公司 一种谢瓦氏曲霉液态发酵制备金花菌发酵茶饮的工艺方法
CN112841356B (zh) * 2021-03-19 2023-11-14 厦门惠尔康食品有限公司 一种谢瓦氏曲霉液态发酵制备金花菌发酵茶饮的工艺方法
CN115340952A (zh) * 2021-05-14 2022-11-15 中国医学科学院药用植物研究所 一种忍冬茎提取物提高茶藨子叶状层菌发酵菌丝体质量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111925946B (zh) 2021-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109939027B (zh) 一种猴头菌发酵制备含麦角硫因的化妆品原液的方法
CN105695543B (zh) 一种生物表面活性素的生产方法
CN104473145A (zh) 一种牛樟芝深层发酵复方制品及其制备方法
CN111925946B (zh) 利用连续流加液体深层发酵生产茶藨子叶状层菌的工艺
CN112481134B (zh) 一种利用微生物发酵法提取桑叶多糖的方法
CN104323222B (zh) 一种富含维生素k2的菌菇粉及其制备方法
CN109536560A (zh) 一种提高人参水提取物中稀有皂苷含量的方法
CN106434373A (zh) 一种绣球菌的高密度发酵培养基配方及其医药级葡聚糖制备方法
CN116064685B (zh) 一种冠突散囊菌发酵食用中药的制备工艺及其应用
CN106282266A (zh) 一种利用柚苷酶制备浒苔寡糖的方法
CN104262502A (zh) 一种灵芝粗多糖的提取方法
CN110218656B (zh) 利用空气压力脉动的灵芝-药渣双向固体发酵方法及应用
WO2020134688A1 (zh) 一种发酵猴头菌制备高纯度猴头菌多糖的方法和发酵培养基
CN110613032A (zh) 一种新型增香茶饮品的担子菌发酵体系建立方法
CN105535035B (zh) 一种桦褐孔菌发酵培养组合物及其制备方法
CN105087737B (zh) 一种利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法与应用
CN101407767A (zh) 一种通过发酵生产冬虫夏草的方法
CN116254306A (zh) 一种发酵高产银耳多糖的方法
CN110699263B (zh) 黑曲霉yh-6及其应用于提高淫羊藿中淫羊藿素的含量
AU2020102037A4 (en) A method of efficiently increasing the alpha-glucosidase inhibitor content in fresh mulberry leaves by the solid-state fermentation
CN104862238A (zh) 一株酿酒酵母及其应用
CN104830736A (zh) 一株戊糖片球菌及其应用
CN117547572B (zh) 一种组合物的复合乳酸菌发酵品的制备方法、产品及应用
CN116549507B (zh) 一种微生物发酵法制备葛根提取物的方法
CN112662568B (zh) 产黄青霉及其在制备单宁酶和降解单宁中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Chen Xuezheng

Inventor after: Han Zhuotao

Inventor after: Lu Yue

Inventor after: Xiang Wenliang

Inventor before: Lu Yue

Inventor before: Han Zhuotao

Inventor before: Chen Xuezheng

Inventor before: Xiang Wenliang

TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20210120

Address after: 250101 no.1-2006, block EF, Dinghao Plaza, No.44, Gongye South Road, high tech Zone, Jinan City, Shandong Province

Applicant after: Shandong gerun Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 610039, No. 999, Jin Zhou road, Jinniu District, Sichuan, Chengdu

Applicant before: XIHUA University

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant