CN103960117A - 一种制备黄丝藻生物油的方法及由其制备的黄丝藻生物油 - Google Patents
一种制备黄丝藻生物油的方法及由其制备的黄丝藻生物油 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种由黄丝藻制备生物油的方法以及由该方法制备的黄丝藻生物油,以及由该生物油制备的生物柴油、航空煤油、食品或饲料。具体地说,是将同形黄丝藻、普通黄丝藻、小型黄丝藻、拟丝黄丝藻和囊状黄丝藻中的一种或两种或更多种藻种的混合物利用开放式培养装置或者封闭式培养装置,或在黄丝藻以生物膜形态附着生长的培养装置上进行规模培养,培养获得含油的黄丝藻生物质。这种黄丝藻生物质经过有机溶剂提取,或者压榨,或者提取与压榨的结合方法制备含甘油三酯40~80wt%,脂肪酸组成中十六碳脂肪酸的含量为65~85wt%,二十碳的多不饱和脂肪酸含量为6~15wt%的生物油。
Description
技术领域
本发明涉及一种由黄丝藻制备生物油的方法以及由其制备的黄丝藻生物油,以及由所述黄丝藻生物油生产的生物柴油、航空燃油、食品、食品添加剂、饲料或饵料。本发明还涉及一种工业化培养黄丝藻的方法。
背景技术
近年来,石化燃油日趋匮乏,能源危机成为受政府及学界重视的问题。此外,石化燃油的泛滥导致空气污染加重,影响大气环境及人类健康。因此,可再生、碳平衡、来源广泛的生物液体燃料开始备受关注。其中,生物柴油及生物航空燃油两类液体燃料尤为重要。生物柴油是由生物油通过甲酯化后得到的含氧的生物燃料;生物航空燃料是生物油通过脱酸、加氢、异构等工序制备的不含氧的烷烃生物燃料。生物油是制备以上两种液体燃料的重要原料。目前,工业上的生物油主要来源于回收油脂(餐饮废油)、农作物油脂(棕榈油、油茶油等)和非农作物油脂(微藻油、产油酵母油等)等。其中餐饮废油存在来源少和收集成本高的缺点,而农作物油脂存在与人争粮、与粮争地的缺点,因此非农作物来源的微藻油成为最有潜力的选择。
已经报道了几种微藻生物油,包括小球藻(非专利文献1)、盐藻(非专利文献2)、微拟绿球藻(非专利文献3)、异养小球藻(专利文献1)、微拟绿球藻(专利文献2)、舟形藻(专利文献3)、新月菱形藻(专利文献4)等来源的生物油被作为生物柴油的原料。但是其中部分微藻生物油原料中甘油三酯含量低且含有更多极性脂和其他非脂肪酸甘油酯类的成分。比如,光合自养培养的小球藻中甘油三酯含量占18%,中性脂含量共25%(非专利文献1);两种光合自养盐藻的生物油中甘油三酯含量分别为2%和8%,总中性脂含量分别为38%和39%(非专利文献2),而在鱼腥藻、集胞藻等蓝藻油脂中几乎不积累甘油三酯。以低甘油三酯生物油为原料的工艺中生物柴油的产率低,并且需要更复杂的除杂工艺流程以纯化生物柴油产品,增高生产成本和环境风险。因此,提供一种甘油三酯含量更高的微藻生物油原料对降低微藻生物液体燃料的生产成本相当重要。
现有技术中用于生产生物油或生物燃料的微藻大多数是单细胞或几个细胞的群体,很少有利用丝状藻生产生物油脂的记载,其主要原因是多数研究者认为单细胞藻类易于培养。但事实上是单细胞藻类因为细胞个体小而具有以下缺点:a)难于收获或分离;b)易被轮虫、纤毛虫等虫害摄食而减产,因此其规模化生产受限制。
丝状藻,主要是绿藻门、蓝藻门、硅藻门、黄藻门中的丝状藻属,其藻丝大多数由几百到几千个细胞形成单列或具分枝的形态,其群体大小可以达到毫米或厘米级。黄丝藻是一类丝状黄藻,自然生长于池塘、溪流等水体中。关于黄丝藻的研究记载极少,一般认为其油脂产量低、生长慢。比如Mercer等发现培养14天的同形黄丝藻油脂产量为36.8mg/L,油脂产率仅为2.63mg/L/天[非专利文献4]。
近年来,新的培养技术的发展,尤其是新的贴壁生产技术[专利文献5],使丝状藻的规模化培养成为可能。与单细胞藻培养相比,丝状藻有其明显的优势。
考虑到单细胞藻在工业应用中的缺陷和新技术的发现对丝状藻生产的促进,我们设计了生产高油脂含量黄丝藻的培养工艺和加工黄丝藻生产生物油的工艺。利用本发明的培养方法,可使黄丝藻的生物质产率最高为65g/m2/天,油脂含量最高为62%(质量分数),生物油产率达到24.5~25.9g/m2/天。
此外,生产成本高、油脂产量低是制约微藻生物液体燃料产业化的瓶颈问题。通过经济化、简化生产工艺是降低生产成本的主要方式;通过筛选适宜规模化生产的藻种并优化其培养工艺也能够显著提高藻类生物油的产率。另外,发现并实施联产微藻高附加值产品也能够大大降低整个产业链的成本。
现有技术文献:
非专利文献1:Khasanova,V.M.;Gusakova,S.D.;Taubaev,T.T.,Composition of the neutral lipids of Chlorella vulgaris.Chem.Nat.Compd.1978,14(1):37-40
非专利文献2:Vanitha,A.;Narayan,M.S.;Murthy,K.N.C.;Ravishankar,G.A.,Comparative study of lipid composition of two halotolerant alga,Dunaliella bardawil and Dunaliella salina.Int.J.Food Sci.Nutr.2007,58(5):373-382.
非专利文献3:Krohn,B.J.;McNeff,C.V.;Yan,B.;Nowlan,D.,Production ofalgae-based biodiesel using the continuous catalyticprocess.Bioresour.Technol.2011,102(1):94-100.
非专利文献4:Mercer,E.I.,R.A.London,I.S.A.Kent,and A.J.Taylor Sterols,sterol esters and fatty acids of Botrydium granulatum,Tribonema aequale andMonodus subterraneus.Phytochemistry.1974,13:845-852.
专利文献1:中国专利公开CN101280328
专利文献2:中国专利公开CN101835887
专利文献3:国际公开WO2010116611,中国专利公开CN102388126(同族专利)
专利文献4:中国专利公开CN102408994
专利文献5:中国专利公开CN102373156
发明内容
在第一方面,针对生物柴油原料生产能力不足、单细胞藻在工业生产中收获困难、易于受虫害摄食而减产的缺陷,本发明提供了一种可工业化的培养高油脂含量黄丝藻的方法,所述方法包括:选用黄丝藻属的藻株为藻种,在全BG11培养液中培养种子液;随后将黄丝藻种子液和营养限制的培养基一起接种到扩大培养装置中,在光照强度为50~1000μmol/m2/s的室内人工光照,或50~2000μmol/m2/s室外自然光照下,培养温度为15℃~35℃,通入含1%~15%二氧化碳的气体培养5天~25天;其中所述培养基为营养限制的BG11培养基,限制培养基中硝酸钠浓度为15g/L以下,例如,硝酸钠浓度为0.15g/L~0.75g/L、0.75g/L~1.5g/L、1.5g/L~15g/L。
本发明人选用黄藻门异丝藻目黄丝藻属,通过购买或者分离纯化得到黄丝藻藻株20余种,主要是选自同形黄丝藻(Tribonema aequale)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、小型黄丝藻(Tribonema minus)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)和囊状黄丝藻(Tribonema utriculosum)中的一种或两种或更多种的组合。在适当的培养装置中,优化培养基的营养组成,优化光照、通气等外部环境,使黄丝藻能够迅速生长并积累油脂,最终得到大量的高油脂含量黄丝藻。在多个实施方式中,黄丝藻分别在不同培养装置中,在光照强度为50~1000μmol/m2/s的室内人工光照,或50~2000μmol/m2/s室外自然光照下,培养温度为15℃~35℃,通入含1%~15%二氧化碳的气体培养5天~25天,培养基BG11中硝酸钠的含量为0.15g/L~15g/L。黄丝藻生物质产率最高为65g/m2/天。根据收获时间、培养环境的不同,黄丝藻生物质中油脂含量为干重的15%~70%。
可以使用的培养装置是能够容纳黄丝藻以液态形式生长的开放式培养装置,例如跑道式培养池;或者封闭式培养装置,例如,平板式反应器、柱式光反应器或者管道式反应器;或者两者耦合的培养装置。也可以使用可以实现黄丝藻以生物膜形态附着生长部件的反应器装置,例如,单层平面式附着(贴壁)培养反应器、或者多层平面以水平或垂直方式排列的阵列式培养反应器、或者转盘式反应器、或者转鼓式反应器。
在第二方面,针对生物柴油原料生产能力不足、常规的微藻原料甘油三酯偏低的问题,本发明提供了一种黄丝藻生物油和一种生产黄丝藻生物油的方法。生产黄丝藻生物油的方法的主要步骤为:(1)用第一方面所述的方法培养黄丝藻,获取黄丝藻生物质;(2)通过提取,或者压榨,或者提取与压榨相结合的方法加工步骤(1)中获取的黄丝藻生物质而制备生物油。
本发明所述的黄丝藻生物油是通过加工利用本发明第一方面所述的培养方法获得的高油脂含量的黄丝藻生物质,经过提取,或者压榨,或者提取与压榨相结合的方法加工后而得到。
本领域技术人员应该理解,利用黄丝藻制备生物油技术的难点在于很难获得足够量的高油脂含量的黄丝藻生物质,利用本发明第一方面提供的培养黄丝藻的方法来培养黄丝藻,能够获得足够量的高油脂含量的黄丝藻生物质,从而足以用于制备黄丝藻生物油。至于从黄丝藻生物质制备生物油的方法,可以利用本领域常规的从藻类生物质制备生物油的方法,经过有机溶剂提取,或者压榨,或者有机溶剂提取与压榨相结合的方法加工后而得到。关于提供工艺的选择以及合适的有机溶剂的选择,均在本领域技术人员的技术能力范围之内。
本发明提供的黄丝藻生物油产品,其中包含占生物油重量40~90wt%的甘油三酯和10~60wt%的总极性脂。在本发明的一个实施例中,黄丝藻生物油含有80wt%~90wt%的甘油三酯、少于5wt%的甘油二酯和10wt%~15wt%的总极性脂。本发明提供的黄丝藻生物油,其脂肪酸组成中十六碳脂肪酸的含量为65wt%~85wt%,二十碳的多不饱和脂肪酸含量为6wt%~15wt%。在本发明的一个实施方式中,黄丝藻生物油中含有3wt%~6wt%的二十碳五烯酸(EPA)、1.5wt%~3.5wt%的花生四烯酸(AA)。
本发明第二方面提供的黄丝藻生物油中的脂肪酸组成中碳链长度小于16碳的脂肪酸占总生脂肪酸含量的约80wt%~90wt%,利用此生物油为原料制备生物柴油产品具有更高的十六烷值,因而具有更好的低温性能。此外,本发明生物油的单位面积的产率高达25.9g/m2/天,因此本发明可以提供质优量大的用于生物柴油生产的原料。
本发明第二方面提供的黄丝藻生物油中不饱和脂肪酸的含量达到55wt%~70wt%,其脂肪酸链中含有1~5个不饱和位点,提供了裂解形成烃的多个位点,因而能够成为裂解生成具有2~8个碳的烃,适合生产生物航空燃油。
本发明第二方面提供的黄丝藻生物油中含有3wt%~6wt%的二十碳五烯酸(EPA)、1.5wt%~3.5wt%的花生四烯酸(AA),和其他的长链多不饱和脂肪酸(PUFA),特别适合作为饲料/饵料、食品或者食品添加剂的应用。
在第三方面,本发明提供由第二方面的黄丝藻生物油制备的生物柴油或航空生物燃油、饲料、饵料、食品或者食品添加剂。
综上所述,本发明提供下述各项:
1.一种培养产油黄丝藻的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)选用黄丝藻属的藻株为藻种,在全BG11培养液中培养种子液;
(2)将步骤(1)得到的黄丝藻种子液和营养限制的培养基一起接种到扩
大培养装置中,光照培养5天~25天;
(3)控制步骤(2)中的光照强度和通入二氧化碳的浓度。
2.根据第1项所述的方法,其中所述黄丝藻选自同形黄丝藻(Tribonemaaequale)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、小型黄丝藻(Tribonemaminus)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)和囊状黄丝藻(Tribonemautriculosum)中的一种或两种或更多种的组合。
3.根据第1项所述的方法,其中所述营养限制的培养基含0.15g/L~0.75g/L、0.75g/L~1.5g/L、1.5g/L~15g/L的硝酸钠。
4.根据第1项所述的方法,其中所述光照强度为50~1000μmol/m2/s的室内人工光照,或50~2000μmol/m2/s室外自然光照。
5.根据第1项所述的方法,其中所述二氧化碳浓度为1%~15%。
6.根据第1项所述的方法,其中培养装置是能够容纳黄丝藻以液态形式生长的开放式培养装置,或者封闭式培养装置,或者两者耦合的培养装置。
7.根据第1项所述的方法,其中培养装置是黄丝藻以生物膜形态附着生长的培养装置。
8.一种制备黄丝藻生物油的方法,所述方法包括:(1)用权利要求1的方法培养黄丝藻,获取黄丝藻生物质;(2)通过提取,或者压榨,或者提取与压榨相结合的方法加工步骤(1)中获取的黄丝藻生物质而制备生物油。
9.根据第8项所述的方法,其中所述黄丝藻选自同形黄丝藻(Tribonemaaequale)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、小型黄丝藻(Tribonemaminus)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)和囊状黄丝藻(Tribonemautriculosum)中的一种或两种或更多种的组合。
10.一种通过第8项的方法制备的生物油,其特征在于:该生物油来自黄丝藻生物质,生物油中包含40~90wt%的甘油三酯和10~60wt%的总极性脂。
11.根据第10项所述的生物油,其脂肪酸组成中十六碳脂肪酸的含量为65~85wt%,二十碳的多不饱和脂肪酸含量为6~15wt%。
12.由第10项的生物油制备的生物柴油或航空生物燃油。
13.由第10项的生物油制备的饲料、饵料、食品或者食品添加剂。
发明详述
本发明设计了可用于工业化生产的利用黄丝藻生产生物油的途径,包括高油脂含量黄丝藻生物质的生产,黄丝藻生物油的制备方法与生物油的用途。其具体实施方式包括详尽表征本发明生物油的油脂组分和脂肪酸组成;以及根据本发明生物油的化学成分而具备的用途;以及生产本发明生物油的方法。
在本发明的一些实施方式中,黄丝藻生物油是从单种黄丝藻生物质或者混合培养的多种黄丝藻生物质中得到。
所用术语“单种”是指培养物中仅含一种藻株,但还可能混杂细菌。所用术语“混合培养”是指培养物中含有两种或两种以上的藻株。
本发明中所述的黄丝藻是指归属于黄藻门异丝藻目黄丝藻属的20余种藻株,包括,但不限于,同形黄丝藻(Tribonema aequale)、近缘黄丝藻(Tribonema affine)、幽美黄丝藻(Tribonema elegans)、Tribonema gayanum、Tribonema mtermixtum、小型黄丝藻(Tribonema minus)、单一黄丝藻(Tribonema monochloron)、狭型黄丝藻(Triconema angustissimum)、蛋白核黄丝藻(Tribonemapyrenigerum)、整齐黄丝藻(Tribonema regulare)、硬壁黄丝藻(Tribonema siderophilum)、螺带黄丝藻(Tribonemaspirotaenia)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)、囊状黄丝藻(Tribonema utriculosum)、绿色黄丝藻(Tribonema viride)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、山田黄丝藻(Tribonema yamadanum)、丝状黄丝藻(Tribonema bombycinum)和带状黄丝藻(Tribonema vermichloris)。优选地,本发明所述的黄丝藻包括同形黄丝藻(Tribonema aequale)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、小型黄丝藻(Tribonema minus)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)和囊状黄丝藻Tribonema utriculosum。在本发明的一些实施方式中,黄丝藻生物油是从单种的同形黄丝藻(Tribonema aequale)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、小型黄丝藻(Tribonema minus)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)或者囊状黄丝藻(Tribonema utriculosum)中得到。
在本发明的一些实施方式中,黄丝藻生物油还可以从两种或更多种黄丝藻的混合培养所形成的生物质中得到,一些非限制性的实例包括:小型黄丝藻和普通黄丝藻的混合培养物、小型黄丝藻和同形黄丝藻的混合培养物、小型黄丝藻和同形黄丝藻和普通黄丝藻的混合培养物。
本发明的一些实施方式准确表征了黄丝藻生物油的油脂组成及脂肪酸组成的信息。在一些实施方式中,黄丝藻生物油中含有80%~90%的甘油三酯、少于5%的甘油二酯和10%~15%的总极性脂,其中甘油三酯含量高于大部分现有技术中的其他的藻类生物油。对于本行业的技术人员而言,高甘油三酯含量的特点对于黄丝藻生物油作为生物柴油的原料有明显优势。在本发明的一些实施方式中,黄丝藻生物油的脂肪酸组成主要为中链脂肪酸和长链多不饱和脂肪酸(PUFA),中链脂肪酸的含量为80%~90%,PUFA的含量为6%~15%。所用术语“中链脂肪酸”是指脂肪酸残基中碳数小于或等于16个碳原子,包括月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕榈酸(C16:0)、十六碳一烯酸(C16:1)和十六碳二烯酸(C16:2)等。本发明的黄丝藻生物油在油脂组成和脂肪酸组成上都具有明显的优点,能够产生比目前生物油产率更高、品质更优的生物柴油、航空燃油,因此更具成本竞争性和原料高质性。
本发明也涉及生产高油脂含量黄丝藻生物质的方法。其包含:选择黄丝藻藻株,在合适的培养装置中使用经过优化的可促进黄丝藻生长和积累油脂的条件下培养黄丝藻。在本发明的多个实施方式中,提供了从生产少量黄丝藻生物质和生物油样品到生产大量黄丝藻生物质和生物油的经济放大的方法,因此本发明的规模性和可持续性强。
在本发明的一些实施方式中,一种或几种黄丝藻属的藻株可以在一定的光反应器中和合适外部环境控制下,快速生长繁殖而提供生产本发明生物油的生物质。所用术语“反应器”是指能够容纳或支撑藻生长的装置,也称为“培养装置”。所用术语“合适外部环境”是指适宜黄丝藻生长的温度、光照、营养盐、二氧化碳和胞外的水环境等因素的综合。在一些实施方式中,黄丝藻在培养液中悬浮生长,使用的培养装置可以是密闭式光反应器(例如,柱式反应器、S管道式反应器、螺旋管道式反应器、平板式反应器)、开放式光反应器(例如,跑道式培养池)、或者是密闭式反应器和开放式反应器耦合的组合式光反应器,例如,通过循环泵将开放式跑道池中的藻液泵入平板式反应器中加强光照,藻液经溢出或管道循环进入跑道池(CN102382755A)。在一个实施例中,在直径5cm、容积为700mL的柱式光反应器中黄丝藻生物油的产率为20~30g/m2/day;另一个实施例中,在玻璃温室内2000L平板和跑道池组合式反应器中黄丝藻生物油的产率为16.7g/m2/day。在本发明的一些实施方式中,培养的黄丝藻在显微镜下镜检,可见细胞为近似柱形,宽约1~5微米,长8~20微米,植物体为单列不分枝的丝状体,丝状体长度一般为100~2000微米。因此黄丝藻尤其适于利用专利CN102373156A所描述的以生物膜的形态附着生长的培养方法。其培养装置包括,但不限于,半干固态贴壁培养装置(CN201210051158.2,CN201210051552.6,CN201210048910.8),或者利用半干固态贴壁培养原理的具体装置,例如,单层平面式附着(贴壁)反应器、或者多层平面以水平或垂直方式排列的阵列式反应器、或者转盘式反应器、或者转鼓式培养反应器。在一个实施例中,培养的小型黄丝藻丝状体长度为不大于3500微米,可以很好的附着在垂直悬挂的植绒布表面上以生物膜形态贴壁生长,在室外的自然光照下培养生产的黄丝藻生物油产率为25~50g/m2/day。
在本发明的一些实施方式中,使用光照强度为50~1000μmol/m2/s的室内人工光照,其中不高于500μmol/m2/s的光照由日光灯提供,500~1000μmol/m2/s的光照由疝灯或卤钨灯提供。在另一些实施方式中,使用自然光源(太阳),由于早晚日照差异或者遮挡程度区别而提供的光照强度为50~2000μmol/m2/s。
在本发明的一些实施方式中的培养温度为15℃~35℃。类似的,通入气体中二氧化碳的浓度为1%~15%,其中高浓度二氧化碳气体可以为火电厂废气或者发酵尾气。
本发明在种子培养中采用全BG11培养液,在扩大培养中采用经优化的营养限制的培养基。所述的全BG11培养液详细成分见表4,所述的营养限制的培养基含有磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、无机氮(例如硝酸钠、碳酸氢铵)、铁盐(例如柠檬酸铁铵、氯化铁)和微量元素混合液。其中柠檬酸浓度为0.006g/L以下、硫酸镁浓度为0.075g/L以下、氯化钙浓度0.036g/L以下、磷酸氢二钾浓度为0.04g/L以下;微量元素浓度为硼酸2.86mg/L、四水合氯化锰1.81mg/L、七水合硫酸锌0.22mg/L、二水合钼酸钠0.39mg/L、五水合硫酸铜0.08mg/L、六水合硝酸钴0.05mg/L。微量元素也可以用土壤浸出液替代。在本发明的一些实施方式中,使用硝酸钠作为氮源,培养基中硝酸钠的浓度范围为0.15g/L~15g/L;优选地,硝酸钠浓度范围为0.15g/L~1.5g/L;更优地,硝酸钠浓度为0.15g/L~0.75g/L。
在本发明的多个实施方式中,黄丝藻生物质中的脂溶性物质含量为15%~75%。所用术语“脂溶性物质”是指生物质中能够溶解于有机溶剂中的组分,包括甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、游离脂肪酸、糖脂、磷脂、脂溶性维生素和脂溶性色素等,可以用术语“油”或“油脂”代替。
根据本发明得到的黄丝藻生物质,经过本领域内已知的任何油脂加工技术加工得到黄丝藻生物油产品。在本发明的一些实施方式中,含水或干燥的黄丝藻生物质与有机溶剂在1∶1~1∶40(生物质干重∶溶剂体积)的比例下混合,在反应釜中在10~150℃下搅拌0.5~2小时后,分离藻渣和提取液,提取液经脱溶剂处理后得到黄丝藻生物油。在另一些实施方式中,黄丝藻生物质可以通过现有技术中的压榨方法而得到黄丝藻生物油。合适的有机溶剂例子包括短链醇(1~4碳醇)、烷烃(3~8碳),或者短链醇和烷烃的混合溶剂。根据本发明方法生产的黄丝藻生物油可以用于任何以油脂为原料的目的,包括但不限于生产生物柴油、航空燃油和饲料/饵料、食品或者食品添加剂的应用。
作为本发明的一项应用,一旦根据本发明生产得到生物油,可采用本领域已知的各种方法将生物油转化为脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯,即传统意义上的生物柴油。在专业领域中,以甘油三酯或游离脂肪酸等为主要成分的生物油原料和短链醇按照一定的比率混合,在催化剂作用下,在一定的温度、搅拌下,可以反应生成生物柴油产物。在本发明的一些实施方式中,以根据本发明生产的生物油为原料,加入的短链醇可以是甲醇、乙醇,或者甲醇与乙醇的混合物,产生的脂肪酸酯分别是脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯或两者的混合物。本发明可以使用本领域内已知的任何碱、酸和酶制剂为催化剂。合适的碱的例子包括:氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钾、甲醇钠、乙醇钾、乙醇钠。合适的酸的例子包括:硫酸、盐酸、固体酸催化剂等。在本发明的一些实施方式中,根据本发明生产的生物油原料中包含较多的游离脂肪酸,采用酸催化预酯化-碱催化转酯化的方式处理生物油而生产生物柴油。采用以本发明生产的生物油为原料制备生物柴油,是石化柴油的有效替代品。在本发明的一些实施方式中,生物柴油产品中包含约80%~90%的脂肪酸残基碳链长度小于16碳的脂肪酸酯,具有更高的十六烷值和更好的耐低温性能。在本发明的一些实施方式中,生物柴油产品燃烧热值为38~42MJ/Kg,燃烧热值可以与石化柴油媲美。
作为本发明的另一项应用,一旦根据本发明生产得到生物油,可采用本领域已知的多种方法将生物油直接转化生产航空燃油的主要成分;或者根据本发明的一项应用方法生产得到的生物柴油经进一步转化生产航空燃油。在根据本发明生产得到的生物油中,不饱和脂肪酸的含量达到55%~70%,其脂肪酸链中含有1~5个不饱和位点,提供了裂解形成烃的多个位点。可以经现有技术中加工工艺生产出2~8个碳的烃,供某些喷气式发动机使用。因此,根据本发明生产出的生物油可以通过本领域已知的裂解、催化加氢裂解等方式从不饱和位点裂解脂肪酸链而生成各种链长度的较短的烃。这些烃可作为航空燃油的添加物或主要成分。
根据本发明生产得到的生物油,其中含有3%~6%的二十碳五烯酸(EPA)、1.5%~3.5%的花生四烯酸(AA),和其他的长链多不饱和脂肪酸(PUFA)。在食品与药品领域广为周知,EPA具有调节血脂、抗凝血、抗血栓形成、扩张血管和降低血压等作用,是中老年人保持健康血脂指标的最佳选择;AA具有降低血粘度、增强血管弹性和酯化人体胆固醇的功能等生理活性,对预防心血管疾病、糖尿病和肿瘤等具有一定的功效。根据本发明生产的生物油因为其成分的特殊性,也可以作为添加剂或主要成分用于生产培养高价值鱼类等的饲料。因此根据本发明生产的生物油有良好的作为食品、保健品、饲料等的原料的用途。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中,本发明的上述特征和优点将更明显,其中:
图1:一种黄丝藻生物油的油脂组成(来自于小型黄丝藻,Tribonemaminus);
图2:一种黄丝藻生物油的油脂组成(来自于普通黄丝藻,Tribonemavulgare);
图3:典型的黄丝藻生物油的脂肪酸组成(气相色谱-质量检测器);
图4:在柱式光反应器中以标准BG11培养时黄丝藻生物量的产量;
图5:典型的用于生产黄丝藻生物油的黄丝藻细胞中油滴的显微照片,其中发黄色荧光的为油滴,其中图5.1为培养7天后未经尼罗红染色的细胞,图5.2为培养7天后经尼罗红染色的细胞,图5.3为培养14天后经尼罗红染色的细胞,图5.4为培养14天后经尼罗红染色的细胞;
图6:两种黄丝藻在柱式光反应器中的生物油产率;
图7:生产黄丝藻生物油的小型黄丝藻(Tribonema minus)在贴壁培养装置中的生长曲线和生物质产率;
图8:多种黄丝藻经优化培养后的油脂含量;
图9:利用黄丝藻生物油制备的生物柴油的气相色谱图。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明,但是本领域技术人员应该理解,本发明并不限于这些具体的实施例。
另外,除非另外指明,下述实施例中所用的试剂均为市售试剂,所用的方法均为本领域常规方法。
本发明所用的藻株,其中同形黄丝藻(Tribonema aequale)、小型黄丝藻(Tribonema minus)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)、囊状黄丝藻(Tribonema utriculosum)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)购买自德国SAG藻种保藏中心,编号分别为SAG No.880-1、SAG No.880-3、SAG No.21.94、SAG No.22.94、SAG No.24.94。其他藻株为采集自青岛郊区的池塘、沟渠等小型水体,利用BG11培养基(表4)进行培养分离获得12株黄藻门异丝藻目黄丝藻属藻株,根据植物体形态、细胞形态、色素体分布及数目等形态特征,鉴定为近缘黄丝藻(Tribonema affine)、幽美黄丝藻(Tribonemaelegans)、单一黄丝藻(Tribonema monochloron)、狭型黄丝藻(Triconemaangustissimum)、蛋白核黄丝藻(Tribonema pyrenigerum)、整齐黄丝藻(Tribonema regulare)、硬壁黄丝藻(Tribonema siderophilum)、螺带黄丝藻(Tribonema spirotaenia)、绿色黄丝藻(Tribonema viride)、山田黄丝藻(Tribonema yamadanum)、丝状黄丝藻(Tribonema bombycinum)和带状黄丝藻(Tribonema vermichloris),存放于中国科学院青岛生物能源与过程研究所能源藻类资源实验室,编号分别为EANo.907、EANo.908、EANo.909、EANo.910、EANo.911、EANo.912、EANo.913、EANo.914、EANo.915、EA No.916、EA No.917。上述藻株均为已记录野生种,普通技术人员可以商购或从自然水体中分离纯化获得,无需进行用于专利程序的生物材料保藏。
实施例1:黄丝藻生物油的成分确定
1.1黄丝藻生物油提取:
分别准确称取100mg同形黄丝藻(Tribonema aequale)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、小型黄丝藻(Tribonema minus)、拟丝黄丝藻(Tribonemaulotrichoides)、囊状黄丝藻(Tribonema utriculosum)生物质(冷冻干燥),分别添加至带有聚四氟乙烯密封盖的小瓶中,加入5ml甲醇/氯仿(体积比为2∶1)混合溶剂,在50℃下搅拌提取1小时;将混合物于3000转/分钟下离心5分钟,转移上清至另一干净的瓶中,残渣按照上述提取步骤重复两次;合并上清,加入5ml氯仿和9ml水,使比率为甲醇∶氯仿∶水为10∶10∶9。混合液经摇匀后静置分离,收集下层氯仿相,通入氮气以除去溶液中的溶剂,直至生物油的质量恒定。几种黄丝藻的生物油含量列于表1。
表1几种黄丝藻的生物油含量
黄丝藻种类 | 生物油含量(%dw) |
同形黄丝藻(Tribonema aequale) | 55.82±0.13 |
普通黄丝藻(Tribonema vulgare) | 56.20±1.07 |
小型黄丝藻(Tribonema minus) | 61.79±2.14 |
囊状黄丝藻(Tribonema utriculosum) | 46.83±0.22 |
拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides) | 52.85±1.09 |
1.2黄丝藻生物油组分表征:
将表1列出的黄丝藻生物油溶入定量的氯仿中以使其浓度为5~10mg/ml,向层析柱(Chromarod)表面上样1μL,依次经展溶剂1(苯∶氯仿∶无水乙酸=150∶60∶2,体积比)展开7cm;展溶剂2(苯∶己烷=1∶1,体积比)展开至10cm。完毕后取出层析柱,待溶剂挥发后,置于氢火焰检测器(TLC-FID,MK-6,Iatron Laboratories,Inc.Japan)中,在氢气流量160ml/min,空气流量0.2L/min条件下测定。甘油三酯(TAG)、甘油二酯(DAG)、甘油单酯(MAG)、固醇酯(Sterol ester,SE)、固醇(Free sterol,FS)是通过将其保留时间与标准品(Sigma,US)的保留时间相比较而确定,并将其峰面积与每种标准品的外标曲线相比而定量。几种黄丝藻生物油的组分列于表2。黄丝藻生物油的组成见图1(小型黄丝藻)和图2(普通黄丝藻)。各峰标注有各成分的名称。
表2几种黄丝藻生物油组成
实施例2:黄丝藻生物油中脂肪酸组成及含量测定
2.1黄丝藻生物油脂肪酸组成测定:
称取表1列出的黄丝藻生物油10mg于带有聚四氟乙烯密封盖的小瓶中(加入10μl含5mg/mlC19:0脂肪酸的氯仿溶液),加入2.5ml含5%硫酸的甲醇溶液,于85℃下反应2.5小时,冷却后加入1ml己烷萃取。取上清,在色谱条件为:毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm)。程序升温,起始温度为120℃,保持1min后,以6℃·min-1的升温速度升高至240℃,保持5min;汽化室温度为270℃,检测室温度为280℃。以N2为载气,流量为2mL·min-1;检测器温度为280℃,氢气为35mL·min-1,空气流量为350mL·min-1测定。各脂肪酸组成是通过将其保留时间与标准品(Sigma,US)的保留时间相比较而确定,并将其峰面积与每种标准品的外标曲线相比而定量。不同黄丝藻生物油的脂肪酸组成及含量列于表3。黄丝藻生物油的典型的脂肪酸组成见图3(小型黄丝藻),各峰标注有各成分的保留时间及名称。
表3黄丝藻生物油的脂肪酸组成及含量(质量百分数,wt%)
实施例3:黄丝藻生物油的实验室生产
以BG11培养液中培养至对数生长期的小型黄丝藻(Tribonema minus)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、同形黄丝藻(Tribonema aequale)为种子液,分别转接到柱式光反应器(容量为500ml)中,初始接种浓度为OD730=0.5;在光照强度50μmol/m2/s、温度20℃下,培养基为标准BG11(表4),持续通入含1%二氧化碳的空气培养14天。分别在培养周期中的第3、6、9、12、14天取样,测定生物量密度(普通黄丝藻和同形黄丝藻的生长曲线见图4),黄丝藻经尼罗红染色并经显微镜镜检。培养结束过滤收集生物量,利用冷冻干燥装置干燥细胞。收获的黄丝藻生物量2.25g,加入氯仿/甲醇的混合溶液(v∶v=1∶2)150ml,加入三口烧瓶中,在50℃下100rpm搅拌提取30分钟,得到提取生物油1.23g。其中甘油三酯含量为总生物油重量的75%,所得生物油的详细组分见表2。
生物量密度测定:使用直径为47mm、孔径为0.45μm的醋酸纤维膜滤纸,滤纸经预烘干至衡重,准确移取一定体积的藻液(根据藻液密度而定),真空抽滤,等体积甲酸铵溶液冲洗滤饼,转移滤纸及藻细胞置于105℃烘箱中烘干2小时以上,至恒重止,取出放置于干燥器中冷取至室温后称重。生物量密度表征单位为克/升(g/L)。
表4BG11培养液中营养盐组成和浓度
实施例4:黄丝藻生物油的实验室生产
将小型黄丝藻(Tribonema minus)种子液经过滤而附着在滤纸(可替换成滤布、琼脂、植绒布、无纺布、毛巾、海绵等透水或涵水材质)上,接种密度为10g/m2,滤纸置于玻璃板(仅为载体,可替换为有机聚合物板、石质板等),滤纸及玻璃板置于密封透明容器中,往容器中通入含2%二氧化碳的空气,并以氮限制的BG11培养液(硝酸钠浓度为0.75g/L)保持滤纸一直处于润湿状态,维持光照强度为100μmol/m2/s、温度25℃。培养7、14天后取出滤纸,刮取收获黄丝藻藻泥。收获的黄丝藻藻泥10g(含水率为67%~80%),加入40~60ml乙醇,在80℃下100rpm搅拌提取30分钟,过滤分离黄丝藻和提取液;黄丝藻经重复提取3次,结束后合并所有提取液,蒸馏除去溶剂后得到提取生物油1.5g,其中甘油三酯含量为总生物油重量的70%。
实施例5:黄丝藻生物油的中试生产
将在柱式光反应器培养中培养一周的小型黄丝藻(Tribonema minus)转接到平板式光反应器(总容量15L,培养容量为12L)中,初始接种浓度为0.13g/L。培养基为BG11,硝酸钠浓度为0.375g/L。使用微孔布气管往平板式反应器中持续通入含1%~2.5%浓度的空气,维持光照强度为200μmol/m2/s、温度为25~30℃。培养14天后收集藻液;将藻液经240目滤布自然过滤,裹在滤布中挤压滤饼,至不再有水流出时止。12L藻液共收获得藻泥100~150g(含水率为67%);取10g上述藻泥置于高压反应釜(容量100ml)的聚四氟乙烯内胆中,加入30ml乙醇、0.3ml浓硫酸,通入压缩氮气使反应釜内气压为1MPa,升高反应釜温度至90℃~100℃,在100rpm转速下搅拌提取60分钟。离心分离提取液与残渣;蒸馏除去提取液中的溶剂后得到生物油1.2g,其中甘油三酯含量为总生物油重量的约50%。
实施例6:黄丝藻生物油的大量生产
使用玻璃温室内的2000L跑道池-平板组合式培养装置培养小型黄丝藻(Tribonema minus),藻种液在50L柱式光反应器(直径20厘米)中培养至生长对数期,接种于2000L跑道池-平板组合式培养装置中,初始接种密度为0.13g/L。培养基为标准BG11。持续通入含1%~2.5%二氧化碳浓度的空气,或者通入烟道气(二氧化碳含量为15%),或者通入烟道气/空气的混合气;玻璃温室中的自然光强度为50μmol/m2/s(早晨)~2000μmol/m2/s(正午)、温度为15℃~35℃。培养15~30天(根据尼罗红染色-显微镜观察细胞中油滴积累情况而定)后收集藻液;收集的藻液经气浮装置预脱水、管式或三足离心机脱水后得藻泥(含水率约为67%)。将收获的黄丝藻藻泥100kg转移至500L高压反应釜中,加入150L工业乙醇,通入压缩氮气使反应釜内压强为0.2MPa,升高反应釜温度至75~80℃,持续搅拌提取2~4小时,静置分离提取液与残渣;使用溶剂泵从反应斧上取液口抽出并收集提取液,提取液中生物油含量为5.5g/L;使用真空减压浓缩装置回收乙醇得到生物油I700~825g。往反应釜的黄丝藻残渣中加入150L己烷,通入压缩氮气使反应釜内压强为0.2MPa,升高反应釜温度至55~60℃,持续搅拌提取2~4小时,静置分离提取液与残渣,收集提取液,使用真空浓缩装置回收己烷并得到生物油II6.6Kg。生产出的黄丝藻生物油经实施例1中的薄层层析-氢火焰检测方法测定其中的组成,结果列入表5。
表5生产的黄丝藻生物油的组成(含量单位:wt%)
HC&SE | TAG | DAG | PL | |
生物油I | 0 | 12.01 | 3.14 | 84.85 |
生物油II | 2.81 | 64.06 | 4.65 | 28.49 |
实施例7:黄丝藻生物油制备生物柴油
上述实施例5生产的黄丝藻生物油II,与甲醇混合后加热至65℃,加入适量氢氧化钠(10%的甲醇溶液)作为催化剂,在65℃下反应2小时;反应液静置分层,收集上层油相,经酸洗、水洗后得到生物柴油产品。生物柴油产品经气相色谱-质谱分析组成,结果列入表6。
表6黄丝藻生物油制备的生物柴油的组成
甲酯中的脂肪酸链 | 含量(%) |
C14:0 | 6.85 |
C16:0 | 28.35 |
C16:1 | 50.65 |
C16:2 | 0.67 |
C16:3 | 0.88 |
C18:0 | 1.02 |
C18:1 | 2.96 |
C18:2 | 0.71 |
C20:3 | 1.2 |
C20:4 | 3.02 |
C20:5 | 3.14 |
实施例8:黄丝藻生物油用于饲料/饵料、食品或者食品添加剂的应用
上述实施例7生产的不同批次黄丝藻生物油样品,经气相色谱检测其中的脂肪酸组成,结果列入表7。
表7大量生产的黄丝藻生物油的脂肪酸组成(含量单位:wt%)
黄丝藻生物油中的多不饱和脂肪酸,尤其是二十碳五烯酸(EPA)和花生四烯酸(AA)的含量较高,是良好的饲料/饵料、食品或者食品添加剂的成分。
上述内容描述了本发明的原理、不同规模下的实施方式和操作模式,这些具体形式应视为示例性而非限制性。
应该理解,尽管参考其示例性的实施方案,已经对本发明进行具体地显示和描述,但是本领域的普通技术人员应该理解,在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下,可以在其中进行各种形式和细节的变化,可以进行各种实施方案的任意组合。
Claims (13)
1.一种培养产油黄丝藻的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)选用黄丝藻属的藻株为藻种,在全BG11培养液中培养种子液;
(2)将步骤(1)得到的黄丝藻种子液和营养限制的培养基一起接种到扩大培养装置中,光照培养5天~25天;
(3)控制步骤(2)中的光照强度和通入二氧化碳的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述黄丝藻选自同形黄丝藻(Tribonema aequale)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、小型黄丝藻(Tribonema minus)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)和囊状黄丝藻(Tribonema utriculosum)中的一种或两种或更多种的组合。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述营养限制的培养基含0.15g/L~0.75g/L、0.75g/L~1.5g/L、1.5g/L~15g/L的硝酸钠。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述光照强度为50~1000μmol/m2/s的室内人工光照,或50~2000μmol/m2/s室外自然光照。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述二氧化碳浓度为1%~15%。
6.根据权利要求1所述的方法,其中培养装置是能够容纳黄丝藻以液态形式生长的开放式培养装置,或者封闭式培养装置,或者两者耦合的培养装置。
7.根据权利要求1所述的方法,其中培养装置是黄丝藻以生物膜形态附着生长的培养装置。
8.一种制备黄丝藻生物油的方法,所述方法包括:(1)用权利要求1的方法培养黄丝藻,获取黄丝藻生物质;(2)通过提取,或者压榨,或者提取与压榨相结合的方法加工步骤(1)中获取的黄丝藻生物质而制备生物油。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述黄丝藻选自同形黄丝藻(Tribonema aequale)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、小型黄丝藻(Tribonema minus)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)和囊状黄丝藻(Tribonema utriculosum)中的一种或两种或更多种的组合。
10.一种通过权利要求8的方法制备的生物油,其特征在于:该生物油来自黄丝藻生物质,生物油中包含40~90wt%的甘油三酯和10~60wt%的总极性脂。
11.根据权利要求10所述的生物油,其脂肪酸组成中十六碳脂肪酸的含量为65~85wt%,二十碳的多不饱和脂肪酸含量为6~15wt%。
12.由权利要求10的生物油制备的生物柴油或航空生物燃油。
13.由权利要求10的生物油制备的饲料、饵料、食品或者食品添加剂。
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