CN111269862A - 用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基及其发酵培养方法 - Google Patents
用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基及其发酵培养方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基及其发酵培养方法，其中发酵培养基的组分包括糊精、玉米淀粉酶解液、丁二酸、酵母粉、L‑天冬氨酸、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、氯化铁、硫酸锰、吡啶醇、氯化钴、三聚磷酸钠、H2O2和司盘‑60。与采用常规产铁载体培养基相比，采用本发明培养基进行培养，荧光假单胞菌的生物量可提高2~3倍，铁载体含量可提高3~5倍。由此可知，本发明提供的发酵培养基在保证荧光假单胞菌生物量的同时能够显著提高其铁载体产量，进而提高荧光假单胞菌的抑菌活性，为其在生物防治上的推广应用提供了技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术以及生物防治领域，具体的说是一种用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基及其发酵培养方法。
背景技术
植物病害是植物在生物或非生物因子影响下，发生一系列形态、生理和生化上的病理变化，阻碍了植物正常生长、发育进程，从而影响经济效益的现象。目前植物病害的防治主要依赖于化学农药，长期使用容易造成严重的环境污染及生态环境的破坏等一系列问题。生物防治指利用一些有益微生物，对土壤中特定的病原菌产生有害物质，通过产生抗生性次级代谢产物、竞争空间、食物等方式抑制病原菌对植物的侵害。作为植物病害综合防治中的一项重要防治手段，生物防治因其对环境友好的特点得到世界广泛认可。目前，成功应用于植物病害生物防治的微生物涉及真菌、细菌、放线菌等很多生物种群，各种生防微生物的应用，是保护生态环境，实现农业可持续发展的有力保证。
荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）属薄壁菌门假单胞菌科假单胞菌属，在自然界分布广泛，其中相当一部分是植物是植物根际促生菌（Plant Growth PromotingRhizobacteria，PGPR），能够利用根系分泌物中营养物质迅速定殖于植物根围，具有促进植物生长和防治病害的双重作用，因而可用于防治植物病害。研究表明，荧光假单胞菌对植物病害的防治机制包括以下几点：1）抗生素的抑制作用。荧光假单胞菌能产生多种抗生素如吡咯菌素、绿脓菌素、卵菌素A、1-羧基吩嗪、2,4- 二乙酰藤黄酚、藤黄绿脓菌素等，这些抗生素都有一定的特异性和专一性，能够有针对性地抑制不同的植物病害。2）铁载体介导下的抑制作用。3）根部定殖。荧光假单胞菌能在植物根系表面形成均匀的保护层，不能拮抗病原菌的菌株则不产生相应的保护层，因此荧光假单胞菌降低了根系生长期间的感染风险，保护了病原菌的侵染位点。4）产生许多其它具有抗性的次生代谢物，如氰化氢（HCN）、乙二酸、环形脂肽等。5）诱导系统抗性作用。6）溶菌作用。荧光假单胞菌能产生木聚糖酶、溶菌酶和胞外壳聚糖酶及能够分解真菌细胞壁的几丁质酶等。
铁元素不仅参与维持微生物细胞内多相体系的渗透平衡，还是微生物代谢过程中多种酶反应的必要成分，铁元素的缺乏能够限制微生物的生长。由于氧化作用，土壤中的铁大部分以Fe3+的形式存在，由于Fe3+的溶解度很低，所以在根系微环境下各类生物可直接吸收的可溶铁是很少的。铁载体，又名嗜铁素，是一类由微生物在低铁条件下合成的小相对分子质量的、能特异地螯合Fe3+的一种螯合因子。荧光性假单胞菌能分泌高亲和力的铁载体，在低铁环境下，铁载体可以螯合环境中微量的铁元素，通过特异的转运系统将铁转移到体内，不仅可以满足自身的生长需要，还可以使环境中的铁浓度降低，抑制病原微生物的生长繁殖，进而达到控制植物病害的目的。同时，铁载体铁离子络合物也可作为一种铁源被植物利用，促进植物的生长，这些特点使荧光假单胞菌在植物的生物防护中能够发挥重要作用。目前发现的荧光假单胞菌铁载体有假单胞菌素、绿脓菌螯铁蛋白、脓青素等。
虽然荧光假单胞菌在生物防治领域拥有巨大的发展前景，但在实际应用上仍有许多问题，例如缺乏荧光假单胞菌高效生防菌株，以及生防菌株抑菌代谢产物的发酵效价较低，影响了产业化发展的进程等。培养基的营养成分如碳源、氮源、无机盐和生长因子等是微生物生长与繁殖所必需的。除了需要适宜的营养条件外，pH 值、溶氧、温度、种龄与接种量等培养条件也至关重要。因此发酵培养基成分和发酵条件对荧光假单胞菌生长繁殖和抑菌代谢产物生物合成均有重要影响。为了进一步提高荧光假单胞菌生防菌株的抑菌活性，发明人在现有研究基础上，对荧光假单胞菌产铁载体的发酵培养基组分及发酵条件进行了优化实验，为其工业化生产和开发利用提供依据。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能够用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基，以及利用该培养基发酵培养荧光假单胞菌的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基，其特征在于，配方为：糊精13.0-18.0g/L，玉米淀粉酶解液6.0-10.0g/L，丁二酸2.7-3.5g/L，酵母粉2.5-3.5g/L，L-天冬氨酸1.4-2.0g/L，磷酸氢二钾3.0-4.0g/L，磷酸二氢钾1.2-2.0g/L，硫酸镁0.9-1.5g/L，氯化钠0.5-1.0g/L，氯化铁7-13μmol/L，吡啶醇0.8-1.2mg/L，氯化钴0.02-0.04mg/L，硫酸锰0.01-0.02mg/L，三聚磷酸钠36-44μmol/L，H2O2 10-14mmol/L，司盘-60 0.5-1.5g/L。
所述培养基的初始pH值为6.6-7.0。
所述配方中玉米淀粉酶解液的制备方法为：将玉米淀粉加水制成浓度为25%的浆液，先加入耐高温α-淀粉酶，在100℃、pH6.5的条件下反应10min后灭活酶；然后加入糖化酶，在55℃、pH 4.5的条件下糖化处理24h，离心取上清即为玉米淀粉酶解液。
包括如下步骤：
1）将荧光假单胞菌菌株在斜面培养基上活化24h，挑取单菌落接种于10mL种子培养基中，置于摇床上振荡培养24h制得一级种子液；
2）取5mL一级种子液接种于100mL种子培养基中，置于摇床上振荡培养10-15h制得二级种子液；
3）将二级种子液接种到装有权利要求1所述发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养，摇瓶装液量为35%-45%，发酵过程中温度控制在28-30℃，转速控制在180-220rpm，发酵时间为36-44h。
所述步骤1）中斜面培养基的配方为：蛋白胨16g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖5g/L，磷酸氢二钾0.75g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂15g/L，pH值为7.0。
所述步骤1）和2）中种子培养基的配方为：蛋白胨16g/L，酵母粉4g/L，甘油15ml/L，磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁2.0g/L，pH值为7.0。
所述步骤1）和2）中温度控制在26-30℃，转速控制在150-200rpm。
所述步骤3）中二级种子液的接种量为：1.5%-2.5%。
本技术方案的优点在于：
本发明对荧光假单胞菌产铁载体的发酵培养基配方及其发酵条件进行了研究改进，培养基中采用糊精、玉米淀粉酶解液和丁二酸作为复合碳源，酵母粉和L-天冬氨酸作为复合氮源，硫酸锰、氯化钴、吡啶醇、氯化铁、三聚磷酸钠、H2O2和司盘-60这些成分的添加有利于荧光假单胞菌的生长繁殖与铁载体的合成分泌。与采用常规产铁载体培养基相比，采用本发明培养基进行培养，荧光假单胞菌的生物量可提高2~3倍，铁载体产量可提高3~5倍。采用本发明方法制备的荧光假单胞菌发酵液对灰葡萄孢（番茄灰霉病菌）和尖孢镰刀菌苦瓜专化型（苦瓜枯萎病菌）有明显的抑制作用，抑菌率分别达到79.33%和60.68%。本发明为荧光假单胞菌在生物防治上进一步应用奠定了基础。
附图说明
图1为吡啶醇对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响；
图2为H2O2对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响；
图3为发酵温度对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响；
图4为发酵时间对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。
实施例1
1.1菌株 荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens，编号BNCC 231887，由北京北纳创联生物技术研究院提供。
1.2培养基
斜面培养基：蛋白胨16g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖5g/L，磷酸氢二钾0.75g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂15g/L，pH值为7.0。
种子培养基：蛋白胨16g/L，酵母粉4g/L，甘油15ml/L，磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁2.0g/L，pH值为7.0。
发酵培养基：糊精15.5g/L，玉米淀粉酶解液8.0g/L，丁二酸3.1g/L，酵母粉3.0g/L，L-天冬氨酸1.7g/L，磷酸氢二钾3.5g/L，磷酸二氢钾1.6g/L，硫酸镁1.2g/L，氯化钠0.75g/L，氯化铁10μmol/L，吡啶醇1.0mg/L，氯化钴0.03mg/L，硫酸锰0.015mg/L，三聚磷酸钠40μmol/L，H2O2 12mmol/L，司盘-60 1.0g/L，初始pH值为6.8；玉米淀粉酶解液的制备方法为：将玉米淀粉加水制成浓度为25%的浆液，先加入耐高温α-淀粉酶，在100℃、pH6.5的条件下反应10min后灭活酶；然后加入糖化酶，在55℃、pH 4.5的条件下糖化处理24h，离心取上清即为玉米淀粉酶解液。
1.3培养方法
1）将荧光假单胞菌菌株在斜面培养基上活化24h，挑取单菌落接种于10mL种子培养基中，置于摇床上振荡培养24h制得一级种子液；温度控制在28℃，转速控制在175rpm。
2）取5mL一级种子液接种于100mL种子培养基中，置于摇床上振荡培养12.5h制得二级种子液；温度控制在28℃，转速控制在175rpm。
3）以2.0%的接种量将二级种子液接种到装有发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养，摇瓶装液量为40%，发酵过程中温度控制在28℃，转速控制在200rpm，发酵时间为40h。
1.4生物量的测定 采用细胞干重法，培养一段时间后取发酵液在4℃、8000r/min条件下离心10min，收集菌体，在60℃烘箱中烘干至恒重，称量获得菌体的干重（以g/L表示）。
1.5铁载体含量的测定 取发酵液在4℃、8000r/min条件下离心10min，取上清液，用紫外分光光度计法在400nm处检测上清液的吸光度。吸光度越大，表明铁载体含量越高。
1.6发酵培养基及发酵条件的研究
1.6.1吡啶醇对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响
设置发酵培养基中吡啶醇的试验浓度为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L，以不添加吡啶醇的发酵培养基为对照，每个处理重复3次，考察吡啶醇浓度对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响。如图1所示，在试验范围内，荧光假单胞菌的生物量和铁载体含量随着吡啶醇浓度的增大呈先增加后下降的趋势，表明适当地添加吡啶醇对荧光假单胞菌的生长和铁载体的分泌具有明显的促进作用，过量添加对荧光假单胞菌的生长代谢具有一定的抑制作用。当吡啶醇的浓度为1.0mg/L时，荧光假单胞菌的生物量和铁载体含量达到最大值，因此确定吡啶醇的最佳浓度为1.0mg/L。
1.6.2 H2O2对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响
设置发酵培养基中H2O2的试验浓度为3mmol/L、6mmol/L、9mmol/L、12mmol/L、15mmol/L，以不添加H2O2的发酵培养基为对照，每个处理重复3次，考察H2O2浓度对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响。如图2所示，在 0~12mmol/L范围内，H2O2对荧光假单胞菌的生长和铁载体的分泌具有促进作用，尤其是铁载体含量随着H2O2浓度的增加而显著提高，H2O2浓度高于12mmol/L 时，生物量和铁载体含量迅速下降，可能是H2O2浓度过高，会杀伤或者杀死一定的荧光假单胞菌。因此确定吡啶醇的最佳浓度为12mmol/L。
1.3发酵温度对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响
将发酵温度设置为22、24、26、28、30、32℃，其他条件相同，确定发酵温度对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响。如图3所示，当发酵温度在26-30℃时，荧光假单胞菌的生物量和铁载体含量稳定，都处于较高的水平，其中在28℃时生物量和铁载体含量达到最大值，低于26℃或高于30℃时铁载体含量急剧降低，这与荧光假单胞菌生长的最适温度（26-30℃）基本吻合。因此，确定其最佳发酵温度为28℃。
1.4发酵时间对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响
在发酵培养过程中，分别在4h、8h、12h、16h、24h、32h、40h、48h、56h取样进行荧光假单胞菌生物量和铁载体含量测定，其他条件相同，确定发酵时间对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响。如图4所示，随着发酵时间的延长，荧光假单胞菌的生物量在32h达到最大，而后进入稳定期，生物量变化不显著；而铁载体含量在40h达到最高，随着发酵继续，铁载体含量逐渐降低。因此综合考虑以40h为最佳的发酵时间。
实施例2不同发酵培养基对荧光假单胞菌生长和产铁载体的影响
本发明发酵培养基：糊精15.5g/L，玉米淀粉酶解液8.0g/L，丁二酸3.1g/L，酵母粉3.0g/L，L-天冬氨酸1.7g/L，磷酸氢二钾3.5g/L，磷酸二氢钾1.6g/L，硫酸镁1.2g/L，氯化钠0.75g/L，氯化铁10μmol/L，吡啶醇1.0mg/L，氯化钴0.03mg/L，硫酸锰0.015mg/L，三聚磷酸钠40μmol/L，H2O2 12mmol/L，司盘-60 1.0g/L。
琥珀酸培养基：磷酸氢二钾6g/L，磷酸二氢钾3g/L，硫酸铵1g/L，硫酸镁0.2g/L，琥珀酸4g/L，氯化铁0.8mg/L（王伟等.荧光假单胞菌株SE-6产铁载体的发酵条件）。
MKB培养基：酪蛋白氨基酸5.0g/L，甘油15ml/L，硫酸镁2.5g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，氯化铁0.8mg/L（赵翔等. 高产铁载体荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens sp-f的筛选鉴定及其铁载体特性研究）。
蔗糖-天冬氨酸培养基：蔗糖20g/L，天冬氨酸2g/L，磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L（陈绍兴等.不同培养基对荧光假单胞菌产铁载体的影响）。
根据实施例1中的培养方法，分别采用以上几种发酵培养基对荧光假单胞菌进行发酵培养，并且将初始pH都调节为6.8，种子液接种量为2.0%，摇瓶装液量为40%，发酵过程中温度控制在28℃，转速控制在200rpm，发酵时间为40h。发酵结束后取样测定生物量和铁载体含量，结果如表1所示。
从表1可以看出，采用本发明培养基进行发酵培养，荧光假单胞菌生物量达到8.72g/L，铁载体含量达到266.4mg/L，显著高于采用常规培养基，说明本发明培养基不仅有利于荧光假单胞菌生长，还能促进荧光假单胞菌合成和分泌铁载体，提高铁载体的产量。本发明的发酵培养基采用糊精、玉米淀粉酶解液和丁二酸作为复合碳源，酵母粉和L-天冬氨酸作为复合氮源，还添加了硫酸锰、氯化钴、吡啶醇、氯化铁、三聚磷酸钠、H2O2和司盘-60这些成分，对荧光假单胞菌的生长繁殖与抑菌代谢产物的积累具有正向作用。
实施例3荧光假单胞菌发酵液对病原菌的抑制作用
病原菌：灰葡萄孢Botrytis cinerea（番茄灰霉病菌），菌株编号ACCC 30387，尖孢镰刀菌苦瓜专化型Fusarium oxysporum（苦瓜枯萎病菌），菌株编号ACCC 39200，由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供。
病原菌活化：将病原菌斜面菌种转接到PDA平板上，在28℃活化培养2-3d，在菌落边缘挑取菌丝块再转接到PDA平板上，在28℃培养至菌落长满培养皿。
发酵上清液的制备：将实施例2采用不同发酵培养基发酵培养所得的荧光假单胞菌发酵液在4℃、8000r/min条件下离心10min，取上清液。
在无菌条件下，吸取2.5mL发酵上清液于培养皿加入12.5mL的PDA 培养基混合均匀后制成平板。以无菌水代替发酵上清液为对照组，以采用不同发酵培养基所得发酵上清液为试验组，在平板中央接入病原菌菌丝块，在28℃培养5-7d，待对照培养皿中病原菌菌丝长满平皿时，根据十字交叉法测量各个培养皿中病原菌的菌落直径并计算抑菌率，每试验组及对照组均重复3次。
抑菌率 =（对照组菌饼扩展直径-试验组菌饼扩展直径）/对照组菌饼扩展直径。
从表2可以看出，不同发酵培养基所得发酵液对灰葡萄孢和尖孢镰刀菌苦瓜专化型均有一定的抑制作用，其中采用本发明培养基所得的发酵液抑菌率最高，分别为79.33%和60.68%，显著高于其它培养基。从实施例2可知，采用本发明培养基培养荧光假单胞菌，发酵上清液中铁载体含量最高，说明铁载体含量越高，对病原菌的抑制作用越强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基，其特征在于，配方为：糊精13.0-18.0g/L，玉米淀粉酶解液6.0-10.0g/L，丁二酸2.7-3.5g/L，酵母粉2.5-3.5g/L，L-天冬氨酸1.4-2.0g/L，磷酸氢二钾3.0-4.0g/L，磷酸二氢钾1.2-2.0g/L，硫酸镁0.9-1.5g/L，氯化钠0.5-1.0g/L，氯化铁7-13μmol/L，吡啶醇0.8-1.2mg/L，氯化钴0.02-0.04mg/L，硫酸锰0.01-0.02mg/L，三聚磷酸钠36-44μmol/L，H2O2 10-14mmol/L，司盘-60 0.5-1.5g/L。
2.根据权利要求1所述的用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基，其特征在于，所述培养基的初始pH值为6.6-7.0。
3.根据权利要求1所述的用于荧光假单胞菌高产铁载体的发酵培养基，其特征在于，所述配方中玉米淀粉酶解液的制备方法为：将玉米淀粉加水制成浓度为25%的浆液，先加入耐高温α-淀粉酶，在100℃、pH6.5的条件下反应10min后灭活酶；然后加入糖化酶，在55℃、pH4.5的条件下糖化处理24h，离心取上清即为玉米淀粉酶解液。
4.一种荧光假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将荧光假单胞菌菌株在斜面培养基上活化24h，挑取单菌落接种于10mL种子培养基中，置于摇床上振荡培养24h制得一级种子液；
2）取5mL一级种子液接种于100mL种子培养基中，置于摇床上振荡培养10-15h制得二级种子液；
3）将二级种子液接种到装有权利要求1所述发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养，摇瓶装液量为35%-45%，发酵过程中温度控制在28-30℃，转速控制在180-220rpm，发酵时间为36-44h。
5.根据权利要求4所述的一种荧光假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，所述步骤1）中斜面培养基的配方为：蛋白胨16g/L，酵母粉4g/L，葡萄糖5g/L，磷酸氢二钾0.75g/L，硫酸镁1.5g/L，琼脂15g/L，pH值为7.0。
6.根据权利要求4所述的一种荧光假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，所述步骤1）和2）中种子培养基的配方为：蛋白胨16g/L，酵母粉4g/L，甘油15ml/L，磷酸氢二钾1.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸镁2.0g/L，pH值为7.0。
7.根据权利要求4所述的一种荧光假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，所述步骤1）和2）中温度控制在26-30℃，转速控制在150-200rpm。
8.根据权利要求4所述的一种荧光假单胞菌的发酵培养方法，其特征在于，所述步骤3）中二级种子液的接种量为：1.5%-2.5%。
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