CN115353996A - 防御假单胞菌fd6发酵培养基及培养条件优化方法 - Google Patents
防御假单胞菌fd6发酵培养基及培养条件优化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115353996A CN115353996A CN202211030405.0A CN202211030405A CN115353996A CN 115353996 A CN115353996 A CN 115353996A CN 202211030405 A CN202211030405 A CN 202211030405A CN 115353996 A CN115353996 A CN 115353996A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- pseudomonas
- medium
- culture
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 122
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 122
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000005457 optimization Methods 0.000 title abstract description 19
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol group Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 72
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 67
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims abstract description 54
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 49
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 claims abstract description 48
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 34
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 34
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 31
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 18
- 230000007123 defense Effects 0.000 claims abstract description 17
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims abstract description 11
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 47
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 claims description 2
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 claims 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 18
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 9
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 6
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 6
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N hydrogen cyanide Chemical compound N#C LELOWRISYMNNSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- JPGWTZORMBTNMF-UHFFFAOYSA-N pyoluteorin Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1C(=O)C1=CC(Cl)=C(Cl)N1 JPGWTZORMBTNMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- PIFFQYJYNWXNGE-UHFFFAOYSA-N 2,4-diacetylphloroglucinol Chemical compound CC(=O)C1=C(O)C=C(O)C(C(C)=O)=C1O PIFFQYJYNWXNGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000541 Defensins Human genes 0.000 description 2
- 108010002069 Defensins Proteins 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N [C].[N] Chemical compound [C].[N] CKUAXEQHGKSLHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- WHBIEWRKFNSHNY-UHFFFAOYSA-N 1-nitropyrrolidine Chemical compound [O-][N+](=O)N1CCCC1 WHBIEWRKFNSHNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 239000005828 Pyrimethanil Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- ZLIBICFPKPWGIZ-UHFFFAOYSA-N pyrimethanil Chemical compound CC1=CC(C)=NC(NC=2C=CC=CC=2)=N1 ZLIBICFPKPWGIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000024053 secondary metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
- A01N63/27—Pseudomonas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
- A01P3/00—Fungicides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种防御假单胞菌FD6发酵培养基及培养条件优化方法，涉及细菌发酵技术领域，能够有效提高防御假单胞菌FD6无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑制率；该培养基含有碳源、氮源和无机盐；其中碳源为甘油、氮源为精氨酸、无机盐含有K2HPO4和MgSO4·7H2O；甘油添加量为5‰、精氨酸添加量为1.98‰、无机盐添加量为4‰；发酵的培养条件为：初始pH值为6.97、装液量为100 mL/L、转速为200 r/min、温度为24.12℃、发酵时间为60 h。本发明提供的技术方案适用于防御假单胞菌FD6的发酵过程。
Description
技术领域
本发明涉及一种防御假单胞菌FD6发酵培养基及培养条件优化方法，属于细菌发酵技术领域。
背景技术
灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病在番茄栽培种发生面积逐年增加，已经严重影响番茄的产量和品质(Sadfi-Zouaoui N,Hannachi I,Andurand D,etal.Biological control of Botrytis cinerea on stem wounds with moderatelyhalophilic bacteria[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology,2008,24(12):2871-2877.)。目前番茄灰霉病主要通过使用化学杀菌剂来控制，虽然化学药剂有效，但持续或重复使用会破坏天敌的生物防治，对各种杀菌剂普遍产生抗药性(刘圣明,张艳慧,高续恒,李梦,梅笑寒.洛阳市番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检测[J].中国农学通报,2014,30(22):300-303.)。假单胞菌产生的2,4-二乙酰间苯三酚 (2,4-DAPG)、藤黄绿脓菌素(pyoluteorin，PLT)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin，PRN)、氢氰酸 (hydrocyanic acid，HCN)、脂肽(lipopeptides)等次生代谢产物对植物病害都具有生物防治作用(Gross H,Loper JE.Genomics of secondary metabolite production by Pseudomonas spp.Natural product reports.2009Nov；26(11):1408-46.)。
目前，防假单胞菌FD6次生代谢产物的生产主要通过液体发酵培养基进行发酵。实验发现在不同的培养基和培养条件下防御假单胞菌FD6的无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑菌活性不同。为了对防御假单胞菌FD6次生代谢产物深入地研究利用，优化发酵培养基和培养条件十分重要。现阶段对防御假单胞菌发酵条件优化研究很少，对提高抑菌活性的研究几乎没有，这不能很好地满足防御假单胞菌次生代谢产物深入地研究利用。
因此，有必要研究出一种防御假单胞菌FD6发酵培养基及培养条件优化的方法来提高抑菌活性来应对现有技术的不足，以解决或减轻上述一个或多个问题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中所存在的问题，提供一种防御假单胞菌FD6发酵培养基及培养条件优化方法，显著增强了防御假单胞菌FD6的无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑菌活性。
本发明的目的是这样实现的：一种防御假单胞菌FD6发酵培养基，其特征在于，所述培养基含有碳源、氮源和无机盐；其中碳源为甘油，氮源为精氨酸，无机盐中含有K2HPO4和MgSO4·7H2O。
所述培养基中甘油、精氨酸、无机盐的量分别为：甘油添加量为培养基总质量的5‰，精氨酸添加量为培养基总质量的1.98‰，无机盐添加量为培养基总质量的4‰。
所述K2HPO4和MgSO4·7H2O质量比为1:1。
防御假单胞菌FD6发酵培养基对防御假单胞菌FD6进行发酵培养的方法，其特征在于，发酵培养条件为：初始pH值为5.5～8.0、装液量为100～500mL/L、转速为140～240r/min、温度为20～37℃、发酵时间为24～72h。发酵的具体步骤：挑取新鲜活化的FD6单菌落接种于LB试管培养液中，置于28℃摇床中180r/min过夜摇培种子液，至OD600＝0.8，向初始pH值为5.5～8.0的发酵培养基中添加1‰的种子液，置于温度为20～37℃、转速为140～240r/min摇床中摇培24～72h。
发酵培养条件为：初始pH值为6.97、装液量为100mL/L、转速为200r/min、温度为24.12℃、发酵时间为60h。
防御假单胞菌FD6发酵产生的无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑制率与培养基初始pH、精氨酸的添加量、培养温度的二次多项回归方程为:
Y＝-2026.469+509.56350X1+89.764X2+21.40456X3-7.86X1X2-0.77875X1X3+1.22875X2X3- 34.099X1 2-16.28225X2 2-0.38186X3 2；
其中，Y代表抑制率；X1代表培养基初始pH；X2代表精氨酸的添加量；X3代表培养温度。
各因子对抑制率影响的主次顺序为：X3>X2>X1。
按1:8的体积比，将防御假单胞菌FD6发酵所产生的无菌上清滤液加入PDA培养基中，对番茄灰霉病菌的平板抑制率理论最高值为95.9396％。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：对发酵培养基的碳氮源种类和添加量进行优化以及对培养条件进行优化，能够有效降低生产成本，缩短生产周期，提高生产效率，提高防御假单胞菌FD6无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑制率。
通过本发明，一方面经本发明优化防御假单胞菌FD6发酵培养基及培养条件，其无菌发酵上清滤液对番茄灰霉病菌的抑制率显著提高。番茄灰霉病最适发病期为始花至坐果期，一般第一、第二穗果发病率高。在番茄蘸花时，在配好的蘸花稀释液中加入一定浓度的防御假单胞菌FD6无菌发酵上清滤液，与化学农药交替使用，以期提高防效，延缓抗药性。另一方面发酵培养基及培养条件优化降低了生产成本，缩短了生产周期，对番茄灰霉病菌具有一定的抑制率，未来深度开发利用应用于农业生产上，会带来乐观的经济效益。
附图说明
图1为不同碳源对番茄灰霉病菌抑制率的影响；
图2为不同氮源对番茄灰霉病菌抑制率的影响；
图3为不同碳源添加量对番茄灰霉病菌抑制率的影响；
图4为不同氮源添加量对番茄灰霉病菌抑制率的影响；
图5为不同初始pH对番茄灰霉病菌抑制率的影响；
图6为不同培养温度对番茄灰霉病菌抑制率的影响；
图7为不同装液量对番茄灰霉病菌抑制率的影响；
图8为不同转速对番茄灰霉病菌抑制率的影响；
图9为不同培养时间对番茄灰霉病菌抑制率的影响；
图10为初始pH和精氨酸添加量对番茄灰霉病菌抑制率影响的响应面；
图11为初始pH和培养温度对番茄灰霉病菌抑制率影响的响应面；
图12为培养温度和精氨酸添加量对番茄灰霉病菌抑制率影响的响应面。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的目的、效果和技术方案，下面将联系附图结合实施案例对本发明进行详细的介绍。
1、本发明使用的实验材料为：
1)供试菌株：防御假单胞菌FD6(pseudomonas protegens FD6)由本实验室收藏保存；灰葡萄孢(Botrytis cinerea)由本实验室收藏保存。
2)培养基
细菌种子培养基：LB培养基
细菌发酵初始培养基：2‰K2HPO4、2‰MgSO4·7H2O。
真菌培养基：PDA培养基
实施例1防御假单胞菌FD6发酵培养基碳源筛选
在20m/50mL发酵初始培养基中分别加入5种实验室常用的碳源，即质量分数分别为 2％的葡萄糖、甘油、麦芽糖、蔗糖、乳糖，进行碳源的筛选，培养基其他组成成分为20mL的超纯水、2‰的K2HPO4、2‰的MgSO4·7H2O，在接种量为1‰、培养基初始pH为6.5、培养温度为28℃、摇床转速为180r/min的条件下振荡培养48h，每个处理设置3个重复。
48h后收集发酵液，9000rpm，离心10min，保留发酵上清液，使用0.22μm的水相滤头过滤发酵上清液；吸取3mL无菌上清滤液，加入到20mL的PDA培养基中，混匀倒平板；将活化的番茄灰霉菌种打菌饼(Φ＝6mm)，接种于不同的碳源培养基平板中央，于25℃条件下培养，待空白对照长满皿后，测量培养基中菌落直径并计算其抑制率，每个处理重复3次，结果如图1所示。
由图1可知，在这5种添加的碳源中，甘油作为碳源时，防御假单胞菌FD6无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑菌效果最强，抑制率最高为43.43％，所以选取甘油作最优碳源，进行后续发酵培养基优化。
实施例2防御假单胞菌FD6发酵培养基氮源筛选
在20mL/50mL发酵甘油培养基中分别加入7种实验室常用的氮源，即质量分数分别为2％的硫酸铵、尿素、谷氨酸、精氨酸、胰蛋白胨，蛋白胨、酵母粉，进行氮源的筛选，培养基其他组成成分为20mL的超纯水、2％的甘油、2‰的K2HPO4、2‰的MgSO4·7H2O，在接种量为1‰、培养基初始pH为6.5、培养温度为28℃、摇床转速为180r/min的条件下振荡培养48h，每个处理设置3个重复。
48h后收集发酵液，9000rpm，离心10min，保留发酵上清液，使用0.22μm的水相滤头过滤发酵上清液；吸取3mL无菌上清滤液，加入到20mL的PDA培养基中，混匀倒平板；将活化的番茄灰霉菌种打菌饼(Φ＝6mm)，接种于不同的氮源培养基平板中央，于25℃条件下培养，待空白对照长满皿后，测量培养基中菌落直径并计算其抑制率，每个处理重复 3次，结果如图2所示。
由图2可知，在这7种添加的氮源中，精氨酸作为氮源时，防御假单胞菌FD6无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑菌效果最强，抑制率最高为91.34％，所以选取精氨酸作最优碳氮源，进行后续发酵培养基优化。
实施例3防御假单胞菌FD6发酵培养基碳源量筛选
在20mL/50mL发酵培养基中分别加入5‰、1％、2％、3％、4％、5％的甘油，进行碳源量的筛选，培养基其他组成成分为20mL的超纯水、2％的精氨酸、2‰的K2HPO4、2‰的MgSO4·7H2O，在接种量为1‰、培养基初始pH为6.5、培养温度为28℃、摇床转速为 180r/min的条件下振荡培养48h，每个处理设置3个重复。
48h后收集发酵液，9000rpm，离心10min，保留发酵上清液，使用0.22μm的水相滤头过滤发酵上清液；吸取3mL无菌上清滤液，加入到20mL的PDA培养基中，混匀倒平板；将活化的番茄灰霉菌种打菌饼(Φ＝6mm)，接种于碳源不同量的培养基平板中央，于25℃条件下培养，待空白对照长满皿后，测量培养基中菌落直径并计算其抑制率，每个处理重复 3次，结果如图3所示。
由图3可知，在这6种添加量中，甘油添加量为5‰时，防御假单胞菌FD6无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑菌效果最强，抑制率最高为92.37％，所以选取5‰作为甘油最佳添加量，进行后续发酵培养基优化。
实施例4防御假单胞菌FD6发酵培养基氮源量筛选
在20mL/50mL发酵培养基中分别加入5‰、1％、2％、3％、4％、5％的精氨酸，进行氮源量的筛选，培养基其他组成成分为20mL的超纯水、5‰的甘油、2‰的K2HPO4、2‰的MgSO4·7H2O，在接种量为1‰、培养基初始pH为6.5、培养温度为28℃、摇床转速为 180r/min的条件下振荡培养48h，每个处理设置3个重复。
48h后收集发酵液，9000rpm，离心10min，保留发酵上清液，使用0.22μm的水相滤头过滤发酵上清液；吸取1.5mL无菌上清滤液，加入到20mL的PDA培养基中，混匀倒平板；将活化的番茄灰霉菌种打菌饼(Φ＝6mm)，接种于氮源不同量的培养基平板中央，于 25℃条件下培养，待空白对照长满皿后，测量培养基中菌落直径并计算其抑制率，每个处理重复3次，结果如图4所示。
由图4可知，在这6种添加量中，精氨酸添加量为2％时，防御假单胞菌FD6无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑菌效果最强，抑制率最高为50.28％，所以选取2％作为精氨酸最佳添加量，进行后续发酵培养基优化。
实施例5防御假单胞菌FD6发酵培养基初始pH筛选
在20mL/50mL发酵培养基中分别加入5‰的甘油、2％精氨酸、2‰的K2HPO4、2‰的MgSO4·7H2O，20mL的超纯水，设初始pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在接种量为1‰、培养温度为28℃、摇床转速为180r/min的条件下振荡培养48h，每个处理设置3个重复。
48h后收集发酵液，9000rpm，离心10min，保留发酵上清液，使用0.22μm的水相滤头过滤发酵上清液；吸取1.5mL无菌上清滤液，加入到20mL的PDA培养基中，混匀倒平板；将活化的番茄灰霉菌种打菌饼(Φ＝6mm)，接种于不同初始pH的培养基平板中央，于25℃条件下培养，待空白对照长满皿后，测量培养基中菌落直径并计算其抑制率，每个处理重复3次，结果如图5所示。
由图5可知，在这6种初始pH中，初始pH为7.0时，防御假单胞菌FD6无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑菌效果最强，抑制率最高为56.37％，所以选取7.0作为发酵培养基初始pH，进行后续发酵培养基优化。
实施例6防御假单胞菌FD6发酵温度筛选
在20mL/50mL发酵培养基中分别加入5‰的甘油、2％精氨酸、2‰的K2HPO4、2‰的MgSO4·7H2O，20mL的超纯水，设摇床温度为20℃、24℃、28℃、32℃、37℃，初始pH 为6.5，在接种量为1‰、摇床转速为180r/min的条件下振荡培养48h，每个处理设置3个重复。
48h后收集发酵液，9000rpm，离心10min，保留发酵上清液，使用0.22μm的水相滤头过滤发酵上清液；吸取1.5mL无菌上清滤液，加入到20mL的PDA培养基中，混匀倒平板；将活化的番茄灰霉菌种打菌饼(Φ＝6mm)，接种于不同发酵温度的培养基平板中央，于25℃条件下培养，待空白对照长满皿后，测量培养基中菌落直径并计算其抑制率，每个处理重复3次，结果如图6所示。
由图6可知，在这5种发酵温度中，发酵温度为24℃时，防御假单胞菌FD6无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑菌效果最强，抑制率最高为60.78％，所以选取24℃作为发酵温度，进行后续发酵培养基优化。
实施例7防御假单胞菌FD6发酵培养基装液量筛选
在发酵培养基中分别加入5‰的甘油、2％精氨酸、2‰的K2HPO4、2‰的MgSO4·7H2O，设装液量为100mL/L、200mL/L、300mL/L、400mL/L、500mL/L，初始pH为6.5，在接种量为1‰、摇床转速为180r/min的条件下振荡培养48h，每个处理设置3个重复。
48h后收集发酵液，9000rpm，离心10min，保留发酵上清液，使用0.22μm的水相滤头过滤发酵上清液；吸取1.5mL无菌上清滤液，加入到20mL的PDA培养基中，混匀倒平板；将活化的番茄灰霉菌种打菌饼(Φ＝6mm)，接种于不同装液量发酵的培养基平板中央，于25℃条件下培养，待空白对照长满皿后，测量培养基中菌落直径并计算其抑制率，每个处理重复3次，结果如图7所示。
由图7可知，在这5种装液量中，装液量为100mL/L时，防御假单胞菌FD6无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑菌效果最强，抑制率最高为63.54％，所以选取100mL/L作为摇瓶发酵温度，进行后续发酵培养基优化。
实施例8防御假单胞菌FD6发酵转速筛选
在20mL/50mL发酵培养基中分别加入5‰的甘油、2％精氨酸、2‰的K2HPO4、2‰的MgSO4·7H2O，加入20mL纯水，设转速为140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220 r/min、240r/min,初始pH为6.5，在接种量为1‰、的条件下振荡培养48h，每个处理设置 3个重复。
48h后收集发酵液，9000rpm，离心10min，保留发酵上清液，使用0.22μm的水相滤头过滤发酵上清液；吸取1.5mL无菌上清滤液，加入到20mL的PDA培养基中，混匀倒平板；将活化的番茄灰霉菌种打菌饼(Φ＝6mm)，接种于不同转速发酵的培养基平板中央，于25℃条件下培养，待空白对照长满皿后，测量培养基中菌落直径并计算其抑制率，每个处理重复3次，结果如图8所示。
由图8可知，在这6种转速中，转速为200r/min时，防御假单胞菌FD6无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑菌效果最强，抑制率最高为62.78％，所以选取200r/min作为摇瓶发酵温度，进行后续发酵培养基优化。
实施例9防御假单胞菌FD6发酵时间筛选
在20mL/50mL发酵培养基中分别加入5‰的甘油、2％精氨酸、2‰的K2HPO4、2‰的MgSO4·7H2O，加入20mL纯水，设发酵时间为24h、36h、48h、60h、72h,初始pH为6.5，在接种量为1‰、摇床转速为180r/min的条件下振荡培养，每个处理设置3个重复。
发酵结束后收集发酵液，9000rpm，离心10min，保留发酵上清液，使用0.22μm的水相滤头过滤发酵上清液；吸取1.5mL无菌上清滤液，加入到20mL的PDA培养基中，混匀倒平板；将活化的番茄灰霉菌种打菌饼(Φ＝6mm)，接种于不同发酵时间的培养基平板中央，于25℃条件下培养，待空白对照长满皿后，测量培养基中菌落直径并计算其抑制率，每个处理重复3次，结果如图9所示。
由图9可知，在这5种培养时间中，培养时间为60h时，防御假单胞菌FD6无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑菌效果最强，抑制率最高为58.18％，所以选取60h作为摇瓶发酵时间，进行后续发酵培养基优化。
实施例10响应面法优化防御假单胞菌FD6发酵培养基及培养条件
在单因素试验的基础上，以抑制率(Y)为响应值，以对抑制率影响显著的pH(X1)、精氨酸添加量(X2)和发酵温度(X3)为3因素，运用Design Expert 8.0.6.1软件设计3因素3水平的17个响应面(RSM)试验，其因素与水平依据中心组合试验(Box-Behnken， BBD)试验因素与水平见表1，试验结果与分析见表2。
表1 Box-Behnken试验因素与水平
表2 Box-Behnken试验结果与分析
以防御假单胞菌FD6发酵无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑制率(Y)为响应值，根据BBD设计的实验结果，利用Design Expert 8.0.6.1软件对表2数据进行分析，得到抑制率与培养基初始pH(X1)、精氨酸的添加量(X2)、培养温度(X3)的二次多项回归方程为 Y＝-2026.469+509.56350X1+89.764X2+21.40456X3-7.86X1X2-0.77875X1X3+1.22875X2X3-34.099X1 2-16.28225X2 2-0.38186X3 2。
对回归方程进行可信度分析和方差分析，结果表见表3
表3回归方程方差分析
对回归模型进行可信度分析和方差分析，结果如表3所示。由表3可知，模型F＝5.94， P＝0.0141，说明该回归方程是极显著的。失拟项不显著，说明该模型模拟性较好。模型的调整复相关系数R2 Adj＝0.7355，表明抑制率(Y)的变化有73.55％来源于培养基初始pH、精氨酸添加量、发酵初始温度，说明该模型具有较好的回归性。模型信噪比S/N＝6.708>4是令人满意的，表明该模型具有足够的信号响应设计。因此，该模型能够对抑制率(Y)进行分析。经方差分析，3个因素对防御假单胞菌FD6发酵无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑制率影响的主次顺序为X1>X2>X3，即培养基初始pH＞精氨酸添加量＞发酵初始温度。其中，二次项X1 2对结果影响显著(P＜0.05)，二次项X2 2对结果影响极显著(P＜0.01)。
根据回归方程绘制试验因素间交互效应三维立体响应曲面和等高线图，观察在一个因素不变的情况下，其他两个因素对抑制率的影响，其结果如图10-12所示，其中，精氨酸添加量和培养基初始pH的交互作用响应面为开口向下的凸形曲面，之间交互效应的等高线形状为圆形说明精氨酸添加量和培养基初始pH的交互作用较显著。在一定的发酵温度下，随着精氨酸添加量和发酵初始pH的增加，抑制率都呈现先增长再下降的趋势。回归方程求解得到添加5‰的甘油、1.98％的精氨酸、2‰的K2HPO4、2‰的MgSO4·7H2O，在初始pH为6.97、发酵温度为24.12℃、转速200r/min、装液量为100mL/L时，预测抑制率最高值为95.9396％。
根据模型求出的最优条件配制培养基及发酵条件，对模型进行3次以上试验验证，吸取 3mL的无菌上清滤液，加入到20mL的PDA培养基中，对番茄灰霉病菌的抑制率高达94.32％。与预测值相比无太大差异，验证了模型的可靠性。分析其原因可能是由于培养基在发酵过程中含氧量的不同而有所差异。
经优化后，防御假单胞菌FD6发酵最适培养基为5‰的甘油、1.98％的精氨酸、2‰的 K2HPO4、2‰的MgSO4·7H2O；最佳发酵条件为pH为6.97、发酵温度为24.12℃、转速200 r/min、装液量为100mL/L。培养60h后吸取3mL防御假单胞菌FD6无菌上清滤液加入20 mL的PDA培养基中，平板对峙结果表明，对番茄灰霉病菌的抑制率高达94.32％。优化后的培养基和发酵条件可有效提高防御假单胞菌FD6无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑制率，降低了发酵成本，为防御假单胞菌FD6的生产应用提供依据。
Claims (8)
1.一种防御假单胞菌FD6发酵培养基，其特征在于，所述培养基含有碳源、氮源和无机盐；其中碳源为甘油，氮源为精氨酸，无机盐中含有K2HPO4和MgSO4·7H2O。
2.根据权利要求1所述的一种防御假单胞菌FD6发酵培养基，其特征在于，所述培养基中甘油、精氨酸、无机盐的量分别为：甘油添加量为培养基总质量的5‰，精氨酸添加量为培养基总质量的1.98‰，无机盐添加量为培养基总质量的4‰。
3.根据权利要求1所述的一种防御假单胞菌FD6发酵培养基，其特征在于，所述K2HPO4和MgSO4·7H2O质量比为1:1。
4.使用权利要求1-3中任意一项权利要求所述的防御假单胞菌FD6发酵培养基对防御假单胞菌FD6进行发酵培养的方法，其特征在于，发酵培养条件为：初始pH值为5.5~8.0、装液量为100~500 mL/L、转速为140~240 r/min、温度为20~37℃、发酵时间为24~72 h；发酵的具体步骤：挑取新鲜活化的FD6单菌落接种于LB试管培养液中，置于28℃摇床中180 r/min过夜摇培种子液，至OD600=0.8，向初始pH值为5.5~8.0的发酵培养基中添加1‰的种子液，置于温度为20~37℃、转速为140~240 r/min摇床中摇培24~72 h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵培养条件为：初始pH值为6.97、装液量为100 mL/L、转速为200 r/min、温度为24.12℃、发酵时间为60 h。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，防御假单胞菌FD6发酵产生的无菌上清滤液对番茄灰霉病菌的抑制率与培养基初始pH、精氨酸的添加量、培养温度的二次多项回归方程为:
Y=-2026.469+509.56350X1+89.764X2+21.40456X3-7.86X1X2-0.77875X1X3+1.22875X2X3-34.099X1 2-16.28225X2 2-0.38186X3 2;
其中，Y代表抑制率；X1代表培养基初始pH；X2代表精氨酸的添加量；X3代表培养温度。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，各因子对抑制率影响的主次顺序为：X3>X2>X1。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，按1:8的体积比，将防御假单胞菌FD6发酵所产生的无菌上清滤液加入PDA培养基中，对番茄灰霉病菌的平板抑制率理论最高值为95.9396%。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211030405.0A CN115353996A (zh) | 2022-08-26 | 2022-08-26 | 防御假单胞菌fd6发酵培养基及培养条件优化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211030405.0A CN115353996A (zh) | 2022-08-26 | 2022-08-26 | 防御假单胞菌fd6发酵培养基及培养条件优化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115353996A true CN115353996A (zh) | 2022-11-18 |
Family
ID=84004496
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211030405.0A Pending CN115353996A (zh) | 2022-08-26 | 2022-08-26 | 防御假单胞菌fd6发酵培养基及培养条件优化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115353996A (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103131652A (zh) * | 2013-02-16 | 2013-06-05 | 哈尔滨工业大学华龙科技发展有限公司 | 大豆根瘤菌培养基以及采用其制备大豆液体根瘤菌剂的方法 |
| WO2019041015A1 (pt) * | 2017-09-01 | 2019-03-07 | União Brasiliense De Educação E Cultura - Ubec | Meio de cultura mmp para produção de lipopeptídeos antimicrobianos a partir do cultivo de bactérias, processo para produção de lipopeptídeos antimicrobianos e uso do mesmo |
-
2022
- 2022-08-26 CN CN202211030405.0A patent/CN115353996A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103131652A (zh) * | 2013-02-16 | 2013-06-05 | 哈尔滨工业大学华龙科技发展有限公司 | 大豆根瘤菌培养基以及采用其制备大豆液体根瘤菌剂的方法 |
| WO2019041015A1 (pt) * | 2017-09-01 | 2019-03-07 | União Brasiliense De Educação E Cultura - Ubec | Meio de cultura mmp para produção de lipopeptídeos antimicrobianos a partir do cultivo de bactérias, processo para produção de lipopeptídeos antimicrobianos e uso do mesmo |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 肖琦: "荧光假单胞菌FD6抗生素合成调控基因的克隆及功能分析", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑, no. 06, pages 18 * |
| 贾祥子: "Pseudomonas protegens FD6次生代谢物合成基因簇分析及抗菌肽的初步鉴定及抑菌活性", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑, no. 09, pages 24 - 25 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104762238B (zh) | 一种不产氨基酸脱羧酶高产脲酶的乳酸菌及其应用 | |
| CN114107077B (zh) | 一株产酯酵母菌株及其应用 | |
| CN103451133B (zh) | 一种环状芽孢杆菌及其在制备阿魏酸脱羧酶中的应用 | |
| CN110468083B (zh) | 一株分离的链霉菌dl70及其生防促生应用 | |
| CN110791462B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其在发酵生产腺苷中的应用 | |
| CN106434369A (zh) | 一株产l‑苹果酸的米曲霉及其应用 | |
| CN102864113A (zh) | 产丁二酸的菌株及其生产丁二酸的方法和应用 | |
| CN104277989B (zh) | 一株面包酵母及其在发酵生产辅酶i中的应用 | |
| CN117701471A (zh) | 一株用于制备生物杏香料的蜡样芽孢杆菌及其应用 | |
| CN105274009A (zh) | 一种防治植物终极腐霉病害的木霉菌株及制剂 | |
| CN110699290B (zh) | 一种稳定伯克霍尔德氏菌、菌剂及其制备方法和应用 | |
| CN102146348A (zh) | 一株产高丝氨酸内酯的乙酸钙不动杆菌及其应用 | |
| CN111321082A (zh) | 一种窖泥微生物分离方法 | |
| CN105802874B (zh) | 一种高效降解阿特拉津的混合菌及发酵培养方法 | |
| CN115353996A (zh) | 防御假单胞菌fd6发酵培养基及培养条件优化方法 | |
| CN109825454A (zh) | 一株硝酸盐还原菌、培养方法及应用 | |
| CN113604390B (zh) | 一株谷氨酸棒杆菌及其在发酵生产l-鸟氨酸中的应用 | |
| CN107641602A (zh) | 一株产朊假丝酵母及其在发酵产蛋白中的应用 | |
| CN108587923B (zh) | 一种改善苹果酸发酵性能的方法 | |
| CN112136601A (zh) | 一种鸡腿菇菌丝的培养基及其应用 | |
| CN107164282B (zh) | 一种生产5‑羟色氨酸的方法 | |
| CN110999722A (zh) | 一种超短裙竹荪的培养基及其培养方法 | |
| CN110272931A (zh) | 一种促进抗菌多肽短杆菌肽合成的培养基及其培养方法 | |
| CN105602854B (zh) | 一株淡紫拟青霉菌及其在普洱茶生产中的应用 | |
| CN114410542B (zh) | 一株天蓝色弧菌及其在降解浒苔中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |