CN111321082A - 一种窖泥微生物分离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物分离技术领域，公开了一种窖泥微生物分离方法，包括步骤①：以五点采样法采集窖泥；步骤②：称取10g窖泥样品，制备成窖泥悬浮液；步骤③：将窖泥悬浮液经过水浴后，接种于富集培养基中，将富集培养液采用梯度稀释涂布于分离培养基中，接种后的分离培养基置于厌氧罐内，分离培养，对各种不同特征的菌落进行平板划线纯化，获得单菌落；步骤④：将获得的单菌落划线分离，将分离的菌株进行己酸菌鉴定。采用酒糟浸液作为培养基可模拟微生物原生生长环境，使窖泥中的微生物能迅速适应新环境，缩短了微生物的活化时间，可提高微生物分离效率。

Description

一种窖泥微生物分离方法
技术领域
本发明属于微生物分离技术领域，特别涉及一种窖泥微生物分离方法。
背景技术
生产浓香型酒，窖泥是基础，大曲是动力，工艺是关键。做浓香型优质酒，首先要抓好窖泥质量。窖泥的好坏直接决定着酒质的优劣。因为窖泥是己酸菌、甲烷菌、丁酸菌等各种有益物的载体和栖息场所，也是它的繁衍温床，这些有益微生物的种类和数量的多少是衡量窖泥质量的一个标准。浓香型大曲酒的主体香味物质是己酸乙酯，而己酸乙酯是由窖泥中梭状芽孢杆菌(己酸菌)等各种生香产酯微生物的代谢产物，所以没有好的窖泥，就不能生产上乘的浓香型优质酒，“百年老窖”出好酒也就是这个道理。
用于窖泥养护的最重要产品是己酸菌以及可以产生丰富白酒风味物质的生香酵母产品，从窖泥中分离出这些微生物就可人工快速制作出新窖泥。目前通常采用80℃水浴加热的方法将对窖泥样品进行预处理，因为己酸菌的孢子具有耐热性，而其营养细胞是不耐热的，通过加热可以淘汰较弱的芽孢，并同时杀灭营养细胞和其他杂菌，但是窖泥中微生物种类繁多，耐热的孢子种类也较多，只采用水浴加热的方法筛选己酸菌难以将其他杂菌筛除干净，导致菌种的分离纯化过程需要对许多样品进行分离鉴定，操作繁琐，效率较低。
发明内容
本发明的目的是提供一种窖泥微生物分离方法，具有操作简单，菌种分离效率高，分离得到的己酸菌纯度高、活性高的效果。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
步骤①：以五点采样法采集窖池内的窖泥，将采集到的窖泥迅速放入厌氧袋中，置于冰上运输至实验室；
步骤②：称取窖泥样品，加入盛有无菌水及玻璃珠的三角瓶中，在回旋式振荡机中震荡，得到窖泥悬浮液；
步骤③：将窖泥悬浮液经过水浴加热杀死营养体细胞，接种于富集培养基中，富集培养，将富集培养液采用梯度稀释涂布于分离培养基中，接种后的分离培养基置于厌氧罐内，分离培养，对各种不同特征的菌落进行平板划线纯化，获得单菌落；
步骤④：将获得的单菌落划线分离纯化2～3次，斜面保存，将分离的菌株进行己酸菌鉴定，获得己酸菌。
本发明的进一步设置为：步骤③中所述富集培养基为酒糟浸液培养基，所含组分按质量份计为：酒糟浸液1000份，黄土50～150份，酵母膏10～15份，NaAc3～5份，乙醇10～20份，MgSO4·7H2O 0.1～0.3份，CaCO35～10份，聚谷氨酸10～30份、蔗糖酯5～15份。
本发明的进一步设置为：所述酒糟浸液制备方法为：所述酒糟浸液制备方法为：取发酵车间窖底酒糟，用纯净水浸泡1～2h，然后用双层纱布过滤得到酒糟浸液。
本发明的进一步设置为：所述步骤③所述分离培养基所含组分按质量份计为：所述步骤③所述分离培养基所含组分按质量份计为：水1000份，酵母膏2～4份，牛肉膏5～15份，蛋白胨5～15份，琼脂15～20份，可溶性淀粉1～3份，葡萄糖5份，半胱氨酸盐酸盐0.5份，NaCl1～5份，姜黄素2～6份，乙酸铜3～9份。
本发明的进一步设置为：所述步骤③中，挑选产气早、气泡多的富集培养基，将所述富集培养基经过水浴加热处理后，经过梯度稀释涂布于分离培养基中。
本发明的进一步设置为：所述步骤④中鉴定试验过程为：取己酸菌株液于试管中，加硫酸铜溶液，乙醚，振荡，静置使之反应分层，观察乙醚层呈现颜色，如呈现绿色，颜色越深，己酸产量越高，选择己酸产量高的菌株。
本发明的进一步设置为：对所述乙酸含量高的菌株进行扩大培养后应用于人工窖泥的制作。
本发明的有益效果是：
1.采用酒糟浸液作为培养基可模拟微生物原生生长环境，使窖泥中的微生物能迅速适应新环境，缩短了微生物的活化时间，可使微生物在较短的时间内达到生长期，从而使微生物较快的富集，可提高微生物分离效率；
2.在富集培养基中添加聚谷氨酸经微生物分解后产生的谷氨酸是微生物生长所必须的氨基酸，可加快微生物增殖速率，同时聚谷氨酸还可使富集培养基形成稳定的悬浊液，使黄土均匀分散在培养基中，微生物附着在黄土颗粒表面进行生长，避免了微生物聚集在一处争夺营养，可提高微生物增殖速率，蔗糖酯的加入可防止菌丝结球，避免多种微生物粘连，富集完成后的培养基中微生物分布均匀，微生物之间较为分散，在聚谷氨酸和蔗糖酯的协同作用下，富集培养基内能形成浓度较高且分散性较好的菌种，便于后续的菌种分离；
3.分离培养基添加有半胱氨酸盐酸盐，有利于己酸菌的增殖，使己酸菌容易形成较好的菌落，提高了分离己酸菌的成功率，使窖泥中的多种己酸菌都能被筛选出来，分离培养基内还添加有姜黄素和乙酸铜，对大肠杆菌、绿脓杆菌等细菌起到抑制作用，避免杂菌对己酸菌产生干扰，有利于提高己酸菌分离效率。
具体实施方式
下面将对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
步骤①：以五点采样法采集湖北省古襄阳酒厂窖池内的窖泥，将采集到的窖泥迅速放入厌氧袋中，置于冰上运输至实验室；
步骤②：称取10g窖泥样品，加入盛有无菌水及玻璃珠的三角瓶中，在回旋式振荡机中震荡，得到窖泥悬浮液；
步骤③：将窖泥悬浮液经过80℃水浴10min加热杀死营养体细胞，接种于富集培养基中，所述富集培养基为酒糟浸液培养基，所含组分按质量份计为：酒糟浸液1000份，黄土50份，酵母膏10份，NaAc5份，乙醇10份，MgSO4·7H2O 0.3份，CaCO35份，聚谷氨酸10份、蔗糖酯5份，37℃富集培养6d，挑选产气早、气泡多的富集培养基，将所述富集培养基经过水浴加热处理后，采用梯度稀释涂布于分离培养基中，分离培养基所含组分按质量份计为：水1000份，酵母膏2份，牛肉膏15份，蛋白胨5份，琼脂20份，可溶性淀粉1份，葡萄糖6份，半胱氨酸盐酸盐0.3份，姜黄素2份，NaCl 5份，乙酸铜3份，接种后的分离培养基置于厌氧罐内，37℃培养3d，对各种不同特征的菌落进行平板划线纯化，获得单菌落；
步骤④：将获得的单菌落划线分离纯化2～3次，斜面保存，将分离的菌株进行己酸菌鉴定，鉴定试验过程为：取己酸菌株液5mL于试管中，加2％硫酸铜溶液5mL，乙醚2mL，振荡，静置10min使之反应分层，观察乙醚层呈现颜色，如呈现绿色，颜色越深，己酸产量越高，选择己酸产量高的菌株。
酒糟浸液制备方法为：取发酵车间窖底酒糟，用85℃的纯净水以1/4的料液比浸泡1h，然后用双层纱布过滤得到酒糟浸液。
乙酸含量高的菌株进行扩大培养后应用于人工窖泥的制作。
实施例2
实施例2与实施例1不同之处在于：
酒糟浸液培养基，所含组分按质量份计为：酒糟浸液1000份，黄土150份，酵母膏10份，NaAc3份，乙醇20份，MgSO4·7H2O 0.1份，CaCO35份，聚谷氨酸20份、蔗糖酯10份，37℃富集培养4d。
实施例3
实施例3与实施例1不同之处在于：
酒糟浸液培养基，所含组分按质量份计为：酒糟浸液1000份，黄土50份，酵母膏10份，NaAc5份，乙醇10份，MgSO4·7H2O 0.3份，CaCO35份，聚谷氨酸30份、蔗糖酯15份，37℃富集培养4d。
实施例4
实施例4与实施例3不同之处在于：
酒糟浸液培养基，所含组分按质量份计为：酒糟浸液1000份，黄土50份，酵母膏10份，NaAc5份，乙醇10份，MgSO4·7H2O 0.3份，CaCO3 5份，聚谷氨酸30份，37℃富集培养6d。
实施例5
实施例5与实施例3不同之处在于：酒糟浸液培养基，所含组分按质量份计为：酒糟浸液1000份，黄土50份，酵母膏10份，NaAc5份，乙醇10份，MgSO4·7H2O 0.3份，CaCO3 5份，37℃富集培养6d。
实施例6
实施例6与实施例3不同之处在于：分离培养基为所含组分按质量份计为：水1000份，酵母膏3份，牛肉膏10份，蛋白胨10份，琼脂20份，可溶性淀粉1份，葡萄糖5份，半胱氨酸盐酸盐0.5份，姜黄素4份，NaCl 3份，乙酸铜6份。
实施例7
实施例7与实施例3不同之处在于：分离培养基所含组分按质量份计为：水1000份，酵母膏4份，牛肉膏15份，蛋白胨5份，琼脂15份，可溶性淀粉3份，葡萄糖4份，半胱氨酸盐酸盐0.6份，NaCl 1份，姜黄素6份，乙酸铜9份。
实施例8
实施例8与实施例6不同之处在于：分离培养基所含组分按质量份计为：水1000份，酵母膏3份，牛肉膏10份，蛋白胨10份，琼脂20份，可溶性淀粉1份，葡萄糖5份，半胱氨酸盐酸盐0.5份，NaCl 3份，姜黄素4份。
实施例9
实施例9与实施例6不同之处在于：分离培养基所含组分按质量份计为：水1000份，酵母膏3份，牛肉膏10份，蛋白胨10份，琼脂20份，可溶性淀粉1份，葡萄糖5份，半胱氨酸盐酸盐0.5份，NaCl 3份。
对比例
对比例与实施例1的不同之处在于：富集培养基为所含组分按质量份计为：去离子水1000份，蛋白胨10，牛肉膏10份，酵母膏3份，葡萄糖5份，可溶性淀粉1份，氯化钠5份，醋酸钠3份，半胱氨酸盐酸盐0.5份。
试验部分
取实施例1-9和对比例中经过富集培养后的培养基作为试验样品一，观察富集培养基中开始产气即培养基中出现小气泡的时间，采用稀释平板计数法测定样品一中的微生物浓度；取实施例1-9和对比例中分离培养基中的菌落作为试验样品二，采用稀释平板计数法从菌落数量、形态类别、己酸菌占比(己酸菌菌落数/总菌落数)效果等指标，用于判断菌落分离效果，分离培养基采用的菌悬液稀释梯度为10-1，每皿涂布量为100μL置于密封培养罐中进行培养及计数，每处理10皿除去污染物后随机选取3皿统计单菌落平均数。
试验结果
表1富集培养基中微生物浓度
项目 菌体数量(cfu/g)
实施例1 226×10<sup>4</sup>
实施例2 268×10<sup>4</sup>
实施例3 326×10<sup>4</sup>
实施例4 273×10<sup>4</sup>
实施例5 205×10<sup>4</sup>
实施例6 311×10<sup>4</sup>
实施例7 320×10<sup>4</sup>
实施例8 317×10<sup>4</sup>
实施例9 302×10<sup>4</sup>
对比例 179×10<sup>4</sup>
表2菌种分离培养效果
Figure BDA0002420383720000051
Figure BDA0002420383720000061
实施例1～3为富集培养基不同含量的聚谷氨酸、蔗糖酯试验数据，从表1和表2中可以看出，在实施例3条件下富集培养基得到的微生物浓度更高，分离培养基的分离效果更好；实施例4～5与实施例3的不同之处在于酒糟浸液培养基中是否添加聚谷氨酸和蔗糖酯，从表1中可以看出，实施例3中微生物浓度远高于实施例4～5，实施例5中微生物浓度最低，说明聚谷氨酸和蔗糖酯的添加有利于微生物增殖；从表2中可以看出，实施例4～5中在菌种分离时每平板菌种种类高于实施例3，但己酸菌占比低于实施例3，说明蔗糖酯的加入可防止菌丝结球，避免多种微生物粘连，富集完成后的培养基中微生物分布均匀，微生物之间较为分散，有利于后续的菌种分离。
实施例6～7与实施例3的不同之处在于姜黄素和乙酸铜的添加量不同，从表2中可以看出，实施例7中的己酸菌占比最高，但是总菌落数和菌种类别较低，说明实施例7中姜黄素和乙酸铜添加量过高，抑制了部分己酸菌的活性，实施例6中菌种类别和己酸占比均较高，说明添加4份姜黄素，6份乙酸铜能达到最好的己酸菌分离效果；实施例8～9与实施例6的不同之处在于是否添加姜黄素和乙酸铜，从表2中可以看出，实施例8～9的己酸菌占比均较低，分离培养基中添加姜黄素和乙酸铜对大肠杆菌、绿脓杆菌等细菌起到抑制作用，可避免杂菌对己酸菌产生干扰，有利于提高己酸菌分离效率。
对比例中富集培养基采用RCM液体培养基，没有采用酒糟浸液培养基，从表1和表2中可以看出，富集培养后对比例中微生物浓度较低，在后续的分离过程中己酸菌占比较低，说明采用酒糟浸液培养基有利于己酸菌的富集，可激发窖泥中各种己酸菌的活性，可增加己酸菌分离的种类，提高己酸菌分离效率。

Claims (7)

1.一种窖泥微生物分离方法，其特征在于：
步骤①：以五点采样法采集窖池内的窖泥，将采集到的窖泥迅速放入厌氧袋中，置于冰上运输至实验室；
步骤②：称取窖泥样品，加入盛有无菌水及玻璃珠的三角瓶中，在回旋式振荡机中震荡，得到窖泥悬浮液；
步骤③：将窖泥悬浮液经过水浴加热杀死营养体细胞，接种于富集培养基中，富集培养，将富集培养液采用梯度稀释涂布于分离培养基中，接种后的分离培养基置于厌氧罐内，分离培养，对各种不同特征的菌落进行平板划线纯化，获得单菌落；
步骤④：将获得的单菌落划线分离纯化2～3次，斜面保存，将分离的菌株进行己酸菌鉴定，获得己酸菌。
2.根据权利要求1所述的一种窖泥微生物分离方法，其特征在于：步骤③中所述富集培养基为酒糟浸液培养基，所含组分按质量份计为：酒糟浸液1000份，黄土50～150份，酵母膏10～15份，NaAc3～5份，乙醇10～20份，MgSO4·7H2O 0.1～0.3份，CaCO35～10份，聚谷氨酸10～30份、蔗糖酯5～15份。
3.根据权利要求2所述的一种窖泥微生物分离方法，其特征在于：所述酒糟浸液制备方法为：取发酵车间窖底酒糟，用纯净水浸泡1～2h，然后用双层纱布过滤得到酒糟浸液。
4.根据权利要求1所述的一种窖泥微生物分离方法，其特征在于：所述步骤③所述分离培养基所含组分按质量份计为：水1000份，酵母膏2～4份，牛肉膏5～15份，蛋白胨5～15份，琼脂15～20份，可溶性淀粉1～3份，葡萄糖4～6份，半胱氨酸盐酸盐0.3～0.6份，NaCl 1～5份，姜黄素2～6份，乙酸铜3～9份。
5.根据权利要求1所述的一种窖泥微生物分离方法，其特征在于：所述步骤③中，挑选产气早、气泡多的富集培养基，将所述富集培养基经过水浴加热处理后，经过稀释涂布于分离培养基中。
6.根据权利要求1所述的一种窖泥微生物分离方法，其特征在于：所述步骤④中鉴定试验过程为：取己酸菌株液于试管中，加硫酸铜溶液，乙醚，振荡，静置使之反应分层，观察乙醚层呈现颜色，如呈现绿色，颜色越深，己酸产量越高，选择己酸产量高的菌株。
7.根据权利要求6所述的一种窖泥微生物分离方法，其特征在于：对所述己酸含量高的菌株进行扩大培养后应用于人工窖泥的制作。
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CN112094746A (zh) * 2020-09-07 2020-12-18 天津科技大学 一种窖泥中己酸菌的分离培养方法

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