CN112725221A - 一种荧光假单胞菌以及利用荧光假单胞菌制备异羟肟酸型铁载体的方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荧光假单胞菌以及利用荧光假单胞菌制备异羟肟酸型铁载体的方法和应用。本发明利用荧光假单胞菌HMP01(Pseudomonas fluorescens strainHMP01)的培养过程产生异羟肟酸型铁载体，该异羟肟酸型铁载体对重金属具有螯合作用，且对有机物具有增溶作用，可通过异位淋洗或原位浸提方式实现农用地、工矿区及采油区等弱酸性、中性及弱碱性土壤中阳离子型重金属、多环芳烃、石油烃及其复合污染物的高效去除，且异羟肟酸型铁载体的制备工艺简单、成本低廉、淋洗效率高、无二次污染。

Description

一种荧光假单胞菌以及利用荧光假单胞菌制备异羟肟酸型铁 载体的方法和应用

技术领域

本发明涉及一种荧光假单胞菌，还涉及利用荧光假单胞菌培养过程产生异羟肟酸型铁载 体的方法，以及异羟肟酸型铁载体在重金属、有机和复合污染土壤修复中的应用，可实现场 地或农用地污染土壤中镉、铅、铜、镍、锌、汞等阳离子型重金属离子、多环芳烃、总石油 烃及其复合污染物的异位淋洗或原位浸提修复，属于污染土壤修复领域。

背景技术

目前，农用地、工业企业等场地土壤污染严重，特征污染物是以镉等重金属为代表的无 机污染物和以多环芳烃为代表的有机污染物。根据调查发现，土壤中镉的浓度自1975年以来 不断增加，农田中平均镉含量已达0.45mg/kg，16种多环芳烃平均浓度高达1.083mg/kg，同 时在石油化工产品使用过程中排放的石油烃类物质极易通过下渗、大气沉降等方式汇入土壤， 导致人群的健康风险加大，土壤修复难度增大(Taoran Shi,etal.Status of cadmium accumulation in agricultural soils across China(1975–2016):From temporal and spatial variations to risk assessment,Chemosphere,(230)2019,136-143；Jun Han,et al.Polycyclic aromatic hydrocarbon (PAHs)geographical distribution in China and their source,risk assessment analysis,Environmental Pollution,(251)2019,312-327)。防治土壤污染，保障农产品质量安全、人居环境安全和生态环 境安全，是实现国家经济社会高质量发展的重要基础，也是民生所向。因此，需开发简单、 经济、高效的重金属、多环芳烃和总石油烃污染土壤的修复技术，以保障农用地和建设用地 的土壤环境安全。

目前，我国土壤污染修复主要采用物理、化学、生物修复方法。物理修复方法主要包括 客土、换土和深耕翻土等措施降低土壤中重金属含量、利用蒸汽抽提法、热脱附技术去除多 环芳烃及石油烃含量。化学修复是施用碳酸钙、磷酸盐、硅酸盐、高锰酸盐、甲醇等不同改 良剂，达到增强对重金属的吸附、氧化还原、沉淀络合或增溶解析作用。由于物理、化学法 未能从根源上将重金属从土壤中分离出来，在酸雨、干旱等外界自然环境的影响下导致重金 属再次活化，依然会对土壤造成潜在的风险。生物修复主要分为微生物修复和植物修复，植 物修复技术因其较低的成本和无二次污染引起了众多的关注，但大部分重金属超累积植物如 蜈蚣草、东南景天，石油烃富集植物如黑麦草、高羊茅等一般都具有生长缓慢、生物量低、 生长环境特殊，受到当地气候条件、土壤养分以及可用植物物种的限制等特征，难以满足对 工业废弃地等污染场地进行快速治理的要求；微生物修复是通过调控微生物在土壤中活动， 加强土壤中重金属离子的矿化、多环芳烃等有机污染物的降解，使土壤恢复其正常功能。我 们重点关注微生物修复过程中细菌产生的有机小分子物质及其对复合污染物的去除作用机制， 以期找到一种生物淋洗剂通过异位淋洗或原位浸提的方式实现农用地、场地污染的高效绿色 修复。

土壤淋洗技术因其修复时间短、适应性强的特点近年来成为了国际上的研究热点，部分 成果并被广泛地在实验室进行研究并已应用于实际污染土壤的治理中。目前普遍使用的土壤 淋洗剂有螯合剂(柠檬酸、草酸、盐酸、乙二胺四乙酸和乙二胺二琥珀酸)、表面活性剂(烷基 糖苷、十二烷基硫酸钠和十二烷基苯磺酸钠)等淋洗剂单独或其复配注入到污染土壤或沉积物 中，以洗脱和清洗土壤中污染物。但上述淋洗药剂在实际应用过程中存在制备成本过高，制 备方法繁杂，淋洗率低及二次污染等难点问题，限制了淋洗技术的规模化生产应用。另外， 由于土壤环境的复杂多变，土壤淋洗剂的稳定性及淋洗后土壤基本功能的破环及可能带来潜 在的生态风险都是需要重视的问题。相对于目前大量使用的化学淋洗剂，细菌产生并制备的 生物淋洗剂具有更好的环境友好性。目前商业使用的生物淋洗剂主要有鼠李糖脂，它具有无 毒、两亲等性质，已经被广泛用于处理土壤多环芳烃等有机物及重金属污染。此外，也有利 用无患子果实的提取物皂角苷作为天然淋洗剂修复多环芳烃污染土壤，取得了较好的修复效 果且无二次污染。可见生物淋洗剂是推动未来淋洗技术深入发展的关键。

土壤环境中大约95％的细菌都会产生铁载体来竞争稀缺的Fe³⁺资源以满足自身生长需求， 铁载体在土壤生态系统的物质交换中发挥着重要的作用(Gu,S.,etal.Competition for iron drives phytopathogen control by natural rhizospheremicrobiomes.NatMicrobiol,(5)2020,1002–1 010.)。铁载体因结构差异性一般分为异羟肟酸型、儿茶酚型、羧酸盐型等三种类型。目前学 者主要关注于铁载体对于石棉矿物中Fe³⁺、Mg²⁺等元素的获取、产铁载体的细菌活化土壤中 的Cr、Pb以强化植物提取及增强微生物对重金属耐受性方面研究，证明了铁载体在土壤重金 属活化迁移上有潜在的应用价值(Sébastien R.David,et al.Efficiency of pyoverdines in iron removal from flockingasbestos waste:An innovative bacterial bioremediation strategy,Journal ofHazardous Materials,(394)2020,122532.ArmelleBraud,et al.Enhancedphytoextraction of an agricultural Cr-and Pb-contaminated soil bybioaugmentation with siderophore-producing bacteria,Chemosphere,(74)2009,280-286.)。截止目前，鲜有报道利用微生物产生铁载体直接 用于重金属污染、有机污染等复杂污染土壤的修复。

发明内容

针对现有技术中重金属、多环芳烃、石油烃等污染土壤修复过程存在的缺陷，本发明的 第一个目的是在于提供一种荧光假单胞菌HMP01(Pseudomonas fluorescens strainHMP01)， 荧光假单胞菌在培养过程中能够代谢产生特殊的异羟肟酸型铁载体，可以用于重金属、多环 芳烃、石油烃等复杂污染土壤的高效修复。

本发明的第二个目的是在于提供一种异羟肟酸型铁载体的制备方法，该方法是通过荧光 假单胞菌HMP01(Pseudomonas fluorescens strain HMP01)的代谢产生异羟肟酸型铁载体，具 有条件温和、成本低、产率高等特点。

本发明的第三个目的是在于提供一种异羟肟酸型铁载体，其同时包含有二羟基喹啉、饱 和脂肪酸等疏水性基团，及羟基、氨基等亲水性基团，N-羟基-N-甲基乙酰胺，琥珀酰胺等类 环状结构，不但对大部分重金属离子具有较好的螯合吸附作用，而且可以对多环芳烃、石油 烃起到增溶作用。

本发明的第四个目的是在于提供一种异羟肟酸型铁载体的应用，将其作为淋洗剂或浸提 剂应用于重金属污染土壤修复，或者应用于有机污染土壤修复，或者应用于重金属和有机复 合污染土壤修复，淋洗或浸提效率高，绿色环保无二次污染，不会未破坏土壤结构，可应用 于农用地、工矿区及采油区等弱酸性、中性及弱碱性土壤中阳离子型重金属、多环芳烃、总 石油烃及其复合污染物的高效去除。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种荧光假单胞菌HMP01(Pseudomonasfluorescens strain HMP01)，保藏编号CCTCC NO:M 20191131，其16S rDNA部分序列在NCBI Genbank登录号：MN689650.1。

本发明还提供了一种异羟肟酸型铁载体的制备方法，将荧光假单胞菌置于缺铁无机盐培 养基中培养，在培养基中产生异羟肟酸型铁载体。

作为一个优选的方案，所述缺铁无机盐培养基中包含的无机盐及各种无机盐的浓度为： 乙酸钠3～7g/L、磷酸二氢钾0.5～1g/L、硫酸铵0.2～0.5g/L、硝酸钠0.2～0.5g/L、氯化钙 0.01～0.02g/L、硫酸镁0.01～0.02g/L。

作为一个优选的方案，所述培养条件为：在28～32℃温度下培养72～96h。

本发明还提供了一种异羟肟酸型铁载体，其由所述制备方法得到。

作为一个优选的方案，异羟肟酸型铁载体具有以下化学结构式：

本发明的异羟肟酸型铁载体分子结构中包含有二羟基喹啉、饱和脂肪酸等疏水性基团， 及羟基、氨基等亲水性基团，N-羟基-N-甲基乙酰胺、琥珀酰胺等类环状结构。如羟基、碳氧 双键等官能团上的氧原子可以与重金属离子形成稳定的共价键进而将重金属离子络合或螯合， 从而可以达到淋洗重金属离子的目的，同时，异羟肟酸型铁载体具有亲水和亲油的类表面活 性剂的特性，故可对多环芳烃、石油烃等有机物具有较好的增溶能力，尤其当羟基上的氢被 镉离子取代后，分子极性减弱，增溶能力得到进一步增强；而当异羟肟酸型铁载体与多环芳 烃增溶后，由于存在阳离子-π作用能加快与重金属阳离子的螯合速率；此外，异羟肟酸型铁 载体与多环芳烃增溶后，鞘氨醇杆菌对于多环芳烃的降解效果得到明显增强，且对铁载体具 有较低的利用性。因此，利用异羟肟酸型铁载体通过异位淋洗或原位浸提的方式对重金属离 子、多环芳烃、总石油烃及其复合污染土壤进行修复，具有广阔的应用前景。该异羟肟酸型 铁载体与Cd²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺和Ni²⁺等具有较好的螯合作用，鳌合比(按物质的量 计)分别为3:1、2:1、2:1、2:1、1:1和1:1，螯合优先顺序为Cd²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺和Ni²⁺。同时异羟肟酸型铁载体对菲等多环芳烃以及总石油烃具有较好的增溶洗脱能力。此 外，异羟肟酸型铁载淋洗土壤后能提高土壤pH值大约2个单位，且能增加土壤中速效氮、 速效磷、速效钾、交换性镁含量。

本发明还提供了一种异羟肟酸型铁载体的应用，其作为淋洗剂或浸提剂应用于重金属污 染土壤修复，或者应用于有机污染土壤修复，或者应用于重金属和有机复合污染土壤修复。

作为一个优选的方案，所述重金属污染土壤为镉、铅、铜、镍、锌、汞中至少一种污染 的土壤。

作为一个优选的方案，所述有机污染土壤为多环芳烃和/或石油烃污染的土壤。

作为一个优选的方案，所述重金属和有机复合污染土壤为包含镉、铅、铜、镍、锌、汞 中至少一种重金属，且包含多环芳烃和/或石油烃的复杂污染土壤。

本发明的异羟肟酸型铁载体在使用过程中配成淋洗液或浸提剂使用，这是行业内所公知 的。

本发明的异羟肟酸型铁载体由以下具体方法制备得到：将荧光假单胞菌从固体的LB培 养皿上挑菌加至缺铁的无机盐培养基(培养基主要成分及浓度：乙酸钠3～7g/L、磷酸二氢钾 0.5～1g/L、硫酸铵0.2～0.5g/L、硝酸钠0.2～0.5g/L、氯化钙0.01～0.02g/L、硫酸镁0.01～0.02g/L)， 置于28～32℃的恒温气浴摇床150r/min培养72～96h，然后将菌液在8000r/min的高速离心机 中离心10min，取上清液加一定量预先活化的大孔树脂XAD-2置于摇瓶中150r/min摇2h， 用铬天青S染液检测上清液铁载体活性，待大孔树脂充分吸附铁载体后置于淋洗柱中，用50％ 的甲醇洗脱，收集淋洗液，用旋转蒸发仪将淋洗液浓缩，待浓缩至2ml时回收并用冷冻真空 干燥机冻干，收集得到的铁载体粉末，加超纯水溶解得到一定质量浓度的铁载体溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明的异羟肟酸型铁载体通过微生物代谢产生，原料廉价易得(细菌繁殖生长迅速)， 异羟肟酸型铁载体的制备成本约为1元/kg，修复时间短，总淋洗修复成本低廉；

(2)本发明的异羟肟酸型铁载体不仅适用于修复重金属污染、有机物污染等单一污染土 壤，同时对重金属-有机复合污染土壤具有协同修复作用。当Cd²⁺等重金属离子与羟基上氧原 子螯合后降低了铁载体的极性，对多环芳烃的增溶能力得到增强。当该淋洗剂与多环芳烃增 溶后，由于多环芳烃存在阳离子-π作用能加快与镉等6种阳离子重金属的螯合速率。

(3)本发明建立了预测模型方程，通过待淋洗土壤6种阳离子型重金属全量计算得出重 金属淋洗达标所需淋洗剂用量，实现定量投加淋洗剂以节约淋洗成本。

(4)本发明的异羟肟酸型铁载体淋洗剂淋洗后土壤的pH值会提高大约2个单位，淋洗结 束后氢氧根能进一步固定土壤中的重金属，降低其生物有效性。

(5)本发明的异羟肟酸型铁载体淋洗剂淋洗后土壤的基本营养结构未被破坏，土壤中速效 氮、速效磷、速效钾、交换性镁含量增加，交换性钙、有机质含量略有降低。

(6)本发明的异羟肟酸型铁载体淋洗剂淋洗后土壤残留的铁载体对生物无明显毒害作用， 且能缓解镉等重金属离子对大肠杆菌(原核生物)、小球藻(真核生物)的毒害，同时铁载体 通过活化残渣态重金属能增强水稻(植物)的吸收。异羟肟酸型铁载体作为碳源也能被微生 物所利用，因此异羟肟酸型铁载体对于土壤生物的生长、整个生态环境并无较大的风险。异 羟肟酸型铁载体增溶多环芳烃(菲、芘)后，鞘氨醇单胞菌对于菲、芘的降解率得到明显提 高，有利于土壤中残留多环芳烃的降解。

附图说明

图1为本发明荧光假单胞菌系统发育树图。由图可知，该菌属于假单胞菌属且与荧光假单胞 菌有很好的亲缘关系。

图2为本发明利用LC-MS/MS测定异羟肟酸型铁载体的结构图(图a为高效液相色谱图、图 b为一级质谱图、图c为二级质谱图、图d为异羟肟酸型铁载体分子结构图)。由图可知，高 效液相色谱图中异羟肟酸型铁载体出峰时间为6.650min，根据一级质谱、二级质谱的分子离 子峰及特征碎片离子峰，得出该异羟肟酸型铁载体平面结构。

图3为本发明异羟肟酸型铁载体与Cd²⁺螯合模拟对接及配位键长分析图。由图可知，Cd²⁺主 要与羟基和碳氧双键上的氧原子产生配位键，并计算得出了配位键长及复合物的能量。

图4为本发明异羟肟酸型铁载体与菲模拟对接及疏水接触的原子分析图(图a为异羟肟酸型 铁载体与菲模拟对接、图b为异羟肟酸型铁载体上原子与菲疏水接触分析图)。由图可知，菲 位于异羟肟酸型铁载体疏水性结构中，与二羟基喹啉、饱和脂肪酸等疏水性基团的原子接触， 进而起到增溶的效果。

图5为本发明异羟肟酸型铁载体与Cd²⁺螯合过程络合比计算(图a为Cd²⁺对异羟肟酸型铁载 体荧光淬灭图、图b为异羟肟酸型铁载体与Cd²⁺反应方程式及其推导图、图c为线性回归拟 合分析图)。由图可知，异羟肟酸型铁载体与Cd²⁺螯合会发生荧光淬灭，当螯合达到饱和荧光 值趋于稳定，基于此并结合化学平衡常数公式及其推导式得出铁载体与Cd²⁺按照3：1(以物 质的量计)的比例鳌合。

图6为本发明异羟肟酸型铁载体对多环芳烃中菲和芘增溶能力图。由图可知，异羟肟酸型铁 载体对菲、芘的溶解度(Sw*)相对于超纯水对菲、芘的溶解度(Sw)有明显提高，尤其对 芘的增溶能力强于菲。

图7为本发明异羟肟酸型铁载体异位淋洗去除铬渣厂污染土壤、农药厂污染土壤、石油化工 污染土壤、重金属污染菜园土壤、重金属多环芳烃复合污染稻田土壤等污染土壤中6种重金 属所需淋洗剂物质的量和最佳淋洗时间图(图a为柱淋洗、图b为摇瓶振荡洗脱)。由图可知， 对柱淋洗绘制穿透曲线并积分找到淋洗完全所需的淋洗液量分别为0.30、0.05、0.27、0.15、 0.12mmol，由摇瓶淋洗可知最佳淋洗时间为30min。

图8为本发明通过异位淋洗对铬渣厂污染土壤、农药厂污染土壤、石油化工污染土壤、重金 属污染菜园土壤、重金属多环芳烃复合污染稻田土壤等污染土壤中6种重金属去除率、化学 形态的变化及其超标的Cd²⁺、Zn²⁺淋洗前后浓度变化。由图可知，一次淋洗对Cd^{2 +}、Cu²⁺、 Pb²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺、Ni²⁺的全量平均去除率分别为71.2％、58.61％、65.5％、55.98％、59.16％、 48.57％，且对土壤中可交换态和残渣态的重金属去除效果较好。淋洗后土壤达到了农用地的 风险筛选值。

图9为本发明异羟肟酸型铁载体对重金属淋洗过程动力学方程模拟图(图a为准一级动力学 方程、图b为准二级动力学方程、图c为双常数方程、图d为抛物线方程)。由图可知，淋洗 动力学更贴近准二级动力学模型，说明淋溶过程并不是简单的扩散控制，同时与淋洗剂和金 属离子之间的配位键力有关。双常数方程参数说明异羟肟酸型铁载体对镉的淋洗具有洗脱速 率快、洗脱率高的特点。抛物线方程中两段曲线分别表示洗脱过程的两个阶段：第一阶段是 表面扩散，即土壤表层镉离子扩散到淋洗液中；第二阶段是颗粒内扩散，即镉离子在土壤孔 隙之间的扩散。第二阶段明显高于第一阶段，证明能在孔隙间充分的扩散洗脱，提高了洗脱 效率。

图10为本发明的异羟肟酸型铁载体用量预测模型方程图。如图可知，通过代入六种待淋洗土 壤中重金属全量，可计算出淋洗达标所需异羟肟酸型铁载体量，预测值与实际值残差在10％ 以内，具有较高的预测精度。

图11为本发明对有机污染物的去除效果(图a为菲的振荡淋洗图、图b为对总石油烃(C₁₀-C₄₀) 的柱淋洗图)。由图可知，异羟肟酸型铁载体对铬渣厂土壤、复合污染水稻土壤中菲的洗脱量 分别达0.194mg/g、0.084mg/g，对石油烃的洗脱量达28.2mg/g。

图12为本发明异羟肟酸型铁载体对土壤生物毒性评价(图a为大肠杆菌、图b为小球藻、图 c-d为水稻)。由图可知，淋洗后土壤残留的铁载体对生物无明显毒害作用，且能缓解镉等重 金属离子对大肠杆菌(原核生物)、小球藻(真核生物)的毒害，同时铁载体通过活化残渣态 重金属能增强水稻(植物)的吸收。

图13为本发明对淋洗前后土壤的基本营养结构变化图(图a为有机质、图b为交换性钙、图 c为交换性镁、图d为速效氮、图e为速效磷、图f为速效钾)。由图可知，淋洗后土壤的基 本营养结构未被破坏，土壤中速效氮、速效磷、速效钾、交换性镁含量增加，交换性钙、有 机质含量略有降低。

具体实施方式

以下具体实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制权利要求的保护范围。

以下具体实施例中的异羟肟酸型铁载体由以下具体方法制备得到：将荧光假单胞菌从固 体的LB培养皿上挑菌加至缺铁的无机盐培养基(培养基主要成分及浓度：乙酸钠3～7g/L、 磷酸二氢钾0.5～1g/L、硫酸铵0.2～0.5g/L、硝酸钠0.2～0.5g/L、氯化钙0.01～0.02g/L、硫酸镁 0.01～0.02g/L)，置于28～32℃的恒温气浴摇床150r/min培养72～96h，然后将菌液在8000r/min 的高速离心机中离心10min，取上清液加一定量预先活化的大孔树脂XAD-2置于摇瓶中 150r/min摇2h，用铬天青S染液检测上清液铁载体活性，待大孔树脂充分吸附铁载体后置于 淋洗柱中，用50％的甲醇洗脱，收集淋洗液，用旋转蒸发仪将淋洗液浓缩，待浓缩至2ml时 回收并用冷冻真空干燥机冻干，收集得到的异羟肟酸型铁载体粉末，加超纯水溶解得到一定 质量浓度的铁载体溶液。

本发明提供的荧光假单胞菌HMP01(Pseudomonas fluorescens strain HMP01)于2019年12月30日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武 汉大学，邮编：430072，电话：(027)68754052，保藏编号CCTCC NO：M20191131。

实施例1

荧光假单胞菌HMP01(Pseudomonas fluorescens strain HMP01)的16S rDNA基因序列 特征：

提取该菌株的细菌基因组DNA，以该菌株的基因组DNA为模板，以用通用引物27F和1492R扩增该菌株的16SrDNA基因。PCR扩增后的16S rDNA产物送上海生物工程有限公司 测序。测序结果显示该菌株的16S rDNA部分序列长度有1307bp，其序列特征如下：

CTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGGCGCTAATACCGCATAC GTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCG GATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGA GGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGT GGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCT GTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAT ACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCA GCAAGTTGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGC TAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGG AAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAA GCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACT AGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGG GGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTG GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAG AACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCT TAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGA AGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCG TAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGA ATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCC CGTCACACCA TGGGAGTGGG TTGCTCC。

将该菌株的16S rDNA部分序列在NCBI Genbank上的相关细菌的16S rDNA序列进行 BLAST比对，并进行同源性分析，结果表明，该菌株与假单胞菌属的同源性最高，相似度在 99％以上，结合形态培养特征、生理生化实验分析以及16SrDNA序列分析，该菌株确定为荧 光假单胞菌。将该菌株的16SrDNA部分序列提交到NCBI Genbank，获得登录号为MN689650.1。

使用MEGA X软件构建得到的该菌的16S rDNA系统发育树如图1所示。

实施例2

重金属与异羟肟酸型铁载体的结合比计算：

第一步，取纯化后浓度为20mg/L铁载体置于棕色玻璃瓶中，添加Cd²⁺至终浓度为0、0.001、 0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、20、100、200、300、400、500mg/L，25ml定容，振荡混匀放置30min，利用荧光分光光度计测定其在400nm激发波长下的最大发射波长及其对应的荧光强度。

第二步，在Cd²⁺浓度为0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、20、100、200、300、400、500mg/L，并以Cd²⁺/铁载体浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制点线图，找到变化的拐点为2mg/L。

第三步，根据1molCd²⁺与nmol铁载体生成1mol络合物的反应方程，计算得到化学平衡 常数，经过如图5(b)的一系列变形替换，得到计算结合比的方程。利用Cd²⁺浓度为0、0.001、 0.01、0.05、0.1、0.5、1、2mg/L的点，绘制Log(Cd²⁺)为横坐标，Log[(F₀-F_i)/F_i]为纵坐标， 拟合曲线生成二元一次方程，自变量前的系数即为结合比。

实施例3

生物淋洗剂淋洗去除铬渣厂污染土壤、农药厂污染土壤、石油化工污染土壤、重金属污 染菜园土壤、重金属多环芳烃复合污染稻田土壤中的重金属：

实验所用的土壤均为实地采集，其中铬渣厂污染土、农药厂污染土、石油化工污染土、 重金属污染蔬菜土、重金属多环芳烃复合污染水稻土等5种土壤中Cd²⁺、Zn²⁺均超标，Cd^{2 +}浓度分别为1.17、1.30、0.89、1.13、0.81mg/kg，Zn²⁺浓度分别为464.81、485.26、326.24、509.25、475.91mg/kg。5种土壤的pH值分别为7.56、6.61、6.18、6.93、6.71。

第一步，将待淋洗的土壤自然风干研磨过20目的筛网。

第二步，在淋洗柱中填入20目石英砂(先在2％硝酸溶液中浸泡24h，冲洗干燥后使用)， 形成3cm的过滤层；然后分多次加入5g的污染土样，确保土壤的均匀性，并在上方添加一 层石英砂，防止浮土，若受试土壤的粘性较高，则加入适量的石英砂混和，增大土壤孔隙， 提高流速。分别取超纯水、铁载体100ml(浓度500mg/L)的淋洗液在土柱中均匀扩散，流速 5ml/min、每两分钟取一次样，取10管，每管取1ml。绘制穿透曲线并积分找到淋洗完全所需的淋洗液量分别为0.30、0.05、0.27、0.15、0.12mmol。再分别向5g土样分别加入通过柱淋洗确定的淋洗剂量，在摇瓶里按时间梯度取样再次验证淋洗效果，确定最佳淋洗时间为30min。淋洗结束后Cd²⁺、Zn²⁺浓度均降低到《土壤环境质量-农用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 15618-2018)限值以下。

实施例4

铁载体用量预测模型的构建及其与实际淋洗用量比较：

根据实施例2中计算得出铁载体与Cd²⁺、Pb²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺的物质的量的络合比分别为3:1、2:1、2:1、2:1、1:1和1:1，同时依据分子对接模拟结果按能量低优先螯合的原则得出铁载体与6种重金属螯合的优先顺序为Cd²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺。以此 为基础，建立了预测模型方程，n(铁载体)＝2.13n_Cd+1.3n_Pb+1.18n_Hg+0.59n_Cu+1.1n_Zn+0.49n_Ni，拟合后的曲线相关系数(R²)＝0.9997，残差(RSS)＝4.281E-6，预测铁载体用量与实际铁载体用量 的相对误差在10％以内，具有较高的预测精度。

实施例5

生物淋洗剂对多环芳烃污染土的淋洗：

因为生物淋洗剂的量与多环芳烃淋洗效率成正比，故实验采取50ml(500mg/L)的淋洗液， 5g铬渣厂污染土(菲浓度1.16mg/kg)、重金属多环芳烃复合污染水稻土(菲浓度0.54mg/kg)作 为实验对象，通过柱淋洗和振荡淋洗方式进行洗脱。同实施例3步骤淋洗，绘制淋洗穿透曲 线，1ml淋洗液加5ml正己烷萃取，无水硫酸钠脱水，过0.22μm有机系滤膜，氮吹浓缩至 0.5ml。土壤中菲的全量测定取10g土，加入100ml正己烷-丙酮混合溶剂超声振荡、萃取浓 缩，高效液相色谱HPLC-FLD测定。由实验结果知，当取50ml(500mg/L)的淋洗液淋洗5g土 样即液土比为10：1，流速为5ml/min时，铁载体对铬渣厂土壤、复合污染水稻土壤中菲的淋 洗效率分别为83.62％、77.78％，洗脱量分别达0.194mg/g、0.084mg/g，通过振荡淋洗得出最 佳淋洗时间为15min。淋洗结束后菲浓度均降低到了《土壤环境质量-农用地土壤污染风险管 控标准(试行)》(GB 15618-2018)限值以下。

实施例6

生物淋洗剂对石油化工污染土的淋洗：

因为生物淋洗剂的量与淋洗效率成正比，实验采取50ml(500mg/L)的淋洗液、石油化工污 染土(总石油烃57mg/kg)作为实验对象，测定总石油烃含量(C₁₀-C₄₀)。同实施例3步骤淋洗， 绘制淋洗穿透曲线，1ml淋洗液加5ml正己烷萃取，无水硫酸钠脱水，过0.22μm有机系滤膜， 氮吹浓缩至0.5ml。石油化工污染土取10g，加入100ml正己烷-丙酮混合溶剂超声振荡、萃 取浓缩，气相色谱GC-FID测定。由实验结果可知，当取50ml、500mg/L的淋洗液淋洗5g 土样即液土比为10：1，流速为5ml/min时，铁载体对石油烃的淋出量达28.2mg/g。按上述步骤淋洗5次即淋洗剂用量为500ml(500mg/L)时，对总石油烃的淋洗效率能达到87.71％。淋 洗结束后达到了《土壤环境质量-建设用地土壤污染风险管控标准(试行)》(GB 36600-2018) 限值。

实施例7

淋洗成本的计算：

淋洗所需要的成本主要是来自铁载体试剂的制备成本即1元/mol。以淋洗污染较严重的 重金属污染蔬菜土壤为例，重金属淋洗达标所需铁载体0.027mol/kg，淋洗成本为0.027元/kg。 修复深度为20cm的一亩耕层土试剂价格约为4050元/亩。以淋洗污染较轻的农药厂重金属污 染厂为例，淋洗所需铁载体0.011mol/kg，即0.011元/kg。修复深度为20cm的一亩耕层土试 剂价格约为1050元/亩。

实施例8

淋洗后土壤的生态风险评价：

第一步，对原核生物-大肠杆菌毒性实验，利用纯的铁载体溶液以棕色玻璃瓶为容器，在 生理盐水(0.9％NaCl溶液)中，添加20mg/L的葡萄糖，Cd²⁺浓度梯度为0、0.1、0.5、1、2、 3mg/L，分别添加铁载体(20mg/L)，以不添加铁载体的作为对照，添加OD₆₀₀＝0.6的大肠杆 菌重悬液1ml，最后定容至25ml，利用空白作为对照。在150r/min、37℃的摇床2.5h，然后每个样品分别取1mL加至盛有9mL无菌水的10ml玻璃管、无菌水将样品稀释至10^-6涂三个 LB板，在37℃的培养箱培养18h，最后进行计数。同时取1mL的菌液，在细胞破碎仪中破 碎，利用考马斯亮蓝比色法，以牛血清蛋白作为标线，测定细菌蛋白质的含量。

第二步，对原核生物-小球藻的实验，配置Cd²⁺浓度为0、0.5、1mg/L，铁载体添加量为 50mg/L，以不添加作为对照。控值小球藻初始生长量OD₆₈₀＝0.05。在光照培养箱中培养，光 照强度为4000Lux，每光照12h再黑暗12h，每隔24h取次样测定生长量。

第三步，选取饱满的水稻种子洗净,经过氧化氢消毒、泡种、催芽之后,挑选根长一致约 为1cm的幼芽移植到装有20ml的水的培养皿上，做三瓶，每瓶放3根苗，Cd²⁺、Pb²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺浓度控制在0、0.5、1、2、3mg/L，铁载体添加量为20mg/L，以不添加铁载 体作为对照。

第四步，测定淋洗前后土壤基本营养物质(交换性钙、交换性镁、有机质、速效氮、速 效磷、速效钾)变化。以乙酸铵为交换剂，浸出液中的交换性钙、镁、速效钾用火焰原子吸收分光光度计测定。速效氮的测定利用碱解扩散法测定；速效磷的测定利用碳酸氢钠浸提，钼锑抗显色反应测定。有机质含量利用重铬酸钾容量法测定。

第五步，在40ml的棕色玻璃瓶子中加入20ml不同浓度的铁载体溶液以及稍大于溶解量 的固体菲、芘等，加盖密封后置于恒温振荡器中，在20℃下振荡24h。然后在20℃下离心 (4000r/min)分离30min。准确移取上清液15ml置于50ml的锥形瓶中，然后按照1％的接菌量添加OD₆₀₀＝0.6的鞘氨醇杆菌，并以不加菌的作为对照，按时间梯度取样测定其中菲、芘及铁载体的降解率，用荧光分光光度计测样。

第六步，根据实验结果可知，淋洗后土壤残留的铁载体对生物无明显毒害作用，且能缓 解重金属离子对原核生物(大肠杆菌)、真核生物(小球藻)的毒害，同时铁载体通过活化残 渣态重金属能增强植物的吸收。铁载体作为碳源也能被微生物所利用，因此铁载体对于土壤 生物的生长、整个生态环境并无较大的风险。铁载体与多环芳烃(菲、芘)增溶后，多环芳 烃高效降解菌鞘氨醇杆菌对于菲、芘的降解率得到明显提高，能进一步加强对土壤中残留多 环芳烃的降解。

序列表

<110> 湘潭大学

<120> 一种荧光假单胞菌以及利用荧光假单胞菌制备异羟肟酸型铁载体的方法和应用

<130> RZ210-303515

<141> 2020-12-15

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1307

<212> DNA

<213> 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)

<400> 1

ctaggaatct gcctggtagt gggggataac gtccggaaac gggcgctaat accgcatacg 60

tcctgaggga gaaagtgggg gatcttcgga cctcacgcta tcagatgagc ctaggtcgga 120

ttagctagtt ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ccgtaactgg tctgagagga 180

tgatcagtca cactggaact gagacacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 240

atattggaca atgggcgaaa gcctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggtcttcg 300

gattgtaaag cactttaagt tgggaggaag ggcagtaagt taataccttg ctgttttgac 360

gttaccaaca gaataagcac cggctaactt cgtgccagca gccgcggtaa tacgaagggt 420

gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgcgcgta ggtggttcag caagttggat 480

gtgaaatccc cgggctcaac ctgggaactg catccaaaac tactgagcta gagtacggta 540

gagggtggtg gaatttcctg tgtagcggtg aaatgcgtag atataggaag gaacaccagt 600

ggcgaaggcg accacctgga ctgatactga cactgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac 660

aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc gactagccgt tgggatcctt 720

gagatcttag tggcgcagct aacgcgataa gtcgaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 780

ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 840

aagcaacgcg aagaacctta cctggccttg acatgctgag aactttccag agatggattg 900

gtgccttcgg gaactcagac acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 960

gttgggttaa gtcccgtaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagca cctcgggtgg 1020

gcactctaag gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1080

atggccctta cggccagggc tacacacgtg ctacaatggt cggtacaaag ggttgccaag 1140

ccgcgaggtg gagctaatcc cataaaaccg atcgtagtcc ggatcgcagt ctgcaactcg 1200

actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg tgaatcagaa tgtcacggtg aatacgttcc 1260

cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg ttgctcc 1307

Claims (8)

1.一种荧光假单胞菌HMP01(Pseudomonas fluorescens strainHMP01)，保藏编号CCTCC NO:M 20191131。

2.一种异羟肟酸型铁载体的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述荧光假单胞菌置于缺铁无机盐培养基中培养，在培养基中产生异羟肟酸型铁载体。

3.根据权利要求2所述的异羟肟酸型铁载体的制备方法，其特征在于：所述缺铁无机盐培养基中包含的无机盐及各种无机盐的浓度为：乙酸钠3～7g/L、磷酸二氢钾0.5～1g/L、硫酸铵0.2～0.5g/L、硝酸钠0.2～0.5g/L、氯化钙0.01～0.02g/L、硫酸镁0.01～0.02g/L。

4.根据权利要求2所述的异羟肟酸型铁载体的制备方法，其特征在于：所述培养条件为：在28～32℃温度下培养72～96h。

5.一种异羟肟酸型铁载体，其特征在于：由权利要求1～4任一项所述制备方法得到。

6.根据权利要求5所述的一种异羟肟酸型铁载体，其特征在于：具有以下化学结构式：

7.一种异羟肟酸型铁载体的应用，其特征在于：作为淋洗剂或浸提剂应用于重金属污染土壤修复，或者应用于有机污染土壤修复，或者应用于重金属和有机复合污染土壤修复。

8.根据权利要求7所述的一种异羟肟酸型铁载体的应用，其特征在于：

所述重金属污染土壤为镉、铅、铜、镍、锌、汞中至少一种污染的土壤；

所述有机污染土壤为多环芳烃和/或石油烃污染的土壤；

所述重金属和有机复合污染土壤为包含镉、铅、铜、镍、锌、汞中至少一种重金属，且包含多环芳烃和/或石油烃的复杂污染土壤。

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