CN112646846B - 一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法 - Google Patents

一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用细菌非生长耦联特性生产β‑1,3‑葡聚糖的方法。所述方法包括以下步骤：将产β‑1,3‑葡聚糖菌株进行活化，制备种子培养液；将种子培养液接入发酵培养基中，进行发酵培养；发酵结束后，将60‑80%的发酵液转入转化罐内；向剩余20‑40%的发酵液中加入发酵培养基至初始发酵体积，再继续进行二次发酵，如此循环5‑6次；S4.向转化罐内分次流加糖液，进行全细胞转化。本发明方法通过高密度发酵培养和流加补糖全细胞转化的方式，可以显著提高β‑1,3‑葡聚糖产量，并缩短生产周期，降低生产成本，解决了现有发酵工艺的不足。

Description

一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法。
背景技术
β-1,3-葡聚糖是一类主链由β-1,3-糖苷键连接而成的多聚糖，是天然无害的高分子物质，通常因来源不同而含有不同比例和大小的β-1,2/β-1,4/β-1,6-连接的支链。
β-1,3-葡聚糖具有能增强免疫活力、抗肿瘤、抗氧化、抗细菌、抗病毒、抗真菌、降低胆固醇、降血脂等生物活性，是一种良好的生物效应调节剂。同时，还具有保湿、抗炎、抗衰老、去皱、去头屑、退黄、加快修复、增加皮肤弹性等功效，广泛应用在医药、食品、化妆品、动物饲料添加剂等多个领域。
目前，β-1,3-葡聚糖主要来源于酵母、食用真菌和植物(如香菇、燕麦、青稞)，受限于技术的复杂和成本的高昂，β-1,3-葡聚糖主要为低纯度的粗产物，生产过程产生的副产物也较多，产量受原材料成本制约。利用微生物发酵生产β-1,3-葡聚糖，具有不受季节限制、原料来源稳定易得、过程无副产物产生、批次间质量稳定的优点。
可得然胶(Curdlan)是由根瘤菌属的细菌合成，以β-1,3-D-糖苷键连接成的水不溶性葡聚糖，工业生产采用间歇式发酵来获得，生产周期长，产量偏低，每个周期开始都需要进行发酵罐的空实消，蒸汽消耗量较大。
中国专利申请CN110241150Aβ-1，3-葡聚糖的放大发酵方法，包括以下步骤：第一步、制备菌种活化培养基，按照KH2PO4 0.3-1.0g/L；CaCl2 0.3-1.0g/L，MgSO4 0.6-1.2g/L，FeSO4·7H2O 0.6-1.2g/L，蔗糖3.0-8.0g/L，琼脂12.0-18.0g/L的质量浓度称取物质，重蒸水溶解定容，调pH 6.5-7.0，115℃灭菌30分钟；第二步、菌种活化，将菌株划线接种于第一步所得菌种活化培养基，25-30℃静置恒温培养2-3天；第三步、制备种子培养液，按照蛋白胨8.0-10.0g/L，酵母浸粉3.0-5.0g/L，氯化钠3.0-5.0g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0-7.8，115-121℃灭菌20-30分钟；第四步、培养种子液，从菌种活化培养基上刮取活化菌种转接到100mL液体种子培养液中，于28-32℃摇床中以150-300rpm的速度震荡培养48-72h，至培养液OD600值在0.6-0.9之间，作为初级发酵培养的种子液备用；第五步、制备初级发酵培养液，按照蛋白胨8.0-10.0g/L，酵母浸粉3.0-5.0g/L，氯化钠3.0-5.0g/L的质量浓度称取各物质，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0-7.8，115-121℃灭菌20-30分钟；第六步、培养放大发酵种子液，按照种子液∶初级发酵培养液(V/V)比1∶300-800的比例，将种子液接种到初级发酵培养液中，于发酵罐25-35℃，发酵1-2天，调pH 6.5-7.0，搅拌速率150-200rpm，通气量0.4-0.5vvm，至发酵培养液OD600值大于0.9，作为放大发酵培养的种子液备用；第七步、制备放大发酵培养液，按照蔗糖120g/L的质量浓度称取，重蒸水溶解定容，调培养液pH 7.0-7.8，通入蒸汽115℃灭菌30分钟；第八步、放大发酵培养，按照初级发酵培养液∶放大发酵培养液(V/V)比1∶300-800的比例，将初级发酵液接种到放大发酵培养液中，于发酵罐25-35℃，发酵5-9天，其中发酵第1-2天需控制pH为7.0，误差不超过±0.1，搅拌速率为150-200rpm，通气量为0.4-0.5vvm；定时取样检测，待氮源耗尽时，调pH至5.5，误差不超过±0.1，搅拌速率为400-600rpm，通气量为0.7-0.8vvm，最终获得β-1，3-葡聚糖粗品。该方法得β-1，3-葡聚糖粗品最高产量为49.7mg/mL。该方法步骤复杂且所得β-1，3-葡聚糖产量较低。
发明内容
本发明主要目的在于提供一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法，本发明方法通过高密度发酵培养和流加补糖全细胞转化的方式，可以显著提高β-1,3-葡聚糖产量，并缩短生产周期，降低生产成本，解决了现有发酵工艺的不足。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法，包括以下步骤：
S1.将产β-1,3-葡聚糖菌株进行活化，制备种子培养液；
S2.将种子培养液接入发酵培养基中，进行发酵培养；
S3.发酵结束后，将60-80％的发酵液转入转化罐内；向剩余20-40％的发酵液中加入发酵培养基至初始发酵体积，再继续进行二次发酵，发酵结束后，再将60-80％的发酵液转入转化罐内；如此循环5-6次；
S4.向转化罐内分次流加糖液，进行全细胞转化：
首次流加时间为发酵液转入后1h内；
第二次流加时间为发酵液转入后30-35h；
第三次流加时间为发酵液转后40-45h。
进一步地，所述产β-1,3-葡聚糖菌株为土壤杆菌ATCC 31749。
进一步地，制备种子培养液所用种子培养基的组成：以质量百分比计，蔗糖1.0～2.0％；(NH4)2HPO4 0.5～1.0％；KH2PO4 0.15～0.2％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.3％；玉米浆粉0.15～0.5％；pH调节至7.2；
28～32℃、150～240r/min振荡培养16～24小时，得到种子培养液。
进一步地，发酵培养基的组成为：以质量百分比计，蔗糖5.0％；(NH4)2HPO4 0.5～1.0％；KH2PO4 0.15～0.2％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.1～0.5％；pH调节至7.0。
进一步地，发酵培养温度为28～32℃，起始pH7.0，搅拌转速120～200r/min，通风量0.35～0.65v.v.m，在发酵pH下降至5.4拐点之前通氧，通氧压力0.3-0.5Mp，通氧10-15min。
进一步地，待发酵液细胞浓度>7.5g/L时，停止发酵。
进一步地，流加糖液的总体积为初始发酵体积的20-40％；
首次流加时，糖液的加入量为初始发酵液体积的7.5-15％；
第二次流加时，糖液的加入量为初始发酵液体积的7.5-15％；
第三次流加时，糖液的加入量为初始发酵体积的5-10％。
进一步地，首次流加时还添加3-6mg/L UMP促进代谢因子。
进一步地，转化温度28～32℃，搅拌转速120～200r/min，通风量0.3～0.5v.v.m，糖液流加速度0.4～0.5m3/h，pH值维持在5.5-6.0，转化总时间为58～65h。
进一步地，所述糖液为质量浓度为20-50％的蔗糖溶液。
本发明还提供以上所述方法制备得到的β-1,3-葡聚糖。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的方法中采用非耦联发酵方法，通过微生物高密度培养和流加补料全细胞催化的有机结合，从而提高了β-1,3-葡聚糖产量，缩短生产周期，降低β-1,3-葡聚糖生产成本。与现有间歇发酵生产方式相比较，本发明利用菌株产可得然胶的非生长耦联发酵特性，在高密度培养阶段利用留有剩余成熟发酵培养液，再接入新鲜培养液，由于菌体细胞基础数量大，细胞增殖和生物量积累速度显著加快，越过迟滞期直接进入对数生长期，能够明显降低生产周期；在全细胞转化阶段，只需要控制流加糖液的浓度与流加速度，即可实现β-1,3-葡聚糖的高转化，糖浓度从原间歇发酵5％提高到12-14％，β-1,3-葡聚糖产率＞8％，实现了一种全新的发酵生产方式。
本发明所采用的设备、高密度培养和流加补料工艺简单，利于在工业化生产中推广；能显著提高β-1,3-葡聚糖产量，缩短生产周期，有利于降低β-1,3-葡聚糖生产成本，使其能够满足在食品、医药等领域的更广泛应用，从而提高β-1,3-葡聚糖的商业价值。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
本发明中，菌体量的测定方法为，向100ml发酵液中加入400ml 1mol/L的氢氧化钠溶液，高速搅拌15min，溶解后，用离心机10000r/min离心10min，弃上清液，将沉淀物用1mol/l盐酸溶液洗涤离心两次、蒸馏水洗涤离心一次，收集沉淀105℃恒温干燥至恒重，称量，重量除以发酵液体积得到菌体量。
本发明中，β-1,3-葡聚糖含量的测定方法为，向100ml转化液中加入400ml 1mol/L的氢氧化钠溶液，高速搅拌15min，溶解后，用离心机10000r/min离心10min，收集上清液，利用4mol/L的盐酸调节上清液pH值至7.0，形成中和凝胶，5000rpm离心10分钟后得到固形物，用95％(v/v)酒精洗涤两次，低温干燥，得到粗多糖，称量，重量除以转化液体积得到β-1,3-葡聚糖含量。
本实施例所用产β-1,3-葡聚糖的菌株为土壤杆菌ATCC 31749菌株，但本发明所述产β-1,3-葡聚糖的菌株包括但不限于土壤杆菌ATCC 31749菌株。
实施例1
一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法，包括以下步骤：
S1.用接种铲从土壤杆菌ATCC 31749斜面培养基上取一铲接种于种子培养基中，于30℃、240r/min振荡培养20小时，得到活化的产β-1,3-葡聚糖的菌株种子培养液。
其中，所述种子培养基的组成为，蔗糖2％；(NH4)2HPO4 0.5％；KH2PO4 0.15％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.15％；pH调节至7.2；121℃灭菌20min。
S2.以5％接种量将二级种子培养液接入20吨罐定容16m3发酵培养基的发酵罐中培养，发酵温度30℃，起始pH7.0，通风量0.6v.v.m.，搅拌转速为150r/min，培养10小时，在发酵pH下降至5.4拐点之前通氧，通氧压力0.3Mp，通氧10min；当pH达到5.4时，停止发酵；培养菌体量达到7.58g/L。
其中，发酵液培养基的组成为蔗糖5.0％；(NH4)2HPO4 0.2％；KH2PO4 0.15％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.2％；pH调节至7.0；121℃灭菌20min。
S3.发酵结束后，将发酵罐中70％的高浓度菌体发酵液转移至20m3转化罐中，向剩余30％的发酵液中加入发酵培养基至初始发酵体积，再继续进行二次发酵，发酵结束后，再将70％的发酵液转入转化罐内；如此循环5-6次；
S4.向转化罐内分次流加糖液，进行全细胞转化：
首次流加时间为发酵液转入后1h内，糖液的加入量为初始发酵液体积的12％；
第二次流加时间为发酵液转入后30h，糖液的加入量为初始发酵液体积的12％；
第三次流加时间为发酵液转后42h，糖液的加入量为初始发酵体积的6％。
转化温度30℃，通风量0.35v.v.m.，搅拌转速为120r/min，糖液流加速度0.4m3/h，pH值维持在5.8，转化62小时，β-1,3-葡聚糖产量85g/L；碳源转化率70.8％；转化强度32.9g/L/d。
所用糖液为质量浓度为30％的蔗糖溶液。
实施例2
一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法，包括以下步骤：
S1.用接种铲从土壤杆菌ATCC 31749斜面培养基上取一铲接种于种子培养基中，于30℃、240r/min振荡培养20小时，得到活化的产β-1,3-葡聚糖的菌株种子培养液。
其中，所述种子培养基的组成为，蔗糖2％；(NH4)2HPO4 0.5％；KH2PO4 0.15％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.15％；pH调节至7.2；121℃灭菌20min。
S2.以5％接种量将二级种子培养液接入20吨罐定容16m3发酵培养基的发酵罐中培养，发酵温度30℃，起始pH7.0，通风量0.45v.v.m.，搅拌转速为180r/min，在发酵pH下降至5.4拐点之前通氧，通氧压力0.3Mp，通氧10min；当pH达到5.4时，停止发酵。培养菌体量达到7.82g/L。
其中，发酵液培养基的组成为蔗糖5.0％；(NH4)2HPO4 0.2％；KH2PO4 0.15％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.2％；pH调节至7.0；121℃灭菌20min。
S3.发酵结束后，将发酵罐中70％的高浓度菌体发酵液转移至20m3转化罐中，向剩余30％的发酵液中加入发酵培养基至初始发酵体积，再继续进行二次发酵，发酵结束后，再将70％的发酵液转入转化罐内；如此循环5-6次；
S4.向转化罐内分次流加糖液，进行全细胞转化：
首次流加时间为发酵液转入后1h内，糖液的加入量为初始发酵液体积的12％，补糖后加入5mg/L UMP促进代谢因子；
第二次流加时间为发酵液转入后30h，糖液的加入量为初始发酵液体积的12％；
第三次流加时间为发酵液转后42h，糖液的加入量为初始发酵体积的6％。
转化温度30℃，通风量0.35v.v.m.，搅拌转速为120r/min，糖液流加速度0.4m3/h，pH值维持在5.8，转化62小时，β-1,3-葡聚糖产量87g/L；碳源转化率72.5％；转化强度33.7g/L/d。
所用糖液为质量浓度为30％的蔗糖溶液。
实施例3
一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法，包括以下步骤：
S1.用接种铲从土壤杆菌ATCC 31749斜面培养基上取一铲接种于种子培养基中，于30℃、240r/min振荡培养20小时，得到活化的产β-1,3-葡聚糖的菌株种子培养液。
其中，所述种子培养基的组成为，蔗糖2％；(NH4)2HPO4 0.5％；KH2PO4 0.15％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.15％；pH调节至7.2；121℃灭菌20min。
S2.以5％接种量将二级种子培养液接入20吨罐定容16m3发酵培养基的发酵罐中培养，发酵温度30℃，起始pH7.0，通风量0.35v.v.m.，搅拌转速为180r/min，培养10小时，在发酵pH下降至5.4拐点之前通氧，通氧压力0.3Mp，通氧15min；当pH达到5.4时，停止发酵；培养菌体量达到7.63g/L。
其中，发酵液培养基的组成为蔗糖5.0％；(NH4)2HPO4 0.2％；KH2PO4 0.15％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.2％；pH调节至7.0；121℃灭菌20min。
S3.发酵结束后，将发酵罐中70％的高浓度菌体发酵液转移至20m3转化罐中，向剩余30％的发酵液中加入发酵培养基至初始发酵体积，再继续进行二次发酵，发酵结束后，再将70％的发酵液转入转化罐内；如此循环5-6次；
S4.向转化罐内分次流加糖液，进行全细胞转化：
首次流加时间为发酵液转入后1h内，糖液的加入量为初始发酵液体积的12％，补糖后加入6mg/L UMP促进代谢因子；
第二次流加时间为发酵液转入后30h，糖液的加入量为初始发酵液体积的12％；
第三次流加时间为发酵液转后42h，糖液的加入量为初始发酵体积的6％。
转化温度30℃，通风量0.35v.v.m.，搅拌转速为120r/min，糖液流加速度0.4m3/h，pH值维持在5.8，转化65小时，β-1,3-葡聚糖产量86g/L；碳源转化率71.7％；转化强度31.8g/L/d。所用糖液为质量浓度为30％的蔗糖溶液。
实施例4
一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法，包括以下步骤：
S1.用接种铲从土壤杆菌ATCC 31749斜面培养基上取一铲接种于种子培养基中，于28℃、150r/min振荡培养24小时，得到活化的产β-1,3-葡聚糖的菌株种子培养液。
其中，所述种子培养基的组成为，蔗糖1％；(NH4)2HPO4 1％；KH2PO4 0.5％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.5％；pH调节至7.2；121℃灭菌20min。
S2.以5％接种量将二级种子培养液接入20吨罐定容16m3发酵培养基的发酵罐中培养，发酵温度30℃，起始pH7.0，通风量0.65v.v.m.，搅拌转速为150r/min，培养10小时，在发酵pH下降至5.4拐点之前通氧，通氧压力0.5Mp，通氧15min；当pH达到5.4时，停止发酵。培养菌体量达到7.71g/L。
其中，发酵液培养基的组成为蔗糖5.0％；(NH4)2HPO4 0.2％；KH2PO4 0.15％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.2％；pH调节至7.0；121℃灭菌20min。
S3.发酵结束后，将发酵罐中80％的高浓度菌体发酵液转移至20m3转化罐中，向剩余20％的发酵液中加入发酵培养基至初始发酵体积，再继续进行二次发酵，发酵结束后，再将80％的发酵液转入转化罐内；如此循环5-6次；
S4.向转化罐内分次流加糖液，进行全细胞转化：
首次流加时间为发酵液转入后1h内，糖液的加入量为初始发酵液体积的7.5％；
第二次流加时间为发酵液转入后35h，糖液的加入量为初始发酵液体积的7.5％；
第三次流加时间为发酵液转后45h，糖液的加入量为初始发酵体积的5％。
转化温度30℃，通风量0.5v.v.m.，搅拌转速为120r/min，糖液流加速度0.5m3/h，pH值维持在5.5，转化58小时，β-1,3-葡聚糖产量82g/L；碳源转化率68.3％；转化强度33.9g/L/d。所用糖液为质量浓度为30％的蔗糖溶液。
实施例5
一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法，包括以下步骤：
S1.用接种铲从土壤杆菌ATCC 31749斜面培养基上取一铲接种于种子培养基中，于30℃、240r/min振荡培养20小时，得到活化的产β-1,3-葡聚糖的菌株种子培养液。
其中，所述种子培养基的组成为，蔗糖2％；(NH4)2HPO4 0.5％；KH2PO4 0.15％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.15％；pH调节至7.2；121℃灭菌20min。
S2.以5％接种量将二级种子培养液接入50L发酵罐定容30L发酵培养基的发酵罐中培养，发酵温度30℃，起始pH7.0，通风量0.45v.v.m.，搅拌转速为180r/min，培养10小时，在发酵pH下降至5.4拐点之前通氧，通氧压力0.3Mp，通氧10min；当pH达到5.4时，停止发酵。培养菌体量达到7.82g/L。
其中，发酵液培养基的组成为蔗糖5.0％；(NH4)2HPO4 0.2％；KH2PO4 0.15％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.2％；pH调节至7.0；121℃灭菌20min。
S3.发酵结束后，将发酵罐中70％的高浓度菌体发酵液转移至50L转化罐中，向剩余30％的发酵液中加入发酵培养基至初始发酵体积，再继续进行二次发酵，发酵结束后，再将70％的发酵液转入转化罐内；如此循环5-6次；
S4.向转化罐内分次流加糖液，进行全细胞转化：
首次流加时间为发酵液转入后1h内，糖液的加入量为初始发酵液体积的12％，补糖后加入5mg/L UMP促进代谢因子；
第二次流加时间为发酵液转入后30h，糖液的加入量为初始发酵液体积的12％；
第三次流加时间为发酵液转后42h，糖液的加入量为初始发酵体积的6％。
转化温度30℃，通风量0.35v.v.m.，搅拌转速为120r/min，糖液流加速度0.4m3/h，pH值维持在5.8，转化62小时，β-1,3-葡聚糖产量88g/L；碳源转化率73.3％；转化强度34.1g/L/d。所用糖液为质量浓度为30％的蔗糖溶液。
对比例1
用接种铲从土壤杆菌ATCC 31749斜面培养基上取一铲接种于种子培养基中，于30℃、240r/min振荡培养20小时，得到活化的产β-1,3-葡聚糖的菌株种子培养液。
其中，所述种子培养基的组成为，蔗糖2％；(NH4)2HPO4 0.5％；KH2PO4 0.15％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.15％；pH调节至7.2；121℃灭菌20min。
以5％接种量接种至50L发酵罐含30L发酵培养基中，发酵温度30℃，起始pH7.0，通风量0.45v.v.m.，搅拌转速为180r/min，在发酵pH下降至5.4拐点之前通氧，通氧压力0.3Mp，通氧10min；发酵时间96小时。其中发酵培养基的组成为蔗糖5.0％；(NH4)2HPO40.2％；KH2PO4 0.15％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.3％；玉米浆粉0.2％；pH 7.0；121℃灭菌20min。菌体量达到3.15g/L，β-1,3-葡聚糖产量32g/L；碳源转化率64％；发酵强度8.0g/L/d。
对比例2
用接种铲从土壤杆菌ATCC 31749斜面培养基上取一铲接种于种子培养基中，于30℃、240r/min振荡培养20小时，得到活化的产β-1,3-葡聚糖的菌株种子培养液。
其中，所述种子培养基的组成为，蔗糖2％；(NH4)2HPO4 0.5％；KH2PO4 0.15％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.15％；pH调节至7.2；121℃灭菌20min。
以5％接种量接种至50L发酵罐含30L发酵培养基中，发酵温度30℃，起始pH7.0，通风量0.45v.v.m.，搅拌转速为180r/min，在发酵pH下降至5.4拐点之前通氧，通氧压力0.3Mp，通氧10min；发酵时间96小时。其中发酵液培养基的组成为蔗糖8.0％；(NH4)2HPO40.15％；KH2PO4 0.2％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.15％；玉米浆粉0.2％；pH调节至7.0；121℃灭菌20min。菌体量达到3.20g/L，β-1,3-葡聚糖产量,48.9g/L；碳源转化率61.12％；发酵强度12.23g/L/d。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种利用细菌非生长耦联特性生产β-1,3-葡聚糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将产β-1,3-葡聚糖菌株进行活化，制备种子培养液；
S2.将种子培养液接入发酵培养基中，进行发酵培养；
发酵培养温度为28～32℃，起始pH7.0，搅拌转速120～200r/min，通风量0.35～0.65v.v.m，在发酵pH下降至5.4拐点之前通氧，通氧压力0.3～0.5Mp，通氧10～15min；待发酵液细胞浓度>7.5g/L时，停止发酵；
S3.发酵结束后，将60～80％的发酵液转入转化罐内；向剩余20～40％的发酵液中加入发酵培养基至初始发酵体积，再继续进行二次发酵，发酵结束后，再将60～80％的发酵液转入转化罐内；如此循环5～6次；
S4.向转化罐内分次流加糖液，进行全细胞转化：
首次流加时间为发酵液转入后1h内；
第二次流加时间为发酵液转入后30～35h；
第三次流加时间为发酵液转后40～45h；
转化温度28～32℃，搅拌转速120～200r/min，通风量0.3～0.5v.v.m，糖液流加速度0.4～0.5m3/h，pH值维持在5.5～6.0，转化总时间为58～65h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述产β-1,3-葡聚糖菌株为土壤杆菌ATCC31749。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，制备种子培养液所用种子培养基的组成：以质量百分比计，蔗糖1.0～2.0％；(NH4)2HPO4 0.5～1.0％；KH2PO40.15～0.2％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO3 0.3％；玉米浆粉0.15～0.5％；pH调节至7.2；
28～32℃、150～240r/min振荡培养16～24小时，得到种子培养液。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，发酵培养基的组成为：以质量百分比计，蔗糖5.0％；(NH4)2HPO4 0.5～1.0％；KH2PO4 0.15～0.2％；MgSO4·7H2O 0.1％；CaCO30.15％；玉米浆粉0.1～0.5％；pH调节至7.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流加糖液的总体积为初始发酵体积的20-40％；
首次流加时，糖液的加入量为初始发酵液体积的7.5-15％；
第二次流加时，糖液的加入量为初始发酵液体积的7.5-15％；
第三次流加时，糖液的加入量为初始发酵体积的5-10％。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，首次流加时还添加3-6mg/LUMP促进代谢因子。
7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述糖液为质量浓度为20-50％的蔗糖溶液。
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