CN112921056B - 一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法，包括：S1：酿酒酵母发酵产乙醇，发酵液去除乙醇后的糖液作为产纤维素酶促进剂；S2：将里氏木霉接种到发酵培养基中，进行发酵培养，发酵过程中，向发酵体系中添加产纤维素酶促进剂，发酵获得纤维素酶。与现有技术相比，本发明利用酿酒酵母发酵产乙醇所得发酵液去除乙醇后的糖液作为产纤维素酶促进剂，所述产纤维素酶促进剂不仅能够解除纤维素酶发酵过程中代谢产物阻遏作用，提高纤维素酶活性，同时能够实现纤维素酶和乙醇的联产，从实质上降低纤维素乙醇工艺中纤维素酶成本高的问题。

Description

一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，尤其是涉及一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法。
背景技术
目前，世界各国都在积极研究利用非粮食手段生产生物燃料，用以解决日益严重的能源危机、气候问题以及粮食短缺问题。木质纤维素作为地球上储量最丰富的多糖类物质，利用其生产燃料乙醇已成为各国研究的热点领域。
但由于木质纤维素结构致密复杂，大多数微生物并不能将其作为直接碳源来生产乙醇，只有将其水解成可发酵单糖类物质后，才能被微生物利用。酶解法由于其反应条件温和、效率高、能耗低、选择性强以及环保效果好等优点，被广泛应用于纤维素水解过程中。酶解法水解纤维素的工艺对纤维素酶的需求量很大，纤维素酶成本较高，这也是制约纤维素乙醇产业化的关键瓶颈。目前纤维素酶一般是采用特定菌株对生物质进行发酵来获得。例如申请号CN201310431838.1的中国专利公开了采用乳酸菌和复合霉菌两段发酵金针菇菌糠生产纤维素酶的技术方案，而申请号CN201510267129.3的中国专利则公开了利用一种巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)经过诱导培养基振荡培养高效表达而得到纤维素酶的方法。
纤维素酶属于诱导酶，其发酵过程同时受到诱导物的诱导调控和产物的反馈抑制调控两方面的作用。葡萄糖是其主要的反馈抑制物；高效的诱导物对其高产纤维素酶具有重要作用。纤维素是纤维素酶重要的诱导物，但纤维素不溶于水，因此，开发高效的可溶性诱导促进剂对产酶的提高具有重要的实际意义。
发明内容
为了提高纤维素酶活性，降低产酶成本，本发明开发出一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法。
本发明提出诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法，通过发酵工艺改进，不仅能使纤维素酶发酵液酶活得到提高，而且在生产纤维素酶的同时，还同时联产乙醇，使得纤维素酶生产成本得到实质性降低。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明提供一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法，包括：
S1：酿酒酵母发酵产乙醇，发酵液去除乙醇后的糖液作为产纤维素酶促进剂；
S2：将里氏木霉(Trichoderma reesei)作为发酵菌种接种到发酵培养基中，进行发酵培养，发酵过程中，向发酵体系中添加产纤维素酶促进剂，发酵获得纤维素酶。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，所述发酵培养基为含有可被里氏木霉利用的碳源和氮源的培养基。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，所述发酵培养基中含有的碳源为葡萄糖，所述发酵培养基中含有的氮源为尿素或硝酸铵。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，所述发酵培养基的配方如下：葡萄糖10g/L±10％，纤维素粉20g/L±10％，蛋白胨10g/L±10％，磷酸二氢钾1g/L±10％，硫酸镁0.2g/L±10％，锰离子0.01g/L-1g/L，铁离子0.01/L-1g/L，尿素5g/L±10％，pH 5.0-6.0。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，所述发酵培养基制备方法为：按照发酵培养基的配方称量各组分，溶于去离子水中，120℃以上灭菌15min～40min。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，进行发酵培养的条件为：温度25℃-32℃、pH3.5-5.5、通气量0.2-2vvm，发酵罐压力0.03MPa-0.08Mpa。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，向发酵体系中添加产纤维素酶促进剂的时机为：待发酵至15～30h开始添加产纤维素酶促进剂，发酵总时间为72～230h。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，向发酵体系中添加产纤维素酶促进剂的方式为：流加产纤维素酶促进剂，产纤维素酶促进剂流速控制在每小时0.1～10mL/h/l。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，里氏木霉在发酵培养基中的初始接种体积浓度为5～15％，优选为10％。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，实时监控发酵培养基的pH和通气量，通过20wt％的碳酸钠溶液流加控制发酵培养基的pH保持在3.5-5.5之间，通过偶联搅拌器搅拌，其转速为150r/min-600r/min，使通气量在0.2-2vvm。
在本发明的一个实施方式中，步骤S2中，所述里氏木霉(Trichoderma reesei)选择保藏编号为CGMCC NO.17798的里氏木霉(Trichoderma reesei)。其中保藏编号为CGMCCNO.17798的里氏木霉(Trichoderma reesei)，命名为ZR/TR-UV-3，保藏机构为：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2019年06月13日，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。保藏编号为CGMCC NO.17798的里氏木霉(Trichoderma reesei)曾在专利CN110205250A中记载过。
在本发明的一个实施方式中，步骤S1中，酿酒酵母发酵产乙醇的培养基为：含有玉米淀粉、水、盐酸、NaOH、玉米浆的培养基。
在本发明的一个实施方式中，步骤S1中，酿酒酵母发酵产乙醇的培养基为：玉米淀粉、水、浓硫酸按20:100:0.5(v/v/v)的比例混合，搅拌条件下140℃高温处理30min，处理完后用20％NaOH调pH至4.0-6.0，然后向其中加入0.5％(v/v)玉米浆，120℃灭菌20min处理。
在本发明的一个实施方式中，步骤S1中，酿酒酵母发酵产乙醇的条件为：向培养基中加入0.1％(w/v)酿酒酵母，30-34℃厌氧发酵，待发酵液葡萄糖浓度降至1-2％(w/v)时停止发酵。
在本发明的一个实施方式中，步骤S1中，酿酒酵母发酵产乙醇后的发酵液(即酵母发酵后的玉米淀粉稀酸水解液)进行蒸馏处理，馏出物为乙醇，去除乙醇后的糖液作为产纤维素酶促进剂。
在本发明的一个实施方式中，诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法，具体包括以下步骤：
(1)产纤维素酶促进剂及乙醇的制备及与乙醇的联产
玉米淀粉、水、浓盐酸按20:100:0.5(v/v/v)的比例混合，搅拌条件下140℃高温处理30min，处理完后用20％NaOH调pH至4.0-6.0；
向其中加入0.5％(v/v)玉米浆，120℃灭菌20min，待温度降至30℃后，向其中加入0.1％(w/v)酿酒酵母，30-34℃厌氧发酵，待发酵液葡萄糖浓度降至1-2％(w/v)时停止发酵，将发酵液中乙醇进行蒸馏处理，获得蒸馏后去除乙醇的糖液和乙醇，此糖液即为后续产纤维素酶促进剂，此过程与后续纤维素酶发酵过程结合即实现了纤维素酶与乙醇的联产工艺过程；
(2)配制产纤维素酶发酵培养基
葡萄糖10g/L±10％，纤维素粉20g/L±10％，蛋白胨10g/L±10％，磷酸二氢钾1g/L±10％，硫酸镁0.2g/L±10％，尿素5g/L±10％，pH5.0-6.0，在10L发酵罐中于121℃灭菌20min。
(3)将里氏木霉接种到盛装有上述发酵培养基的发酵罐内进行发酵培养180h：
当含里氏木霉的种液菌浓为90％时，以10％的接种量(v/v)接种于10L发酵罐中，发酵罐培养基装液量为7L，发酵条件为：温度25℃-32℃(自控)，pH3.5-5.5(以20％碳酸钠溶液流加在线实时调节)，搅拌转速(在线实时调节)150r/min-600r/min，通气量5-15L/min，罐压0.03MPa-0.08MPa。
与现有技术相比，本发明利用酿酒酵母发酵产乙醇所得发酵液去除乙醇后的糖液作为产纤维素酶促进剂，所述产纤维素酶促进剂不仅能够解除纤维素酶发酵过程中代谢产物阻遏作用，提高纤维素酶活性，同时能够实现纤维素酶和乙醇的联产，从实质上降低纤维素乙醇工艺中纤维素酶成本高的问题。
附图说明
图1为实施例2中产纤维素酶促进剂添加与否的纤维素酶酶活情况。
具体实施方式
在本发明的一个实施方式中，诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法，具体包括以下步骤：
(1)产纤维素酶促进剂及乙醇的制备及与乙醇的联产
玉米淀粉、水、浓盐酸按20:100:0.(5v/v/v)的比例混合，搅拌条件下140℃高温处理30min，处理完后用20％NaOH调pH至4.0-6.0；
向其中加入0.5％(v/v)玉米浆，120℃灭菌20min，待温度降至30℃后，向其中加入0.1％(w/v)酿酒酵母，30℃厌氧发酵，待发酵液葡萄糖浓度降至1-2％(w/v)时停止发酵，将发酵液中乙醇进行蒸馏处理，获得蒸馏后去除乙醇的糖液和乙醇，此糖液即为后续产纤维素酶促进剂，此过程与后续纤维素酶发酵过程结合即实现了纤维素酶与乙醇的联产工艺过程；
(2)配制产纤维素酶发酵培养基
葡萄糖10g/L±10％，纤维素粉20g/L±10％，蛋白胨10g/L±10％，磷酸二氢钾1g/L±10％，硫酸镁0.2g/L±10％，尿素5g/L±10％，pH5.0-6.0，在10L发酵罐中于121℃灭菌20min。
(3)将里氏木霉接种到盛装有上述发酵培养基的发酵罐内进行发酵培养180h：
当含里氏木霉的种液菌浓为90％时，以10％的接种量(v/v)接种于10L发酵罐中，发酵罐培养基装液量为7L，发酵条件为：温度25℃-32℃(自控)，pH3.5-5.5(以20％碳酸钠溶液流加在线实时调节)，搅拌转速(在线实时调节)150r/min-600r/min，通气量5-15L/min，罐压0.03MPa-0.08MPa。
本发明还提供纤维素酶含量、乙醇含量以及葡萄糖含量的测定方法，具体如下：
(1)纤维素酶含量的测定方法
参考中华人民共和国能源行业标准NB/T 13005—2016《用于生物燃料乙醇制备的纤维素酶酶活力测定方法》中规定的方法测定纤维素酶活力。
(2)乙醇含量的测定方法
参考GB 5009.225-2016《食品安全国家标准—酒中乙醇浓度的测定》中气相色谱法测定乙醇。
(3)葡萄糖的测定方法
参考GB/T 20880-2007《食用葡萄糖》中液相色谱法测定。
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
以下实施例中：
1)实验材料：
里氏木霉(Trichoderma reesei，CGMCC NO.17798)，其中保藏编号为CGMCCNO.17798的里氏木霉(Trichoderma reesei)，命名为ZR/TR-UV-3，保藏机构为：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2019年06月13日，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
酿酒酵母，购自安琪酵母股份有限公司。
2)主要仪器和设备：
10L液体发酵罐：上海宝兴公司；
液相色谱仪：安捷伦科技(中国)有限公司；
紫外分光光度计：上海谱元仪器有限公司。
3)产纤维素酶促进剂
玉米淀粉、水、浓盐酸按20:100:0.5(v/v/v)的比例混合，搅拌条件下140℃高温处理30min，处理完后用20％NaOH调pH至4.0-6.0。向其中加入0.5％(v/v)玉米浆，120℃灭菌20min，待温度降至30℃后，向其中加入0.1％(w/v)酿酒酵母，30-34℃厌氧发酵，待发酵液葡萄糖浓度降至1-2％(w/v)时停止发酵，将发酵液中乙醇进行蒸馏处理，获得蒸馏后去除乙醇的糖液(此即产纤维素酶促进剂)。
4)基础发酵培养基：
葡萄糖10g/L，纤维素粉20g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，pH5.5，在10L发酵罐中于121℃灭菌20min。
5)发酵控制条件：当含里氏木霉的种液菌浓为90％时，以10％的接种量(v/v)接种于10L发酵罐中，发酵罐培养基装液量为7L，发酵条件为：温度28-30℃(自控)，pH4.5-5.0(以20％碳酸钠溶液流加自控)，搅拌转速400r/min，通气量5L/min，罐压0.05MPa。
以下实施例中的各条件，均按照上述要求设置或作了特殊说明，如未作特别说明的其他条件，则均为本领域技术人员所熟知的技术条件。
实施例1
本实施例提供一种纤维素酶促进剂的制备方法：
向20L哈氏合金反应釜中加入3kg玉米淀粉与10L水充分混合，加入63mL浓盐酸后充分搅拌，升温至135℃，保温60min，降温后，取出7L反应液于10L不锈钢发酵罐中，加入35mL玉米浆，118℃高温灭菌20min，灭完菌后，通入降温水，待温度降至30℃后，向罐中加入21g酿酒酵母，搅拌转速120r/min，发酵48h，测定发酵液葡萄糖浓度为1.0g/100mL，停止发酵。将发酵液移入蒸馏烧瓶中，40℃进行减压蒸馏，待乙醇全部蒸馏完毕后，剩余酵母发酵糖液即为产纤维素酶促进剂。
在产酶过程中用产纤维素酶促进剂进行流加，可提高纤维素酶活性，此过程同时实现纤维素酶和乙醇的联产。
实施例2
本实施例提供一种流加产纤维素酶促进剂发酵纤维素酶的方法。
(1)选择两个10L不锈钢发酵罐进行纤维素酶发酵，其中一罐作为对照组，发酵过程不流加产酶促进剂，另一罐为实验组，发酵过程流加产纤维素酶促进剂
(1)配制产纤维素酶发酵培养基：葡萄糖10g/L，纤维素粉20g/L，蛋白胨10g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁0.2g/L，pH6.5，在10L发酵罐中于121℃灭菌20min。
(2)接入沉降量已达到90％的里氏木霉种液，接种量10％，温度30℃(自控)，pH5.5-6.0(以20％碳酸钠溶液流加自控)，搅拌转速300r/min，通气量7.5L/min，罐压0.03MPa。
(3)发酵30h时，开始流加产纤维素酶促进剂(制备方法见实施例1)，流加速率0.3mL/min，发酵180h结束。
两罐产纤维素酶结果对比如图1所示，从图1可以看出，未添加产酶促进剂组180h纤维素酶活179.2U/mL，采用本纤维素酶促进剂，180h实验组纤维素酶活性为230.1U/mL，比对照组提高28.4％。因此，说明产纤维素酶促进剂不仅能够解除纤维素酶发酵过程中代谢产物阻遏作用，提高纤维素酶活性，同时能够实现纤维素酶和乙醇的联产，从实质上降低纤维素乙醇工艺中纤维素酶成本高的问题。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法，其特征在于，包括：
S1：酿酒酵母发酵产乙醇，发酵液去除乙醇后的糖液作为产纤维素酶促进剂；
S2：将里氏木霉接种到发酵培养基中，进行发酵培养，发酵过程中，向发酵体系中添加产纤维素酶促进剂，发酵获得纤维素酶；
步骤S1中，玉米淀粉、水、浓盐酸按20:100:0.5（v/v/v）的比例混合，搅拌条件下140℃高温处理30min，处理完后用20% NaOH 调pH至4.0-6.0；向其中加入0.5%（v/v）玉米浆，灭菌，待温度降至30℃后，向其中加入0.1%（w/v）酿酒酵母，30-34℃厌氧发酵，待发酵液葡萄糖浓度降至1-2%（w/v）时停止发酵，将发酵液中乙醇进行蒸馏处理，获得蒸馏后去除乙醇的糖液和乙醇，此糖液即为后续产纤维素酶促进剂；
步骤S2中，向发酵体系中添加产纤维素酶促进剂的时机为：待发酵至15~30h开始添加产纤维素酶促进剂，发酵总时间为72~230h；
步骤S2中，向发酵体系中添加产纤维素酶促进剂的方式为：流加产纤维素酶促进剂，产纤维素酶促进剂流速控制在0.1~10mL/h/l。
2.根据权利要求1所述的一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法，其特征在于，步骤S2中，所述发酵培养基中含有的碳源为葡萄糖，所述发酵培养基中含有的氮源为尿素或硝酸铵。
3.根据权利要求1所述的一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法，其特征在于，步骤S2中，所述发酵培养基的配方如下：葡萄糖10g/L±10%，纤维素粉20g/L±10%，蛋白胨10g/L±10%，磷酸二氢钾1g/L±10%，硫酸镁0.2g/L±10%，锰离子0.01g/L-1g/L，铁离子0.01/L-1g/L，尿素5g/L±10%，pH 5.0-6.0。
4.根据权利要求1所述的一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法，其特征在于，步骤S2中，所述发酵培养基制备方法为：按照发酵培养基的配方称量各组分，溶于去离子水中，120℃以上灭菌15min~40min。
5.根据权利要求1所述的一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法，其特征在于，步骤S2中，进行发酵培养的条件为：温度25℃-32℃、pH3.5-5.5、通气量0.2-2vvm，发酵罐压力0.03MPa-0.08Mpa。
6.根据权利要求1所述的一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法，其特征在于，步骤S2中，里氏木霉在发酵培养基中的初始接种体积浓度为5~15%。
7.根据权利要求1所述的一种诱导物控制的连续产纤维素酶并联产乙醇的方法，其特征在于，步骤S2中，实时监控发酵培养基的pH和通气量，通过碳酸钠溶液流加控制发酵培养基的pH保持在3.5-5.5之间，通过偶联搅拌器搅拌，使通气量在每小时0.1~10mL/l。
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