CN106520634B - 一种根瘤菌及其在海藻糖制备中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种根瘤菌及其在海藻糖制备中的应用，属于生物工程和酶工程领域。本发明得到了一株表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶的根瘤菌，该菌所产麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶最适温度分别为45℃和50℃，在55℃下水浴30h残留酶活菌依然高于50％，两者的最适pH都为7.0，在pH5.0‑9.0具有良好的稳定性。用该菌生产的麦芽寡糖基海藻糖合成酶及水解酶制备海藻糖，具有反应温度范围广、低能耗、物料成本低的优势。

Description

一种根瘤菌及其在海藻糖制备中的应用
技术领域
本发明涉及一种根瘤菌及其在海藻糖制备中的应用，属于生物工程和酶工程领域。
背景技术
海藻糖(Trehalose，α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside)是一种化学性质非常稳定的非还原性双糖，无色无嗅，由2个葡萄糖分子通过α,α-1,1糖苷键结合而成，具有保护生物细胞和生物活性物质免除冷冻、高温、脱水、干旱、有毒试剂及高渗透压等失去活性的功能，可应用于作物育种、食品、药品、精细化工及生物制品等领域。20世纪90年代初，海藻糖的制备方法主要是提取法和微生物发酵法，随着一些可生成海藻糖的新型酶制剂的发现，酶催化法成为研究的热点。
双酶法以淀粉为底物通过麦芽寡糖基海藻糖合成酶以及麦芽寡糖基海藻糖水解酶的作用生成海藻糖，因其底物相对廉价并且转化率高达80％以上，可在一定程度上降低了海藻糖的生产成本并极大的推动了海藻糖的工业化生产进程，获得青睐。
淀粉经过高温液化后加入支链淀粉酶作用生成麦芽糊精，麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α-1,4-糖苷，产生α-1,4-糖苷键到α,α-1,1-糖苷键的分子内转糖苷作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖水解酶则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α-1,4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。
双酶法生产海藻糖以可溶性淀粉为底物，具有低成本的优点，据文献报道的根瘤菌来源的麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶的催化反应最适温度为40-45℃，pH7，转化率为60％，由于催化生产海藻糖的反应时间在30h左右，容易引起菌污染，提高了工业化成本。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶生产菌株，所述菌株的分类命名为根瘤菌(Rhizobium Sp.)WSH16-03，于2016年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M2016657，保藏地址为中国武汉武汉大学。
所述菌株是从面粉厂附近土壤中经菌株富集、平板初筛，采用一级发酵逐一摇瓶培养，经酶活测定，比较麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶活性大小而得到。
所述菌株所产的麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶最适温度分别为45℃和50℃，在55℃下水浴30h残留酶活菌依然高于50％，两者的最适pH都为7.0，在pH5.0-9.0具有良好的稳定性。
本发明的第二个目的是提供一种利用所述菌株生产海藻糖的方法，所述方法是以该菌发酵所得麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶为催化剂，以可溶性淀粉为底物，通过协同作用催化生产海藻糖。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：以15％(W/V)的可溶性淀粉为底物，加入所述菌株发酵得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶，在pH 6.0～7.0、55℃下反应30-40h。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶是本发明菌株经种子培养和液体发酵生产得到的麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶的粗酶液。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，反应是在振荡条件下进行的。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，pH使用氢氧化钠水溶液进行调节。
本发明的第三个目的是提供一种利用所述根瘤菌生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，所述方法以根瘤菌(Rhizobium Sp.)为生产菌株，经种子培养和液体发酵得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶。
所述种子培养，在本发明的一种实施方式中，其种子培养基配方为蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％、pH 7.0，培养条件为：30℃、摇瓶转速200rpm、培养10～14h。
所述液体深层发酵，在本发明的一种实施方式中，是在发酵培养基(低聚麦芽糖2％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.2％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO40.05％，pH 7.0)中，于30℃、200rpm发酵2～3d。
本发明筛选得到了一株表达麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶的根瘤菌，该菌所产麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶最适温度分别为45℃和50℃，在55℃下水浴30h残留酶活菌依然高于50％，两者的最适pH都为7.0，在pH5.0-9.0具有良好的稳定性。用该菌生产的麦芽寡糖基海藻糖合成酶及水解酶制备海藻糖，具有反应温度范围广、低能耗、物料成本低的优势，在较高底物浓度下仍能得到高底物转化率，比同来源的提高了10％，特别是在高温55℃条件下仍能正常反应，可以避免糖类物质为底物时反应体系容易染菌现象，为工业化放大生产奠定基础。
生物材料保藏
根瘤菌(Rhizobium Sp.)WSH16-03，于2016年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M2016657，保藏地址为中国武汉武汉大学。
具体实施方式
(1)麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活测定：
将10μL适量稀释的酶液加至190μL 1％麦芽六糖底物中，50℃反应10min左右，煮沸10min，离心，取100μL上清、900μL水以及1mL DNS于10mL具塞试管中，煮沸7min，加8mL水，540nm，测吸光度。麦芽寡糖基海藻糖合成酶的酶活定义为：每1min水解1μmol麦芽六糖生成麦芽四糖基海藻糖所需的酶量。
(2)麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活测定：
底物处理：1％麦芽六糖490μL加入10μL麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶液，45℃处理2h，煮沸10min离心。
酶反应：10μL酶液加至190μL底物，50℃反应10min，煮沸10min，离心，将100μL上清液及900μL水，1mL DNS加至10mL具塞试管中煮沸7min后冰水浴，再加入8mL水混匀，540nm，测吸光度。麦芽寡糖基海藻糖水解酶的酶活定义为：每1min水解麦芽四糖基海藻糖生成1μmol海藻糖所需的酶量。
(3)HPLC检测酶转化产物：
取样煮沸10min灭酶，取上清液适度稀释后12000rpm离心10min，并进行HPLC分析。色谱条件如下：Hypersil NH2，(4.6×250)mm，填料粒径5μm；示差折光检测器；流动相：V(乙腈)：V(水)＝75:25；柱温40℃；进样量：10μL；流速0.8mL/min。
实施例1菌株的筛选
从3家面粉厂附近分别采集土样5份，共15份样品。分别称取少量样品，放入烘箱60℃热处理30min，然后称取样品1g加入100mL肉汤蛋白胨液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养36h，富集菌株；然后将富集后的菌液装入50mL无菌水的小三角瓶中，静置20min，取0.1mL上清液梯度稀释(10-4，10-5，10-6)涂布于含有平板分离培养基的麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶筛选平板上，30℃培养箱中培养2天，挑取大小、形状、颜色不一的具有典型特征的单菌落在固体肉汤蛋白胨培养基上划线分离，反复3次进行初筛。
首先，将上述单菌落进行平板划线分类纯化，并接种斜面保存备用。然后接种到发酵培养基中进行液体振荡培养。培养温度为30℃，摇床转速为200rpm，培养时间为2-3d。培养液经过12000rpm离心5min，去除上清液，留存的菌体重悬后超声破壁，离心，取上清液进行酶活测定。选取酶活高的菌株进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高酶活的麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶产生菌株。纯化的菌株接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，4℃保藏，保藏编号为CCTCC NO:M2016657。
实施例2发酵产酶
从斜面上刮取一环菌种CCTCC NO:M2016657，置于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在30℃，200rpm条件下振荡培养10h。以2.5％接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中进行发酵培养。条件为培养时间2-3d，温度30℃，摇床转速200rpm。经测定，发酵上清液中，麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活为61.7U/mL，麦芽寡糖基海藻糖水解酶酶活为132.5U/mL，最适温度分别为45℃和50℃，在55℃下水浴30h残留酶活菌依然高于50％，两者的最适pH都为7.0，在pH5.0-9.0具有良好的稳定性。
肉汤蛋白胨培养基：肉汤0.3％，蛋白胨0.5％，pH7.0；
平板分离培养基：麦芽低聚糖5.0％，蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，K2HPO40.2％，MgSO4.7H2O 0.05％，琼脂2％，pH7.0；
种子培养基：蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，pH 7.0；
发酵培养基：麦芽低聚糖2％，蛋白胨0.5％，牛肉膏0.2％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO40.05％，pH7.0。
实施例3：海藻糖的制备
酶法生产工艺：
用浓度为15％(W/V)的可溶性淀粉经液化，加入麦芽寡糖基海藻糖合成酶40U/g可溶性淀粉及麦芽寡糖基海藻糖水解酶60U/g可溶性淀粉，并且加入5U/g可溶性淀粉的普鲁兰酶，pH 6.0-7.0，55℃恒温水浴摇床，150rpm，反应30-40h。HPLC检测酶转化产物。
结果表明，转化率高达70.2％，由于反应温度为55℃，温度较高，可使得含大量糖的反应体系免遭菌污染的影响，提高酶转化效率，简化工艺，促进海藻糖制备工业化的进程。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一种根瘤菌(Rhizobium Sp.)WSH16-03，于2016年11月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M2016657，保藏地址为中国武汉武汉大学。
2.一种利用权利要求1所述根瘤菌(Rhizobium Sp.)WSH16-03生产海藻糖的方法，其特征在于，是以该菌发酵所得麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶为催化剂，以可溶性淀粉为底物，通过协同作用催化生产海藻糖。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括：以15％(W/V)的可溶性淀粉为底物，加入根瘤菌(Rhizobium Sp.)WSH16-03发酵得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶，在pH6.0～7.0、55℃下反应30-40h。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶是根瘤菌(Rhizobium Sp.)WSH16-03经种子培养和液体发酵生产得到的麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶的粗酶液。
5.根据权利要求2～4任一所述的方法，其特征在于，反应是在振荡条件下进行的。
6.一种利用权利要求1所述根瘤菌(Rhizobium Sp.)WSH16-03生产麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶的方法，其特征在于，经种子培养和液体发酵得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶及麦芽寡糖基海藻糖水解酶。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，种子培养基配方为蛋白胨1％、酵母粉0.5％、氯化钠1％、pH7.0，培养条件为：30℃、摇瓶转速200rpm、培养10～14h。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，发酵培养基配方为低聚麦芽糖2％、蛋白胨0.5％、牛肉膏0.2％、K2HPO4 0.1％、NaH2PO4 0.1％，MgSO4 0.05％，pH7.0；于30℃、200rpm发酵2～3d。
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