CN104342483B - 一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种酶的筛选方法，特别涉及一种卤醇脱卤酶的筛选方法。用pH显色经过初筛和复筛两步法来筛选高酶活的卤醇脱卤酶。本发明使用深孔板进行微型化培养，实现了高通量培养和粗酶液的高通量制备；突破性的利用pH的变化来筛选高酶活的卤醇脱卤酶，效率高，成本低、速度快；消耗的培养基和试剂少；本发明使得可机械化自动化操作以实现，借助自动化的高通量筛选仪器可以进一步大幅度降低劳动量，提高筛选通量。

Description

一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法

技术领域

本发明涉及一种酶的筛选方法，特别涉及一种卤醇脱卤酶的筛选方法。

背景技术

卤醇脱卤酶（halohydrin dehalogenase,HHDH）是一种具有催化活性的水解酶，能够可逆性作用于邻羟基卤化物（邻卤醇）形成环氧化物及环氧化物的开环。

环氧化物被公认为有机合成中最重要、应用最广泛的合成中间体之一，环氧化物手性合成和开环对于手性药物的合成非常重要。例如阿托伐他汀钙的侧链中间体A5（(R)‐4‐氰基‐3‐羟基丁酸乙酯）的酶法合成中，就是利用卤醇脱卤酶作为生物催化剂。

天然的卤醇脱卤酶在工业化过程中存在生产成本高、酶活低、稳定性差等现象，制约了这类酶在大规模生产中的应用，通过筛选得到高酶活的卤醇脱卤酶是降低生产成本的重要方法之一。定点突变在卤醇脱卤酶的改造中扮演着重要的角色，通过此手段已对该类酶的某些特性如稳定性、转换数及对应体选择性等进行了改造，并获得了一些好的突变体。但该方法存在筛选容量过大、筛选过程复杂，且费用昂贵、费时费力等特点。

目前，卤醇脱卤酶的筛选主要利用气相色谱（GC）检测产物的生成量来计算酶活的值，从而筛选到酶活较高的卤醇脱卤酶，如专利US7588928中，就是用这种方法进行筛选的。但在筛选过程中由于突变体很多，使用的仪器和检测费用昂贵、过程复杂且费时费力，不利于大规模的推广使用。

在利用卤醇脱卤酶催化的过程中，反应体系中由于有HCl的生成，pH会逐渐减小，pH的变化速率与反应的快慢有直接的关系，在相同条件下，而反应的快慢与酶活的大小直接相关。因此，可以利用反应体系pH的变化速率来快速筛选具有高酶活的卤醇脱卤酶。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有筛选卤醇脱卤酶的方法成本高及工作量大和周期长的不足等问题。

实现本发明目的的技术方案是本发明提供了一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法，是基于深孔板的微型化培养与基于pH耦联变化的筛选方法。具体的方法如下：

取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落，经稀释菌浓度后接种于装有液体培养基的深孔板的孔中，每个孔有一个特定的编号；于30～40℃温度下，180～220rpm的摇床中培养4～10h；然后加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷），于28～35℃温度下、180～220rpm的摇床中继续培养10～20h；将深孔板重复进行超低温冷冻后室温融化；将深孔板离心处理5～30min；深孔板的深孔中的上清液为粗酶液。以微量化梯度稀释法将粗酶液稀释待测。取反应管，加入反应底物，去离子水和pH指示剂，加入稀释的待测粗酶液，以原始的卤醇脱卤酶作为对照，于30～70℃水浴中反应10～30min，根据反应过程中体系颜色的变化情况进行初筛，根据初步测定结果，选择对应的克隆进行摇瓶复筛，复筛时在反应体系中加入反应底物、去离子水，用pH计在线监测体系的pH变化，加入稀释的待测粗酶液，以原始的卤醇脱卤酶作对照，于30～70℃水浴反应10～30min，根据反应过程中体系pH变化速度的快慢筛选出高酶活的卤醇脱卤酶。

初筛时，反应初时体系的颜色为蓝紫色，随着反应的进行，pH下降，体系的颜色由蓝紫变为紫色，后来变为黄色。筛选出比对照颜色变化快的卤醇脱卤酶单菌落进行复筛。

复筛：在初筛出的卤醇脱卤酶单菌落中筛选出，在复筛开始后单位时间内pH变化量比作为对照的原始的卤醇脱卤酶快的卤醇脱卤酶单菌落，即为高酶活的卤醇脱卤酶。

本发明进一步的方案：

挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落，适当稀释菌浓度，接种于装有液体培养基的深孔板的孔中，每一孔由板号、行号和列号的组合标记，使每个孔有一个特定的编号。盖上深孔板的三明治盖子，于30～40℃、180～220rpm摇床培养4～10h。加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷），于28～35℃、180～220rpm摇床继续培养10～20h。结束后把深孔板放入‐80℃超低温冰箱，待温度稳定后从超低温冰箱中拿出深孔板至室温融化，然后再按以上过程2遍或2遍以上冻融菌体细胞。将深孔板放置于孔板离心机，5000～10000×g离心5～30min。深孔板的深孔中的上清液为粗酶液。以微量化梯度稀释法将粗酶液适当稀释。在反应管中加入反应底物、去离子水和pH指示剂，加入稀释的待测粗酶液，以原始的卤醇脱卤酶作对照，于30～70℃水浴反应10～30min，根据反应过程中体系颜色的变化情况进行筛选，根据初步测定结果，选择对应的克隆进行摇瓶复筛，获得高酶活的卤醇脱卤酶。

复筛时在反应体系中加入反应底物、去离子水，用pH计在线监测体系的pH变化，加入稀释的待测粗酶液，以原始的卤醇脱卤酶作对照，于30～70℃水浴反应10～30min，根据反应过程中体系pH变化速度的快慢筛选出高酶活的卤醇脱卤酶。

卤醇脱卤酶的单克隆菌落，来自于对原始基因序列进行人工定点突变后获得的单克隆菌落突变体，或是对原始基因序列进行随机突变后获得的单克隆菌落突变体，或是未经突变的含卤醇脱卤酶的菌落。

采用微量化梯度稀释法稀释菌浓度的具体步骤为：用带滤芯的无菌移液吸头以8通道移液器，自深孔板的A1～H1孔中吸取0.1mL卤醇脱卤酶粗酶液，移至装有0.9mL无菌生理盐水的深孔板的A2～H2孔中，振荡混匀，再用8通道移液器吸取0.1mLA2～H2，对应地移至深孔板A3～H3深孔中，如此逐级稀释至适当浓度。

所述液体培养基为：蛋白胨8～15g/L、酵母粉2～10g/L、甘油8～15g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、硫酸镁0.1～0.5g/L，pH7.0、0.1MPa灭菌30min。

上述的深孔板可以是：6孔板、12孔板、24孔板、48孔和96孔板。深孔板的三明治盖，是从上依次由带孔的不锈钢盖子、除菌微滤膜片和硅胶孔垫三层组成，不锈钢盖子和硅胶孔垫上的孔与深孔板的深孔对应，以保证各微孔独立地与外界交换空气。培养基装液量为深孔板孔体积的5～30％。

所用的反应底物为4‐X‐3‐羟基丁酸乙酯，其中X为Cl、Br等，氰化钠，氰化钾，盐酸，硫酸，磷酸，氢氧化钠中的一种或几种。此处优选（S）‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯、氰化钠和磷酸。（S）‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯为反应底物1。

反应底物氰化钠用去离子水配成10%‐40%的氰化钠溶液，缓慢滴加磷酸至pH6.8。优选去离子水配成30%的氰化钠溶液，缓慢滴加磷酸至pH6.8，此为反应底物2。

初筛时底物1的浓度为10‐50mM，底物2中氰化钠的浓度为10‐80mM。

初筛所用的pH指示剂为溴百里酚蓝、溴甲酚紫、酚红、中性红、甲酚红的一种或几种组合。此处优选1.0g/l溴甲酚紫钠盐和1.0g/l的溴百里酚蓝钠盐水溶液的混合指示剂。

初筛时用的深孔板，反应装液量为深孔板的5～30％。深孔板放在离心管架中，于30～70℃、180～220rpm水浴振荡反应10‐30min，优选反应条件50℃、200rpm条件下反应。

初筛pH指示剂的加量为反应液体积的0.005%‐0.05%，优选加量为0.02%。

复筛时的反应容器为50ml、100ml的三口烧瓶，其中一个烧瓶口可插入pH电极在线监测pH的变化情况。

复筛得到的卤醇脱卤酶单菌落做催化反应测酶活，定时取样用乙酸乙酯萃取底物和产物，利用GC检测底物和产物的含量，从而计算出酶活值。

卤醇脱卤酶酶活的定义：在指定的温度和pH条件下，每分钟生成1μmol(R)‐4‐氰‐3‐羟基丁酸乙酯所需的酶量，为一个酶活单位(U)。

卤醇脱卤酶酶活的测定方法：取底物(S)‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯和氰化钠至反应体系浓度分别为30mM，溶于0.5M磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，水浴温度50℃，磁力搅拌，取稀释后的卤醇脱卤酶适量加入反应体系中，开始计时，20min后取样，用三倍体积的乙酸乙酯萃取，用GC测定转化率。

底物及产物的具体分析条件为：色谱柱为0.3mm毛细管柱30m(DIKMA)，FID检测器。色谱柱温度208℃，气化和检测温度均为230℃，载气流量20‐30ml/min，进样量0.3‐0.5μL，载气为N₂。

筛选效果的判断：

1.初筛：反应初时体系的颜色为蓝紫色，随着反应的进行，pH下降，体系的颜色由蓝紫变为紫色，后来变为黄色。筛选出比对照颜色变化快的卤醇脱卤酶单菌落。

2.复筛：在初筛的卤醇脱卤酶单菌落中，筛选出在开始后，单位时间pH变化量比对照快的。

测定酶活：在复筛的卤醇脱卤酶单菌落中，选取pH变化量最快的一组测定酶活值。

本发明具有积极的效果：（1）本发明使用深孔板进行微型化培养，实现了高通量培养和粗酶液的高通量制备；（2）本发明突破性的利用pH的变化来筛选高酶活的卤醇脱卤酶，效率高，成本低、速度快；消耗的培养基和试剂少；（3）本发明使得可机械化自动化操作以实现，借助自动化的高通量筛选仪器可以进一步大幅度降低劳动量，提高筛选通量。

具体实施方式

（实施例1）

1.卤醇脱卤酶的初筛

挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落（其中1号孔为原始对照），接种于装有0.6ml氨苄抗性液体培养基的48孔深孔板的孔中，每个孔的容积为4.6ml。盖上深孔板的三明治盖子，于37℃、200rpm摇床培养6h后，加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷），温度调整至30℃、200rpm摇床继续培养20h。

所用的培养基为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.2g/L，pH7.0、0.1MPa灭菌30min，待冷却至室温加氨苄至终浓度100μg/mL。

结束后把深孔板放入‐80℃超低温冰箱，待温度稳定后从超低温冰箱中拿出深孔板至室温融化，然后再按以上过程2遍冻融菌体细胞。将深孔板放置于孔板离心机，10000×g离心30min。深孔板的深孔中的上清液为粗酶液。粗酶液用生理盐水稀释10倍。去离子水用磷酸调pH至6.8备用。

取一个48孔深孔板，每个孔容积4.6ml，每个孔依次加入53mg反应底物11（S）‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯，4μL的反应底物2氰化钠，0.94ml pH6.8的去离子水，（S）‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯的浓度为10毫摩每升，氰化钠的浓度为15，0.2μL混合pH指示剂，盖上深孔板的三明治盖子，于50℃、200rpm水浴振荡30min，此时反应体系的颜色为蓝紫色。用8通道移液器吸取5μL的稀释酶液于对应编号的反应孔内，继续水浴振荡，开始计时，观察每个反应孔的颜色变化情况，选取比原始对照颜色变化快的，对应编号分别为7^#、23^#、26^#、39^#、43^#，对这几个编号对应的卤醇脱卤酶单菌落进行复筛。

2.卤醇脱卤酶的复筛

挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌对应编号为1^#、7^#、23^#、26^#、39^#、43^#，的单菌落（其中1号孔为原始对照），接种于装有3ml氨苄抗性液体培养基的15ml的离心管，于37℃、200rpm摇床培养6h后，加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷），温度调整至30℃、200rpm摇床继续培养20h。

所用的培养基为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.2g/L，pH7.0、0.1MPa灭菌30min，待冷却至室温加氨苄至终浓度100μg/mL。

结束后加入0.01%的溶菌酶，待细胞完全破碎后，置于冷冻离心机，4℃、10000×g离心30min。离心管上清液为粗酶液。粗酶液用生理盐水稀释10倍。去离子水用磷酸调pH至6.8备用。

取5个50ml的三口烧瓶，每个烧瓶依次加入530mg反应底物1，40μL的反应底物2，9.4ml pH6.8的去离子水，插入pH电极在线监测反应体系的pH，于50℃、200rpm磁力搅拌30min，此时调整每个反应体系的pH都为6.82。用移液器吸取50μL的稀释酶液于对应编号1^#、7^#、23^#、26^#、39^#、43^#的三口烧瓶内，继续磁力搅拌，开始计时，观察每个烧瓶5min反应体系pH的变化情况。

3.卤醇脱卤酶酶活的测定

挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌对应编号为1^#、26^#的单菌落（其中1号孔为原始对照），接种于装有25ml氨苄抗性液体培养基的250ml摇瓶中，于37℃、200rpm摇床培养6h后，加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷），温度调整至30℃、200rpm摇床继续培养20h。

所用的培养基为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.2g/L，pH7.0、0.1MPa灭菌30min，待冷却至室温加氨苄至终浓度100μg/mL。结束后离心收集菌体，加入4ml的pH7.00.1M的Tris‐HCl缓冲液，超声破碎，待细胞完全破碎后，置于冷冻离心机，4℃、10000×g离心30min。离心管上清液为粗酶液。粗酶液用生理盐水稀释10倍。

取2个50ml的三口烧瓶，每个烧瓶依次加入530mg反应底物1，40μL的反应底物2，9.4ml0.5M磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，水浴温度50℃，磁力搅拌，取稀释后的卤醇脱卤酶50μL加入反应体系中，开始计时，20min后取样，用三倍体积的乙酸乙酯萃取，用GC测定转化率。

底物及产物的具体分析条件为：色谱柱为0.3mm毛细管柱30m(DIKMA)，FID检测器。色谱柱温度208℃，气化和检测温度均为230℃，载气流量20‐30ml/min，进样量0.3‐0.5μL，载气为N₂。

通过以上检测结果，计算出1#原始对照的酶活为127U/ml，26#对应的酶活为410U/ml，筛选得到的卤醇脱卤酶单菌落酶活是原始对照的3.2倍。

复筛中在5min时体系的pH变化值：

编号	1＃	7＃	23＃	26＃	39＃	43＃
							pH变化值	0.12	0.17	0.23	0.37	0.2	0.24

（实施例2）

1、卤醇脱卤酶的初筛

挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落，接种于装有0.6ml氨苄抗性液体培养基的48孔深孔板的孔中，每个孔的容积为4.6ml。盖上深孔板的三明治盖子，于37℃、200rpm摇床培养6h后，加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷），温度调整至30℃、200rpm摇床继续培养20h。

所用的培养基为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.2g/L，pH7.0、0.1MPa灭菌30min，待冷却至室温加氨苄至终浓度100μg/mL。

结束后把深孔板放入‐80℃超低温冰箱，待温度稳定后从超低温冰箱中拿出深孔板至室温融化，然后再按以上过程2遍冻融菌体细胞。将深孔板放置于孔板离心机，10000×g离心30min。深孔板的深孔中的上清液为粗酶液。粗酶液用生理盐水稀释10倍。去离子水用磷酸调pH至6.8备用。

取一个48孔深孔板，每个孔容积4.6ml，每个孔依次加入53mg反应底物1（S）‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯，4μL的反应底物2氰化钠，（S）‐4‐氯‐3‐羟基丁酸乙酯的浓度为30毫摩每升，氰化钠的浓度为30毫摩每升，0.94ml pH6.8的去离子水，0.8μL混合pH指示剂，盖上深孔板的三明治盖子，于50℃、200rpm水浴振荡30min，此时反应体系的颜色为蓝紫色。用8通道移液器吸取5μL的稀释酶液于对应编号的反应孔内，继续水浴振荡，开始计时，观察每个反应孔的颜色变化情况，选取比原始对照颜色变化快的，对应编号分别为8^#、15^#、23^#、39^#、42^#，对这几个编号对应的突变体进行复筛。

2、卤醇脱卤酶的复筛

挑取含有卤醇脱卤酶突变体的基因工程菌对应编号为1^#、8^#、15^#、23^#、39^#、42^#，的单菌落（其中1号孔为原始对照），接种于装有3ml氨苄抗性液体培养基的15ml的离心管，于37℃、200rpm摇床培养6h后，加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷），温度调整至30℃、200rpm摇床继续培养20h。

所用的培养基为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.2g/L，pH7.0、0.1MPa灭菌30min，待冷却至室温加氨苄至终浓度100μg/mL。

结束后加入0.01%的溶菌酶，待细胞完全破碎后，置于冷冻离心机，4℃、10000×g离心30min。离心管上清液为粗酶液。粗酶液用生理盐水稀释10倍。去离子水用磷酸调pH至6.8备用。

取5个50ml的三口烧瓶，每个烧瓶依次加入530mg反应底物1，40μL的反应底物2，9.4ml pH6.8的去离子水，插入pH电极在线监测反应体系的pH，于50℃、200rpm磁力搅拌30min，此时调整每个反应体系的pH都为6.82。用移液器吸取50μL的稀释酶液于对应编号1^#、8^#、15^#、23^#、39^#、42^#的三口烧瓶内，继续磁力搅拌，开始计时，观察每个烧瓶5min反应体系pH的变化情况。

3、卤醇脱卤酶酶活的测定

挑取含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌对应编号为1^#、23^#的单菌落（其中1号孔为原始对照），接种于装有25ml氨苄抗性液体培养基的250ml摇瓶中，于37℃、200rpm摇床培养6h后，加入终浓度为1mM的IPTG（异丙基‐β‐D‐硫代吡喃半乳糖苷），温度调整至30℃、200rpm摇床继续培养20h。

所用的培养基为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、甘油10g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸镁0.2g/L，pH7.0、0.1MPa灭菌30min，待冷却至室温加氨苄至终浓度100μg/mL。结束后离心收集菌体，加入4ml的pH7.00.1M的Tris‐HCl缓冲液，超声破碎，待细胞完全破碎后，置于冷冻离心机，4℃、10000×g离心30min。离心管上清液为粗酶液。粗酶液用生理盐水稀释10倍。

取2个50ml的三口烧瓶，每个烧瓶依次加入530mg反应底物1，40μL的反应底物2，9.4ml0.5M磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，水浴温度50℃，磁力搅拌，取稀释后的卤醇脱卤酶50μL加入反应体系中，开始计时，20min后取样，用三倍体积的乙酸乙酯萃取，用GC测定转化率。

底物及产物的具体分析条件为：色谱柱为0.3mm毛细管柱30m(DIKMA)，FID检测器。色谱柱温度208℃，气化和检测温度均为230℃，载气流量20‐30ml/min，进样量0.3‐0.5μL，载气为N₂。

通过以上检测结果，计算出1#原始对照的酶活为127U/ml，23#卤醇脱卤酶单菌落对应的酶活为405U/ml，筛选得到卤醇脱卤酶单菌落酶活是原始对照的3.2倍。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种卤醇脱卤酶的快速筛选方法，其特征在于：用pH显色经过初筛和复筛两步法来筛选高酶活的卤醇脱卤酶，其包括如下步骤：

（1）将含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌的单菌落稀释后接种于装有液体培养基深孔板的多个孔中，在摇床中进行两次培养；

（2）将深孔板超低温冷冻然后室温融化，至少重复进行2次；

（3）将前述经过冻融的深孔板进行离心处理，取上清液为粗酶液；

（4）将粗酶液和含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌的单菌落分别加入不同个装有反应底物和去离子水及pH指示剂混合液的反应管中，将加入含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落的反应管作为参照管，在相同条件下反应，筛选出比参照管颜色变化快的卤醇脱卤酶单菌落，完成初筛；

（5）将初筛所得的卤醇脱卤酶单菌落对应的粗酶液分别加入不同个装有反应底物、去离子水混合液的反应管中，用pH计在线监测各管内体系的pH的变化，同样以含有卤醇脱卤酶基因的大肠杆菌单菌落反应管作为参照管，复筛出单位时间内pH变化量比参照管大的卤醇脱卤酶单菌落，即为高酶活的卤醇脱卤酶；

初筛和复筛的反应底物均为（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和氰化钠的混合物，（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的浓度为10-50毫摩每升，氰化钠的浓度为10-80毫摩每升；

初筛所用的pH指示剂为1.0g/l溴甲酚紫钠盐和1.0g/l的溴百里酚蓝钠盐水溶液的混合指示剂。

2.根据权利要求1所述的卤醇脱卤酶的快速筛选方法，其特征在于：初筛时pH指示剂的加入量为反应体系液体体积的0.005%-0.05%。

3.根据权利要求1所述的卤醇脱卤酶的快速筛选方法，其特征在于：初筛时pH指示剂的加入量为反应体系液体体积的0.02%。

4.根据权利要求1所述的卤醇脱卤酶的快速筛选方法，其特征在于：（S）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的浓度为30毫摩每升，氰化钠的浓度为30毫摩每升。